Aula 2 Agronomia

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Técnicas de estudo em Biologia Celular e Molecular
BIOLOGIA GERAL
Prof: Msc. Karine Dias
Dianópolis – TO Agosto de 2014
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1663
Robert Hooke
1852
1750
1689
Marcello Malpighi
 Início (1600):
	- Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos;
	- Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização dos materiais biológicos
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 Fonte luminosa → luz branca
(lâmpada com filamento de tungstênio)
 Óptica → lentes
		ampliação 			condensação
 Mecânica
 Sistema de iluminação
Microscópio de luz
 comum / campo claro
Componentes:
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Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
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Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular
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Aumento final
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Técnicas para observação ao microscópio óptico
Lâmina;
Lamínula.
Observação vital- Exame a fresco.
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	Confecção de cortes para estudo nos microscópios óptico e eletrônico
Fixação e coloração das Células: muito utilizado para quando se quer observar estruturas minúsculas das células. Para isso, deve-se matar a célula e mergulhá-la em corantes específicos. 
Endurecer as células para que elas resistam melhor às etapas seguintes da técnica.Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes utilizados na microscopia óptica e aumentar o contraste na microscopia eletrônica.
FAA, Álcool, Glutaraldeído
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Inclusão e corte em micrótomo
Desidratação- álcool
Inclusão em parafina derretida
Cortes em micrótomo
Fixação na lâmina
Desparafinização – Coloração
Vedação dos cortes na lâmina com lamínula.
Observação em microscópio.
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Microscopia eletrônica
Possibilitou a visualização de estruturas celulares não visíveis ao microscópio óptico por contar com poder resolutivo muito maior.
No momento não se consegue aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscópios eletrônicos pela dificuldade em preservar as células e em obter cortes extremamente finos.
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Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e 
de Varredura (MEV)
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Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica 
Questões importantes: Ampliação e Resolução
Microscopia eletrônica
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Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
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Feixe de elétrons atravessa o material biológico e produz a imagem.
O feixe eletrônico é projetado no material biológico, no qual algumas estruturas permitem a passagem dos elétrons e outras não.
Após a passagem o feixe deixa de ser homogêneo e constitui uma imagem eletrônica das estruturas que atravessou.
Ela é ampliada e projetada em um monitor de vídeo ou chapa fotográfica, na qual é registrada.
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 Fixação (glutaraldeído)
 Desidratação
 Inclusão (resinas)
 Cortes 
 Contrastação com
metais pesados
Principais etapas da preparação das amostras para MET
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 Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc
 Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etc
Observação: 
 Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): 	 metais pesados
Imagem final ao MET
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Coloração negativa: vírus
Tecido muscular 
Hepátócito: Complexo de Golgi
Cílio
Células epiteliais
Microscopia Eletrônica de Transmissão
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 Revela feições topográficas da superfície (detalhes)
 Imagens tridimensionais:
			- Vermes
			- Insetos
			- Células livres (animais/vegetais)
			- Embriões
			- Fragmentos geológicos
 Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
Guelras de um peixe
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Preparação das amostras
 Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio)
 Desidratação
 Secagem (“ponto crítico”)
 Evaporação com ouro na
 superfície a ser analisada
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Microscópio de varredura
Um feixe de elétrons extremamente condensado passa sobre o material biológico fixado com uma finíssima película metálica;
Move-se o feixe para a frente e para trás, “varrendo” todo o objeto;
Durante a varredura, a superfície do material emite elétrons, que são capturados por um sensor.
A interpretação computadorizada permite compor imagens tridimensionais.
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
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Eletroforese em gel de Poliacrilamida
Determina o tamanho das moléculas proteicas
Dissolução de proteínas em solução de Sódio Dodecil Sulfonato – SDS – Detergente forte cujas moléculas são carregadas negativamente
Na presença de SDS, todas as moléculas proteicas se tornam também negativas, pois todas as cargas positivas foram neutralizadas.
A estrutura complexa das proteínas é destruída.
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Eletroforese em gel de Poliacrilamida
Colocando-se a mistura de proteínas no gel e submetendo-se este a um campo elétrico, todas as moléculas proteicas migrarão em direção ao polo positivo.
A velocidade da migração depende do tamanho da molécula
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Pólo -
Pólo +
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Centrifugação
Homogeneizado de células
Ruptura das membranas plasmáticas (Pistão)
Os constituintes são dispersos em meio líquido, geralmente sacarose, mantém a integridade dos componentes celulares e evita que as organelas aglutinem.
O isolamento depende do grau de sedimentação: tamanho, forma
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Centrifugação fracionada
Crescentes velocidades
As organelas maiores e mais densas sedimentam primeiro.
O sobrenadante de cada centrifugação é centrifugado novamente com maior velocidade.
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