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Biorreatores: Reatores Biológicos Adaptado da apresentação de: Angélica Barra &; Yuri Sarreta EEL/USP Classificação dos Biorreatores A classificação é feita quanto a: ü Tipo de biocatalisador ü Configuração do biocatalisador ü Forma de agitação do líquido no reator Classificação dos Biorreatores » O 7po de biocatalisador: Células ou Enzimas Levedura Bactéria Animal Vegetal Classificação quanto ao biocatalisador • Reatores Bioquímicos ou Enzimá7cos: são aqueles nos quais as reações ocorrem na ausência de células vivas. • Reatores Biológicos: são aqueles que operam na presença de células vivas. Dentre estes, os mais comuns e empregados são os que uElizam microrganismos. Estes biorreatores são uElizados desde a década de 1940 para produção de enzimas, anEbióEcos, vitaminas, etc. Classificação dos Biorreatores » A configuração do biocatalisador: Livres Imobilizadas Classificação dos Biorreatores » A forma de agitar o líquido no meio: Mecânica ou pneumá7ca Classificação dos Biorreatores ü Cerca de 90 % dos reatores utilizados industrialmente são do tipo reator de mistura STR (agitados mecanicamente). ü Há um grande interesse por outros tipos de reatores, mas a maioria dos processos ainda se encontra em escala de bancada ou semi-piloto Classificação Geral A classificação mais abrangente de biorreatores é a de KLEINSTREUER, que propõe umas classificação mista com base no Epo de biocatalisador empregado e na configuração deste (imobilizado, livre ou confinado entre membranas). Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Leito Fixo Leito Fluidizado Coluna de bolhas Air-li& Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Leito Fixo Leito Fluidizado Coluna de bolhas Air-li& 1. Células/enzimas livres: q Reatores agitados mecanicamente (STR: s7rred tank reactor): – Possuem chicanas (0,1D) , que evitam a formação de vórEce (turbulência) durante a agitação; – Devem possuir parâmetros ideais de geometria de construção para melhor eficiência, sendo comuns relações entre a altura (H) e o diâmetro (D) de 1:1, 2:1 ou 3:1. – Os agitadores possuem em sua exterminada turbinas, sendo estas de vários Epos, com diferentes caracterísEcas; – Devem possuir um sistema de controle de espuma. Normalmente se usa um quebra-espuma logo acima do líquido; Ø A agitação do meio é importante, pois proporciona maior aeração do meio e homogeneização do meio com o biocatalisador e também maior transferência de calor. No entanto, gera alta tensão de cisalhamento que pode ser prejudicial para o processo fermentaEvo, dependendo da sensibilidade do biocatalisador empregado. Reatores de Fase Aquosa (fermentação submersa) Reatores agitados mecanicamente (STR) Reatores agitados mecanicamente (STR) Turbina RUSHTON Turbina Paddle Agitador em âncora Agitadores de fluxo Radial Reatores agitados mecanicamente (STR) Agitadores de fluxo Axial Hélice marinha Hélice com fluxo duplo Hélice com grandes pás Agitador com fita helicóide Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Leito Fixo Leito Fluidizado Coluna de bolhas Air-li& – Não possuem agitador mecânico, a agitação do líquido é feita pelo borbulhamento de um gás (ar) no reator; – Possuem menor tensão de cisalhamento, deste modo, são mais vantajosos para o culEvo de células animais e vegetais; – Existem dois Epos: a) Coluna de bolhas b) Reatores air-liV Reatores agitados pneuma7camente A diferença básica entre o reator coluna de bolas e Air-Lift, é que este último tem movimentação cíclica do líquido (bem ordenado) e o primeiro apresenta movimentação aleatória. Reatores agitados pneuma7camente Reator coluna de bolhas Reatores air-liV – Têm-se um movimento aleatório do líquido; – Proporcionam excelente transferência de calor e de biomassa; – Exigem baixa manutenção e baixo custo de operação por não possuírem partes removíveis, serem compactos e de simples construção; – A durabilidade do biocatalisador neste reator é alta; – Possuem serpenEnas externas (jaquetas térmicas); – Apresenta uma redução no tempo de fermentação em relação ao STR (4 a 8h X 1 semana) Reatores coluna de bolhas (“Bubble column”) – Proporcionam uma movimentação cíclica do fluido bem definida, por meio de um cilindro central (tubo difusor) no qual entra ar pela sua base; – O tudo difusor aumenta a mistura axial no reator e distribui uniformemente as forças de cisalhamento pelo reator; – São de baixo custo por serem extremamente simples e terem menor consumo de energia; – São usados para fluidos menos viscosos e quando há necessidade de agitação leve e transferência de oxigênio a baixo custo; – Maior facilidade para ampliação de escala Reatores “air-liV” Dividido em 3 zonas disEntas: – Riser: região onde as bolhas de ar são liberadas com um fluxo ascendente. Podendo ser tanto dentro como fora do tubo difusor. – A ascensão das bolhas gera um fluxo descendente do líquido na região chamada downcomer. Essa circulação gerada é mais eficiente em misturar o líquido no reator quando comparado com a coluna de ar. – Zona de alívio: região no topo do reator, que reduz a espuma, aumenta o volume do reator, minimiza a circulação de bolhas pelo downcomer devido ao alongamento do topo do reator, que diminui a velocidade da bolha e a “reEra” do fluxo do líquido, prevenindo a entrada de 𝐶𝑂2 no downcomer. Reatores “air-liV” Downcomer Riser Zona de alívio Tubo Difusor Reatores “air-liV” Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Leito Fixo Leito Fluidizado Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Coluna de bolhas Air-li& – Inóculo e meio são misturados na entrada do sistema; – Há uma variação da concentração dos nutrientes e células ao longo do comprimento do reator. – São uElizados para reações rápidas, pois se tem um fluxo congnuo em um tempo curto dentro do reator; – São de fácil esterilizaçãoe manutenção; – Eficientes para processos em larga escala; – Porém, há uma maior dificuldade em se controlar a temperatura do reator Reatores de fluxo pistonado (“plug-flow”) Meio Inóculo Produto Reatores de fluxo pistonado (“plug-flow”) hhp://encyclopedia.che.engin.umich.edu/Pages/Reactors/PFR/PFR.html Ø Produção de algas: Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Leito Fixo Leito Fluidizado Coluna de bolhas Air-li& Células Imobilizadas em Suportes - Possuem como principal característica o uso de algum tipo de estrutura jsica de confinamento que obriga as células a permanecerem em uma região parEcular do biorreator. - Células não necessitam estar vivas: nesse caso uEliza-se apenas algumas enzimas presentes nas células e não há necessidade de coenzimas (NADH) . Entretanto, o sistema enzimáEco responsável pela conversão bioquímica desejada deve estar aEvo. - Células necessitam estar vivas: nesse caso é preciso manter a viabilidade celular pois os produtos a serem formados necessitam de múlEplas modificações, como a regeneração de coenzimas, presença de cadeia respiratória, vias metabólicas geradoras de intermediários, entre outros. Requisitos O processo de imobilização acontece quando é estabelecido o contato do material que é uElizado para a imobilização, também chamado de suporte, com as células que devem ser imobilizadas, sob condições ambientais controladas. Os suportes devem ser consEtuídos de um material que obedeça as seguintes caracterísEcas: 1. Não apresentar toxicidade para as células que serão imobilizadas. 2. Possuir alta capacidade de retenção. 3. Ser resistente ao ataque químico e microbiano. 4. Ser resistente ao estresse mecânico, como por exemplo as tensões de cisalhamento, compressão por peso ou eventuais pressões geradas por gases. 5. Apresentar alta difusividade de substratos e produtos. Materiais Polímeros Naturais Polímeros SintéEcos Materiais Inorgânicos Alginato Poliacrilamida Alumina K-Carragena Cloreto de Polivinila Sílica Ágar Polies7reno Zircônia Pec7na Poliuretano Vidro Dextrana Polie7leno Glicol Diatomita Colágeno Vermiculita Celulose Vantagens 1. Altas concentrações celulares no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento. 2. Provável obtenção de maiores fatores de conversão de substrato ao produto desejado. 3. Maior proteção ao sistema biológico em relação ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentrações de substratos, pH e cisalhamento. 4. Permite fermentação submersa para culEvo de células de mamífero que dependem de ancoragem. Adsorção Existem forças de atração entre a superjcie celular e a superjcie do suporte no método de adsorção, envolvendo alguns Epos de ligações. 1. Interações eletrostáEcas 2. Ligações iônicas 3. Ligações covalentes parciais Desvantagem: o meio de culEvo influencia drasEcamente na capacidade de retenção das células no suporte devido à fatores como pH e concentração iônica. Materiais inorgânicos e polímeros sintéEcos são mais uElizados e tem sido submeEdos à tratamentos superficiais visando a obtenção de estruturas macroporosas para aumentar capacidade de retenção do suporte. Ligação Covalente Suportes são especialmente funcionalizados para conter um grupamento químico responsável pela imobilização da célula ao suporte. São uElizadas esferas de vidro (100 a 500 µm) que primeiramente são tratadas com 𝛾-aminopropil-trietoxisilano (APTS) e em seguida o grupamento amina interage com o glutaraldeído, produzindo uma estrutura com um grupamento –HC=O altamente reaEvo. Carbonila do suporte liga-se com as aminas da parede celular, gerando interação. A técnica apresenta uma certa limitação devido ao fato de o glutaraldeído ser uma molécula tóxica, gerando potencial toxicidade ao sistema. Envolvimento Consiste no confinamento de uma população celular dentro de uma matriz polímérica formada por um gel hidrojlico de forma com que os poros dessa matriz são menores que as célula, exisEndo um certo fluxo de substratos para dentro da matriz e os produtos formados no interior se acumulam no meio de cultura. Inicialmente, prepara-se uma solução de 1 a 4% do polímero a ser uElizado em água e suspende-se nessa solução uma população celular previamente crescida. Então, inicia-se o gotejamento da solução em uma solução aquosa de CaCl2 ou KCl 0,05 a 0,5 M sob agitação até a formação de pargculas com diâmetro de 0,5 a 5 mm e densidade populacional de até cerca de 250 mg de biomassa seca por grama de matriz. Envolvimento Vantagens Mais uElizado devido à sua facilidade, baixíssima toxidez e alta capacidade de retenção celular. Desvantagens Limitação imposta pela difusão intraparEcular de substratos e produtos metabólicos. Uma possível alternaEva ao problema é oEmizar o tamanho da pargcula, a difusividade das espécies através da matriz polimérica e a concentração celular na pargcular para minimizar esses efeitos. Reatores com Leito Fixo O biocatalisador é imobilizado em um suporte inerte, que pode ser consEtuído de material polimérico alginato de cálcio, K-carragena, pecEna, cerâmica, entre outros e, através dele, o meio de fermentação é escoado. Vantagens: fácil recuperação do produto e altas produEvidades devido a uElização de elevadas concentrações celulares. Desvantagens: deficiência na transferência de 𝑂2 , homogeneização prejudicada, crescimento excessivo de biomassa celular dentro do leito fixo gerando bloqueio jsico do sistema e formação de caminhos preferenciais, queda da conversão do substrato em produto. Reatores com Leito Fluidizado ConsEtui-se de uma coluna verEcal de seção circular, dentro da qual as pargculas com as células imobilizadas são adicionadas até cerca de 70% do volume úEl do fermentador, sendo fluidizadas ou expandidas através de um dos seguintes mecanismos: Vantagens: bom sistema de homogeneização, baixas tensões de cisalhamento, fácil recuperação, melhor produEvidade, sem problemas de entupimento e fácil remoção dos gases. a) Reciclo parcial do efluente Reatores com Leito Fluidizado b) Gás inerte (N2 ou C02) ConsEtui-se de uma coluna verEcal de seção circular, dentro da qual as pargculas com as células imobilizadas são adicionadas até cerca de 70% do volume úEl do fermentador, sendo fluidizadas ou expandidas através de um dos seguintes mecanismos: Vantagens: bom sistema de homogeneização, baixas tensões de cisalhamento, fácil recuperação, melhor produEvidade, sem problemas de entupimento e fácil remoção dos gases. Reatores com Leito Fluidizado c) Agitação mecânica ConsEtui-se de uma coluna verEcal de seção circular, dentro da qual as pargculas com as células imobilizadas são adicionadas até cerca de 70% do volume úEl do fermentador, sendo fluidizadas ou expandidas através de um dos seguintes mecanismos: Vantagens: bom sistema de homogeneização, baixas tensões de cisalhamento, fácil recuperação, melhor produEvidade, sem problemas de entupimento e fácil remoção dos gases. Processos que uElizam células imobilizadas 1. A fermentação alcoólica congnua de carboidratos por leveduras tem sido, entre os sistemasimobilizados de células vivas, o mais estudado nos úlEmos anos. Kyowa Hakko desenvolveu um processo que uEliza levedura imobilizada em gel de alginato de cálcilo em reatores de leito fluidizado através do gotejamento da suspensão de levedura com alginato de sódio nos reatores que eram previamente preenchidos com cloreto de cálcio, obtendo produEvidades de 20 g de etanol/litro de reator e rendimento de 95%. 2. Síntese de anEbióEcos. Exemplo: produção de Thienamicina por células de Streptomyces cadleya imobilizada em pargculas de celite. 3. Tratamento de resíduos é visto como uma das áreas mais significaEvas de aplicação para os processos com células imobilizadas. Populações bacterianas formam um filme de biomassa sobre superjcies sólidas e realizam processos de nitrificação/denitrificação e produção de metano a parEr de resíduos. Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Leito Fixo Leito Fluidizado Coluna de bolhas Air-li& Os biorreatores de membrana mantém as células confinadas entre membranas semipermeáveis, que permitem o fluxo de líquido, mas não a passagem de células. Deste modo, permite uma separação entre fluxos de nutrientes e produtos que contribui para a simplificação das etapas de purificação do produto (processo downstream). As tensões de cisalhamento são mínimas, inferiores às de reatores air-liV, sendo indicados, portanto, para o culEvo de células animais muito sensíveis. Pode-se manter elevadas concentrações celulares nesses reatores devido aos menores obstáculos difusionais quando comparado com os reatores de células imobilizadas em suportes inertes. Ø Uma aplicação bem interessante desse Epo de biorreator é no tratamento de efluentes. Células/enzimas confinadas entre membranas Células/enzimas confinadas entre membranas a) Reator de membrana plana b) Reator de membrana oca – Suas membranas são consEtuídas de fibras celulares e filtros tubulares. O meio passa pelo interior dessas fibras, enquanto as células se fixam e crescem na superjcie externa; – São mais econômicos que os de placa plana; – São úteis para o culEvo de células de mamíferos que precisam se aderir à uma superjcies para se desenvolverem; – Possuem diversas aplicações, como produção de de proteínas anEcorpos monoclonais, produção recombinantes e produção de vírus; Reatores de membrana oca (“hollow-fiber”) Classificação Geral Reatores em fase aquosa (submersa) Reatores em fase não-aquosa (semissólida) Células/Enzimas Livres Células/Enzimas Imobilizadas Membranas planas Fibra oca Células/Enzimas Confinadas EstáEcos (Bandejas) Agitados (tambor rotaEvo) Leito Fixo Leito Fluidizado (gás-sólido) Biorreatores Agitados Mecanicamente Agitados PneumaEcamente Fluxo Pistonado Leito Fixo Leito Fluidizado Coluna de bolhas Air-li& Fermentação Semissólida Nesse Epo de fermentação, culEvam-se microrganismos sobre ou dentro de pargculas em uma matriz sólida chamada de substrato inerte (sabugo de milho ou bagaço de cana), onde o conteúdo de líquido chamado meio umidificante que está ligado à essa matriz possui um nível de aEvidade de água que é essencial para o metabolismo das células, mas não excede a capacidade máxima de ligação da água com a matriz. Microrganismos: fungos filamentosos pois crescem melhor em sistemas com baixos níveis de água. - Penicillium -> penicilina - Rhizopus -> produção de renina microbiana - Esporos de Bacillus thuringiensis para a produção de bioinseEcidas. Substratos Substratos podem ser na forma natural ou sintéEca (argila) Dois Epos de materiais insolúveis em água, sobre os quais os microrganismos vão crescer: 1. Quando o próprio suporte atua como fonte de nutrientes (mais uElizado) 2. Nutrientes solúveis em água e os microrganismos estão aderidos a uma matriz sólida que irá absorver o meio de cultura líquido. Pode-se incorporar solução nutriente ao substrato sólido visando adequá-lo melhor às condições nutricionais do microrganismo. Exemplo: produção de 𝛼-galactosidase por Aspergillus niger no qual ao meio composto de farelo de trigo foram adicionados uréia como fonte de nitrogênio, água de maceração de milho (como fonte de fatores de crescimento), farinha de soja (como indutores da enzima) e ácido cítrico (favorece produção da enzima). Caracterís7cas do substrato O substrato deve apresentar alta porosidade pois esse fator garante a absorção de nutrientes e facilita o transporte de enzimas e metabólitos por entre o meio e os microrganismos. Quanto menor o tamanho da pargcula, maior é a velocidade de fermentação. Entretanto, os processos precisam ter sua própria granulometria (estudo das dimensões de um grão) para permiEr a circulação de ar entre a massa e para dissipação de gases e de calor. Exemplos 1. Celulose, lignina e hemicelulose de biomassa vegetal para produção de compostos orgânicos. 2. Farelo e palha de trigo e bagaço de cana para produção de enzimas. 3. Bagaço de maçã e uva, melaço e cana-de-açúcar para produção de álcool. 4. Bagaço de cana, água de maceração de milho e sacarose para a produção de anEbióEcos. 5. Soja para produção de shoyu e elaboração de alimentos/condimentos orientais. Reatores Está7cos Reatores com bandejas: construídas em estruturas de alumínio ou outros materiais. Possuem uma grande área superficial de troca e uma capacidade de alocar meio de cultura muito maior. Podem ter o fundo subsEtuído por uma tela perfurada que aumenta eficiência na circulação de ar para o meio, e não somente na parte superior exposta. Precisam ter a temperatura e umidade controladas. Reatores com esteiras rolantes: etapas de inoculação e incubação do material esterilizado são realizadas em longas esteiras de fundo perfurado por onde circula ar úmido. Reatores com Agitação Tubular horizontal ou com tambores rotaEvos A rotação do reator pode ser realizada tanto por um eixo central como pela movimentação de roletes sobre os quais o fermentador esteja montado. Aeração da massa é realizada pela passagem de ar esterilizado, que também ajuda no controle da temperatura. Alto custo de implementação e dificuldades de ampliação de escala do proceso. Reatores com Agitação Reatores com leito fluidizado gás-sólido: promove a passagem de um gás inerte através de um leito de pargculas sólidas. A vazão do gás é elevada o suficiente para propiciar a suspensão dos sólidos na corrente gasosa, melhorando a transferência de massa (nutrientes, oxigênio) e auxiliando no controle da temperatura. GásGás Vantagens da fermentação sólida 1. Substrato relaEvamente simples reduz o custo de capital e o custo operacional. 2. UElização de fontes de carbono insolúveis que não são convencionais como resíduos agroindustriais 3. Menor risco de contaminação. 4. Falicidade de remoção do produto final 5. Ausência de atrito Desvantagens da fermentação sólida 1. Dificuldade em dissipar o calor produzido pelos gases gerados levará a uma elevação da temperatura em algumas regiões 2. Dificuldade no acompanhamento e controle de parâmetros como pH, umidade e aeração. 3. Dificuldade de homogeneização do meio gera uma natureza heterogênea do mesmo Referências • Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: EngenhariaBioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 8-13 , 16, 20 • SUBTIL, E. L.; et. al. - Biorreatores com Membranas Submersas (BRMs): alternaEva promissora para o tratamento de esgotos sanitários para reuso. Disponível em < hhp://www.scielo.br/pdf/ambiagua/v8n3/v8n3a11.pdf>. Acesso em 12 de abril de 2016. • Encyclopedia of chemical engineering equipment. Plug flow reactors. Disponível em < hhp://encyclopedia.che.engin.umich.edu/Pages/Reactors/PFR/PFR.html>. 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