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* Técnicas de estudo em Biologia Celular e Molecular BIOLOGIA GERAL Prof: Msc. Karine Dias Dianópolis – TO Agosto de 2014 * 1663 Robert Hooke 1852 1750 1689 Marcello Malpighi Início (1600): - Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos; - Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização dos materiais biológicos * Fonte luminosa → luz branca (lâmpada com filamento de tungstênio) Óptica → lentes ampliação condensação Mecânica Sistema de iluminação Microscópio de luz comum / campo claro Componentes: * Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho * Princípios da formação da imagem ao Microscópio Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular * Aumento final * Técnicas para observação ao microscópio óptico Lâmina; Lamínula. Observação vital- Exame a fresco. * Confecção de cortes para estudo nos microscópios óptico e eletrônico Fixação e coloração das Células: muito utilizado para quando se quer observar estruturas minúsculas das células. Para isso, deve-se matar a célula e mergulhá-la em corantes específicos. Endurecer as células para que elas resistam melhor às etapas seguintes da técnica.Aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes utilizados na microscopia óptica e aumentar o contraste na microscopia eletrônica. FAA, Álcool, Glutaraldeído * Inclusão e corte em micrótomo Desidratação- álcool Inclusão em parafina derretida Cortes em micrótomo Fixação na lâmina Desparafinização – Coloração Vedação dos cortes na lâmina com lamínula. Observação em microscópio. * * * * * Microscopia eletrônica Possibilitou a visualização de estruturas celulares não visíveis ao microscópio óptico por contar com poder resolutivo muito maior. No momento não se consegue aproveitar inteiramente a capacidade resolutiva dos melhores microscópios eletrônicos pela dificuldade em preservar as células e em obter cortes extremamente finos. * Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV) * Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica Questões importantes: Ampliação e Resolução Microscopia eletrônica * Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) * Feixe de elétrons atravessa o material biológico e produz a imagem. O feixe eletrônico é projetado no material biológico, no qual algumas estruturas permitem a passagem dos elétrons e outras não. Após a passagem o feixe deixa de ser homogêneo e constitui uma imagem eletrônica das estruturas que atravessou. Ela é ampliada e projetada em um monitor de vídeo ou chapa fotográfica, na qual é registrada. * Fixação (glutaraldeído) Desidratação Inclusão (resinas) Cortes Contrastação com metais pesados Principais etapas da preparação das amostras para MET * Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etc Observação: Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados Imagem final ao MET * Coloração negativa: vírus Tecido muscular Hepátócito: Complexo de Golgi Cílio Células epiteliais Microscopia Eletrônica de Transmissão * Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais: - Vermes - Insetos - Células livres (animais/vegetais) - Embriões - Fragmentos geológicos Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Scanning Electron Microscopy (SEM) Guelras de um peixe * Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Preparação das amostras Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio) Desidratação Secagem (“ponto crítico”) Evaporação com ouro na superfície a ser analisada * Microscópio de varredura Um feixe de elétrons extremamente condensado passa sobre o material biológico fixado com uma finíssima película metálica; Move-se o feixe para a frente e para trás, “varrendo” todo o objeto; Durante a varredura, a superfície do material emite elétrons, que são capturados por um sensor. A interpretação computadorizada permite compor imagens tridimensionais. * Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) * Eletroforese em gel de Poliacrilamida Determina o tamanho das moléculas proteicas Dissolução de proteínas em solução de Sódio Dodecil Sulfonato – SDS – Detergente forte cujas moléculas são carregadas negativamente Na presença de SDS, todas as moléculas proteicas se tornam também negativas, pois todas as cargas positivas foram neutralizadas. A estrutura complexa das proteínas é destruída. * Eletroforese em gel de Poliacrilamida Colocando-se a mistura de proteínas no gel e submetendo-se este a um campo elétrico, todas as moléculas proteicas migrarão em direção ao polo positivo. A velocidade da migração depende do tamanho da molécula * Pólo - Pólo + * Centrifugação Homogeneizado de células Ruptura das membranas plasmáticas (Pistão) Os constituintes são dispersos em meio líquido, geralmente sacarose, mantém a integridade dos componentes celulares e evita que as organelas aglutinem. O isolamento depende do grau de sedimentação: tamanho, forma * Centrifugação fracionada Crescentes velocidades As organelas maiores e mais densas sedimentam primeiro. O sobrenadante de cada centrifugação é centrifugado novamente com maior velocidade. * * *
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