Cromatografia: Separação de Substâncias

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Cromatografia 
O objetivo da cromatografia é separar individualmente os diversos constituintes de uma mistura de substâncias seja para identificação, quantificação ou obtenção da substância pura para os mais diversos fins. Tal separação dá-se através da migração da amostra através de uma fase estacionária por intermédio de um fluido (fase móvel). Após a introdução da amostra no sistema cromatográfico, os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e viajam mais lentamente que a fase móvel devido ao efeito retardante da fase estacionária. O equilíbrio de distribuição determina a velocidade com a qual cada componente migra através do sistema.
DESCRIÇÃO GERAL DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (HPLC)
•A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica
preenchida com a fase estacionária (FE);
•Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes
da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo
com suas afinidades;
•As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as
substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente;
•Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal
elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.
HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente onde a cromatografia a gás não pode ser utilizada. Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas características, o campo de aplicação de HPLC é extremamente vasto.
COMPARATIVO HPLC / CG:
O cromatógrafo a líquido é constituído dos seguintes componentes:
1. Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel
2. Sistema de introdução de amostra
3. Sistema analítico: coluna cromatográfica e termostato
4. Sistema de detecção (um ou mais detectores)
5. Sistema de registro e tratamento de dados.
Fase móvel:
Pode ser armazenada em vidro, aço inox ou plásticos inertes. Seu volume depende da coluna usada ( coluna menor utiliza menos fase móvel).
Deve dissolver a amostra e não degradar a fase estacionária, baixa viscosidade e ser compatível ao detector ( o CAD por exemplo tem que usar tampão volátil na FM).
Eluição pode ser feita: Isocrática (Composição cte FM) Gradiente (Variação da FM
A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba, injetor e coluna, logo é necessário filtração antes de armazenar a fase móvel no reservatório.
A escolha do filtro é função da natureza da fase móvel. Usualmente utilizam-se membranas de nylon (0,20 e 0,45 m), celulose (0,22 m) ou TEFLON (1 e 1,5).
A fase móvel deve ser degaseificada para evitar a formação de bolhas no processo de separação o que pode interferir no desempenho da análise.
Sistema de bombas:
Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna
Alta reprodutibilidade e exatidão
Vazão constante independentemente da pressão
Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns
Opera a altas pressões (6000 psi)
Vazão constante é essencial para qualquer separação por HPLC. Alta pressão é necessária para impulsionar o solvente através da coluna cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela fase estacionária. Normalmente se utiliza bombas recíprocas com um ou preferencialmente dois pistões o que minimiza pulsação. Preferencialmente devem operar com programação de vazão e deve ser possível a interrupção do processo em pressões fora dos limites máximos e mínimos pré-estabelecidos.
BOMBEAMENTO ISOCRÁTICO OU POR GRADIENTE:
Bombeamento Isocrático:
A composição da fase móvel é mantida constante durante toda análise cromatográfica. Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o equipamento necessário para uma análise isocrática.
Bombeamento por gradiente:
Alguma análises necessitam alteração da composição da fase móvel, sem alteração da
vazão total, com a finalidade de diminuir tempo de análise e/ou melhorar a separação dos componentes da amostra. O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou a alta pressão. No caso de baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a seleção do solvente a ser utilizado dá-se através de válvula de multiplas vias controladas pelo software do sistema.
Sistema de injeção de amostras
Em HPLC, a injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de volumes que variam, em geral, de 5 a 20 ul. A amostra é introduzida na válvula com auxílio de uma microseringa com agulha sem ponta e a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição de carga para a posição de injeção.
 ps. Não se deve injetar um volume > 1% do volume da coluna vazia!!
Colunas cromatográficas
A separação é efetuada nas colunas cromatográficas, feitas em aço e resistentes a altas
pressões(até 500 atm). Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com granulometria de 3, 5, 7 ou 10 um (em alguns casos, até de 1 um) de diâmetro médio. Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são relativamente curtas e de paredes espessas.
COMPRIMENTO: 3 – 60 cm
DIÂMETRO INTERNO: 0,2 – 8 mm
• Como o tempo de retenção depende da temperatura, as colunas devem ser mantidas
termostatizadas em um forno onde pode-se selecionar a temperatura apropriada para a
separação.
• Para reduzir os custo dos solventes e aumentar sua eficiência, estão sendo introduzidas
colunas de diâmetro interno de 1 – 3 mm, de forma que possa operar-se com fluxos
menores o que resulta em diminuição substancial do custo de operação e aumento de
sensibilidade como ilustrado na figura abaixo.
PRÉ-COLUNAS (GUARD COLUMNS): SEMPRE USE PRÉ-COLUNAS PARA PROTEGER E AUMENTAR A VIDA DA COLUNA ANALÍTICA.
O uso de pré-colunas é de importância vital para a vida útil da coluna analítica. A filtração da fase móvel e da amostra nem sempre são suficientes para a eliminação de impurezas prejudiciais à coluna. Dependendo das características da fase estacionária e da natureza da amostra, pode acontecer o que se chama de “retenção irreversível”, ou seja, a afinidade do contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui, ficando retido nos primeiros centímetros do empacotamento. Retido na cabeça da coluna, o contaminate pode provocar perda da eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos. Com o uso da pré-coluna, o contaminante não atingirá a coluna analítica. Ao perceber os sintomas de contaminação (os mais comuns são aumento de pressão e elevação no nível de ruído), o analista substitui a pré-coluna, que em média custa 10 vezes menos que a coluna analítica.
Detectores
O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes características:
•Alta Sensibilidade
•Estabilidade: Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem alterar o sinal
•Reprodutibilidade
•Resposta Linear: A resposta do detector deve variar linearmente com a concentração do analito numa extensa faixa de concentração
•Resposta rápida aos analitos
•Não contribuir para o alargamento do pico
•Confiabilidade
•Facilidade de manuseio
•Não destrutivo: Condição necessária para cromatografia preparativa
•Seletividade: Habilidade relativa de um detector medir um composto e não outro.
• Podem apresentar resposta universal ou seletiva. 
• Componente + caro do sistema cromatográfico.
Aquisição de dados
Atualmente utilizam-se softwares que permitem:
•Processar os dados de cromatograma
•Armazenar e registrar
•Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente), vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna