ACONDICIONAMENTO DE SÊMEN CANINO PARA TRANSPORTE UTILIZANDO

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37Ciência Animal, 17(1):37-44,2007
ACONDICIONAMENTO DE SÊMEN CANINO PARA TRANSPORTE UTILIZANDO
DIFERENTES DILUENTES
(Packaging of canine semen for transport using different extenders)
Maykeline Valeska do NASCIMENTO, Antonio Cavalcante MOTA-FILHO
 & Alexandre Rodrigues SILVA*
Departamento de Ciências Animais, Universidade Federal Rural do Semi-Árido
RESUMO
Este trabalho objetivou determinar o período máximo de conservação do sêmen canino diluído em
Tris ou leite UHT desnatado armazenado em caixas de isopor de 3L, mimetizando as condições de
transporte. O sêmen de oito cães foi coletado por manipulação digital. A fração espermática foi
avaliada quanto ao volume, coloração, motilidade progressiva, morfologia espermática, integridade
acrossomal, função de membrana plasmática e concentração espermática. Em seguida, foi dividida
em duas alíquotas: a primeira foi diluída em Tris e a segunda em leite UHT desnatado. O sêmen foi
armazenado em caixas térmicas contendo gelo reciclável, fazendo-se novas avaliações microscópicas
às 12 h, 18 h, 24 h, 30 h e 36 h. No uso do leite UHT, a motilidade espermática progressiva (60,6 ±
15,0%) foi conservada de maneira aceitável até as 24 h. No uso do Tris, a motilidade espermática
(61,9 ± 15,1%) manteve-se dentro da faixa aceitável para realização de inseminações artificiais por
até 36 h. Não foram verificadas diferenças significativas entre os diluentes testados com relação à
conservação da morfologia espermática, integridade acrossomal e função da membrana plasmática
(P > 0,05). Em conclusão, o sêmen canino pode ser acondicionado para transporte em caixas de
isopor de 3L por até 24 h utilizando-se o diluente leite UHT ou por até 36 h no uso do diluente Tris,
ambos acrescidos de gema de ovo.
PALAVRAS-CHAVE: sêmen, cão, conservação, Tris, leite
ABSTRACT
This study aimed to determine the maximum time for conservation of canine semen extended in
Tris or UHT skim milk, stored in 3L styrofoam boxes for transport. Semen from eight dogs was
collected by digital manipulation. The sperm fraction was evaluated for volume, color, progressive
motility, sperm morphology, acrossomal integrity, plasmatic membrane function and sperm
concentration. Then it was divided in two aliquots: the first was diluted in Tris and the second in
UHT skim milk. The semen samples were stored in thermal boxes containing recyclable ice. New
microscopic evaluations were performed at 12 h, 18 h, 24 h, 30 h and 36 h. With the use of milk
extender, sperm motility (60.6 ± 15.0%) was acceptably conserved up to 24 h. With the use of Tris,
sperm motility (61.9 ± 15.1%) was in the acceptable range for artificial insemination, up to 36 h.
Significant differences were not found between the extenders regarding conservation of sperm
morphology, acrossomal integrity and plasmatic membrane function (P> 0.05). The conclusion is
that canine semen can be packaged for transport in 3L styrofoam boxes for up 24 h by using UHT
milk extender or for up 36 h with the use of Tris extender, both plus egg yolk.
KEY-WORDS: semen, dog, conservation, Tris, milk
Ciência Animal, 17(1):37-44,2007
*Endereço para correspondência:
DCAN/UFERSA, s/n, BR 110, Km 47, Costa e Silva,
59625-900, Mossoró – RN, Brasil
e-mail: legio2000@yahoo.com
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INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de protocolos de
preservação espermática que viabilizem o
transporte de sêmen dentro e entre países
desperta o interesse de médicos veterinários e
criadores de cães, visto que este procedimento
permite o intercâmbio de material genético entre
regiões distantes. HARROP (1956) foi o primeiro
a descrever a obtenção de crias viáveis a partir
de inseminação artificial após o transporte
intercontinental do sêmen canino refrigerado e
diluído em leite. Esta substância foi demonstrada
como um excelente diluente para a manutenção
da viabilidade do sêmen canino por curto período
em inúmeros estudos (GILL et al., 1970,
ENGLAND & PONZIO, 1996). Na atualidade,
entretanto, diluentes à base de Tris associados à
gema de ovo têm sido mais amplamente
utilizados com o propósito de conservar o sêmen
canino (TSUTSUI et al., 2003,
PONGLOWHAPAN et al., 2004, VERSTEGEN
et al., 2005, SHAHIDUZZAMAN & LINDE-
FORSBERG, 2007). Segundo ROMAGNOLI
(2002), a diluição do sêmen canino em uma
solução composta por leite desnatado adicionado
de 20% de gema de ovo permitiria sua
conservação por 24 a 36 h, por outro lado, a
diluição em Tris-gema conservaria o sêmen
canino por até 5 dias.
Na atualidade, o interesse pelo
aperfeiçoamento das técnicas de refrigeração do
sêmen de cães tem sido novamente despertado.
Devido à distância entre os laboratórios que
realizam a criopreservação de sêmen canino,
vários trabalhos têm mostrado a possibilidade
do acondicionamento do sêmen sob refrigeração,
visando seu transporte até o local de
processamento e posterior criopreservação
(CHIRINÉA et al., 2006; HERMANSSON &
LINDE-FORSBERG, 2006).
Apesar da maioria dos experimentos
sobre refrigeração do sêmen canino ser realizada
utilizando-se refrigeradores convencionais
(STRÖM-HOLST et al., 2000,
PONGLOWHAPAN et al., 2004, CARDOSO,
2006, SHAHIDUZZAMAN & LINDE-
FORSBERG, 2007), as caixas térmicas de isopor
(LINDE-FORSBERG, 2001, SILVA et al., 2004,
UCHOA et al., 2007) têm sido utilizadas como
uma alternativa viável e de baixo custo para a
conservação visando o transporte de sêmen. Em
eqüinos, um estudo recente procurou estabelecer
parâmetros seguros para o uso comercial deste
equipamento no acondicionamento e transporte
de sêmen (NUNES, 2007). Entretanto, em cães,
este uso tem sido realizado empiricamente, pois
estudos sistemáticos objetivando a determinação
do período máximo de conservação nesses
recipientes são praticamente inexistentes. Essa
informação permitiria uma programação
confiável para o envio de sêmen entre regiões
distantes, contribuindo para a redução de perdas
de qualidade do material.
O presente estudo objetivou determinar
o período máximo de conservação da viabilidade
in vitro do sêmen canino diluído em Tris ou leite
UHT desnatado armazenado em caixas de isopor
de 3L, mimetizando as condições de transporte.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais experimentais
Utilizaram-se ejaculados de 8 cães
adultos da raça American Pit Bull Terrier, com
idade variando de 12 a 24 meses, oriundos de
canis particulares localizados na cidade de
Mossoró-RN. Os animais foram alimentados
com ração comercial uma vez ao dia, tendo livre
acesso à água.
Coleta e avaliação de sêmen
Cada animal foi submetido a uma coleta
de sêmen por manipulação digital do bulbo
peniano, retendo-se a fração espermática para uso
no experimento. Após a coleta, foi feita a
avaliação do sêmen (JOHNSTON et al., 2001),
observando-se o volume e coloração da amostra.
A motilidade progressiva (%) foi avaliada por
microscopia de luz (400x). Apenas as amostras
que apresentaram motilidade progressiva > 80%
foram utilizadas no experimento. Um esfregaço
de sêmen foi confeccionado e corado com Rosa
de Bengala para avaliação das alterações
morfológicas e da integridade acrossomal, sendo
contadas 200 células sob microscopia de luz
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(1000x). A concentração espermática foi
determinada, utilizando-se um hemocitômetro.
Para avaliação da função de membrana
dos espermatozóides, uma alíquota de 10 µL de
sêmen foi incubada a 38°C em 90 µL de água
destilada (0mOsm/L). Após 30 minutos,
procedeu-se avaliação de 200 células por meio
da microscopia (400x). As células que
apresentavam resposta osmótica típica,
representada pelo encurvamento e edemaciação
da cauda, foram consideradas como portadoras
de uma membrana plasmática funcional
(QUINTELA et al., 2004).
Diluição do sêmen
Após análise inicial, a fração espermática
foi dividida em duas alíquotas, as quais foram
diluídas na proporção de uma parte de sêmen
para duas partes(1:2) de diluente. A primeira
alíquota foi diluída em uma solução constituída
por 3,028g de Tris-hidroximetil-aminometano,
1,78g de ácido cítrico mono-hidratado, e 1,25g
de frutose, diluídos em 100mL de água destilada.
O diluente foi acrescido de um teor de 20% de
gema de ovo (SILVA et al., 2002). A segunda
alíquota foi diluída em uma solução composta
por 2,4 mL de leite UHT desnatado (Betânia®),
acrescido de 0,6 mL de gema de ovo
(ROMAGNOLI, 2002). Cada diluente foi
adicionado de 1000 UI de penicilina/mL e 10 µg
de estreptomicina/mL de diluente.
Processamento do sêmen
As amostras diluídas em Tris ou leite
foram divididas em 5 alíquotas e agrupadas em
pares formados por uma amostra com cada
diluente. Cada par foi mantido em tubos plásticos
(1,5 mL))individuais revestidos por papel
alumínio, e acondicionados em caixa térmica de
isopor (3 L; 11 x 19 x 14cm), contendo 1L de
gelo reciclável (SILVA et al., 2004). Foram
utilizadas cinco caixas de isopor, enumeradas de
1 a 5. O par de alíquotas da caixa 1 foi analisado
12 h após o acondicionamento. Os pares
seguintes foram avaliados a cada 6 h, até
completar 36 h de conservação. A cada avaliação,
o sêmen refrigerado foi analisado quanto à
motilidade progressiva, morfologia espermática,
integridade acrossomal e resposta osmótica,
conforme citado para o sêmen fresco. A
temperatura interna das caixas foi mensurada
através de um termômetro digital (Digi09 –
Mercúrio®).
Análise estatística
Foram realizadas 8 repetições para cada
tratamento. Os resultados foram expressos como
média e desvio padrão. Os dados percentuais
foram submetidos à transformação em ArcoSeno
e expressos em graus. O efeito dos diluentes
sobre as características seminais microscópicas
foi verificado pela ANOVA, seguida do teste de
Tukey (P < 0,05). O efeito do tempo sobre as
características seminais foi verificado pela
ANOVA seguida do teste t de Student (P < 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A fração espermática dos ejaculados
apresentou coloração branco-opalescente,
volume de 1,2 ± 0,4 mL, com concentração de
576,4 ± 165,1 espermatozóides/mL. Foram
observados 98,5 ± 5,1% de espermatozóides com
movimento progressivo, sendo verificados 78,8
± 13,4% de espermatozóides morfologicamente
normais, com 99,6 ± 0,6% de integridade
acrossomal e 98,4 ± 0,6% de membranas
plasmáticas funcionais. Essas características
evidenciam que o sêmen fresco estava dentro da
normalidade para a espécie canina (JOHNSTON
et al., 2001).
A partir das 12h, a motilidade
espermática progressiva foi melhor conservada
no uso do diluente Tris em todos os momentos
de avaliação (Tab. 1). Um declínio gradativo da
motilidade foi verificado no uso do diluente Tris
a partir das 18h de conservação (P<0,05). No
uso do Leite UHT, observou-se redução
significativa da motilidade já a partir das 12h de
conservação (P<0,05). Este declínio
provavelmente deve-se ao consumo do substrato
energético e à produção de catabólitos oriundos
do metabolismo espermático (CARDOSO,
2006).
A motilidade é a manifestação da
competência estrutural e funcional da célula
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espermática (PEÑA-MARTINEZ, 2004).
Segundo CONCANNON & BATTISTA (1989),
o valor ideal mínimo para a realização de
inseminações artificiais é de 50% de
espermatozóides com motilidade progressiva.
Desse modo, no uso do leite UHT, a motilidade
(60,6 ± 15,0%) foi conservada de maneira
aceitável até as 24 h. No uso do diluente Tris, os
valores de motilidade (61,9 ± 15,1%)
mantiveram-se dentro da faixa aceitável até 36
h.
Segundo OETTLÉ (1993), a fertilidade
em cães só seria afetada caso amostras de sêmen
com menos de 60% de espermatozóides normais
fossem utilizadas em inseminações artificiais. No
experimento aqui tratado, observou-se que o
procedimento de conservação adotado foi
eficiente em preservar a morfologia espermática,
visto que em ambos os diluentes as alterações
nunca foram superiores a 30% (Tab. 2). As
principais alterações morfológicas espermáticas
observadas foram secundárias, provavelmente
originadas do choque térmico e dos
procedimentos de manipulação do sêmen
(SEAGER, 1986). Porém, é importante enfatizar
que a avaliação da morfologia espermática
através da microscopia de luz é limitada, e não
permite a visualização de danos na ultra-estrutura
espermática, sendo sugestivo o emprego de
outras técnicas como a microscopia eletrônica
(CHIRINÉA et al., 2006).
Espermatozóides que apresentem uma
motilidade de boa qualidade podem ser incapazes
de fertilizar um oócito caso apresentem danos
acrossomais (STRÖM-HOLST et al., 1997).
Neste trabalho, foi verificado que ambos os
Tabela 1. Motilidade espermática progressiva (%) no sêmen canino fresco e diluído em Tris
ou leite UHT, após conservação em caixas térmicas de isopor de 3L por até 36h.
Alterações 
Avaliações 
 
Diluentes 
 
Normais Primárias Secundárias Totais 
Sêmen fresco 78,8 ± 13,4 1,5 ± 1,1 19,7 ± 13,7 21,2 ± 13,4 
Tris 70,3 ± 9,9 1,0 ± 1,1 28,7 ± 10,4 29,7 ± 9,9 12h 
Leite UHT 75,0 ± 12,4 1,5 ± 2,1 23,5 ± 13,5 25,0 ± 12,4 
Tris 71,2 ± 14,2 0,8 ± 1,0 28,0 ± 13,9 28,8 ± 14,2 18h 
Leite UHT 72,8 ± 10,0 2,0 ± 1,9 25,5 ± 11,1 27,4 ± 10,4 
Tris 69,1 ± 8,1 2,9 ± 1,8 28,0 ± 8,8 30,9 ± 8,1 24h 
Leite UHT 76,0 ± 11,1 0,9 ± 2,1 22,7 ± 10,7 23,7 ± 11,0 
Tris 74,7 ± 11,9 1,3 ± 1,1 24,0 ± 11,9 25,3 ± 11,9 30h 
Leite UHT 78,3 ± 7,4 1,6 ± 2,0 20,1 ± 8,2 21,7 ± 7,4 
Tris 71,1 ± 10,8 1,8 ± 1,9 27,0 ± 11,4 28,9 ± 10,8 36h 
Leite UHT 76,5 ± 7,4 1,9 ± 1,7 21,7 ± 8,3 23,5 ± 7,4 
 Não foram evidenciadas diferenças entre grupos ou entre avaliações - P > 0,05.
Tabela 2. Morfologia espermática (%) no sêmen canino fresco e diluído em Tris ou leite UHT,
após conservação em caixas térmicas de isopor de 3L por até 36h
 Tris Leite UHT 
Sêmen fresco 98,5 ± 5,1A 
Sêmen diluído 97,9 ± 2,5aA 96,4 ± 2,0aA 
12h 94,4 ± 1,8aA 79,4 ± 17,2bB 
18h 85,6 ± 7,8 aB 67,5 ± 20,4 bC 
24h 80,6 ± 5,0aC 60,6 ± 15,0 aD 
30h 72,5 ± 10,7aD 47,5 ± 14,6bE 
36h 61,9 ± 15,1aD 26,3 ± 23,7bF 
 
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diluentes foram eficazes em conservar a
integridade acrossomal no decorrer de todos os
tempos de avaliação (Fig. 1).
A Fig. 2 mostra que os diluentes testados
foram similares na conservação da resposta
osmótica das células espermáticas no decorrer
das avaliações (P>0,05). Por outro lado, a função
das membranas espermáticas no uso dos dois
diluentes foi afetada pelo tempo de conservação
(P<0,05). A habilidade dos espermatozóides em
dobrar ou enrolar a região da cauda quando
submetido a um estresse hipo-osmótico, implica
na integridade funcional das membranas
espermáticas. Segundo INAMASSU et al.
(1999), a resposta osmótica das células
espermáticas é indicativa da integridade e da
função das membranas espermáticas, porém a
motilidade espermática depende não somente do
transporte de substâncias que atravessam as
membranas, mas também de um grande número
de outras funções bioquímicas, como o
metabolismo e a ação microtubular das fibras da
região da cauda dos espermatozóides.
A mensuração da temperatura interna das
caixas de isopor evidenciou um aumento
gradativo da mesma, tendo sido observados os
seguintes valores: 3,5 ± 1,8ºC imediatamente
após o fechamento das caixas, 8,1 ± 1,5ºC às
12h, 8,8 ± 1,1ºC às 18h, 12,1 ± 1,9ºC às 24h,
17,9 ± 3,4ºC às 30h, e 22,5 ± 3,0 às 36h. Estes
achados comprovam que a caixa térmica de
isopor de 3L não possibilita a manutenção de uma
temperatura interna constante, o que poderia
interferir negativamente com os resultados.
Segundo demonstrado por NUNES et al. (2007),
o uso de uma caixa térmica de maiores
dimensões (25,0 x 17,1 x 20,4 cm), contendo
uma maior quantidade de gelo biológico (2,5L),
permite a manutenção adequada da temperatura
(2,1ºC) por um período de até 24 h, conferindo
uma maior segurançaà preservação da qualidade
espermática.
A elevação da temperatura dentro da
caixa térmica poderia contribuir para a alteração
do pH do meio, podendo ser deletério à célula
espermática. Porém, o delineamento
experimental do presente trabalho não previu a
avaliação do pH e da osmolaridade dos meios
no decorrer da conservação. Em todo caso,
TSUTSUI et al. (2003) mostraram que em dois
dias, o pH e a osmolaridade do sêmen canino
diluído em Tris em condições de refrigeração
permanecem estáveis. Em adição, ROTA et al.
(1995) demonstraram que o pH altera-se apenas
a partir do segundo dia de conservação do sêmen
canino sob refrigeração em ambos os diluentes
Tris e leite, mas a osmolaridade no leite altera-
se significativamente já desde o primeiro dia.
É possível que uma alteração na
osmolaridade do leite possa ter contribuído de
maneira negativa na conservação do sêmen
canino após as 24 h neste estudo. Resultados
similares foram demonstrados por CARDOSO
et al. (2007) que conservaram o sêmen canino
95
97,5
100
Fresco 12h 18h 24h 30h 36h
T empos de avaliação
In
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gr
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ac
ro
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%
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Leite UHT
Figura 1. Integridade acrossomal (%) no sêmen canino diluído em Tris ou leite UHT, após conservação
em caixas térmicas de isopor com gelo reciclável por até 36h (P > 0,05).
42 Ciência Animal, 17(1):37-44,2007
diluído em leite-gema mantido sob refrigeração
a 5ºC por apenas 24h. Do mesmo modo, NUNES
et al. (2007) verificaram que o sêmen de eqüinos
pode ser também conservado por 24h em caixa
térmica de isopor no uso deste mesmo diluente.
MICHAJOLOV (1950) demonstrou que
o leite aquecido poderia ser utilizado como
diluente para sêmen, apresentando-se como um
líquido orgânico com importante propriedade
biológica para a conservação dos
espermatozóides, visto que apresenta capacidade
tampão e abundância de carboidratos, que seriam
utilizados pelos espermatozóides na produção de
energia. Acredita-se que a principal substância
do leite responsável pela preservação da célula
espermática seja a caseína, associada a um efeito
benéfico da lactose (BERGERON &
MANJUNATH, 2006). O uso do leite UHT
desnatado simplifica o processo de diluição do
sêmen do cão, pois além de sua ampla
disponibilidade comercial, não requer o
aquecimento prévio do leite, tendo sido
demonstrada sua eficiência na conservação do
sêmen de eqüinos (MEIRELLES et al., 1998),
bovinos e ovinos (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
Com relação à gema de ovo, esta tem sido
incorporada em diferentes soluções para a
conservação de sêmen por prevenir a ocorrência
de dano celular decorrente de choque térmico.
Seu princípio ativo foi demonstrado como uma
lipoproteína de baixa densidade (LDL), a qual
se especula que promova uma associação com a
membrana plasmática da célula, provendo-lhe
proteção e estabilidade (BERGERON &
MANJUNATH, 2006).
Resultados superiores ao leite foram
obtidos com o diluente à base de Tris acrescido
de gema de ovo, o qual foi eficiente na
manutenção da viabilidade espermática por até
36h. De fato, estudos recentes utilizando
equipamentos que mantêm a estabilidade térmica
por vários dias têm demonstrado que esse
diluente pode conservar a viabilidade do sêmen
canino por oito dias (PONGLOWHAPAN et al.,
2004), ou mesmo por até três semanas
(VERSTEGEN et al., 2005; HERMANSSON &
LINDE-FORSBERG, 2006).
A partir destes resultados, conclui-se que
o sêmen canino pode ser eficientemente
acondicionado para transporte em caixas de
isopor de 3L por até 24 h utilizando-se o diluente
leite UHT ou por até 36 h no uso do diluente
Tris, ambos acrescidos de gema de ovo.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Prof. Dr. Benito Soto Blanco,
por ter cedido as instalações do Laboratório Clínico do
Hospital Veterinário da UFERSA para a realização do
experimento.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
85
87,5
90
92,5
95
97,5
100
Fresco 12h 18h 24h 30h 36h
T empos de avaliação
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(%
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T ris
Leite UHT
(Sem diferenças entre diluentes - P > 0,05; ABC Diferenças significativas entre tempos – P < 0,05)
Figura 2. Resposta osmótica (%) das células espermáticas no sêmen canino diluído em Tris ou
Leite UHT, após conservação em caixas térmicas de isopor com gelo biológico por até 36h.
BERGERON, A.; MANJUNATH, P. New insights
towards understanding the mechanisms of sperm
protection by egg yolk and milk. Molecular
43Ciência Animal, 17(1):37-44,2007
Reproduction and Develoment, v. 73, p. 1388-1344,
2006.
CARDOSO, J.F.S. Uso do diluidor à base de água
de coco em pó (ACP-106®) para o resfriamento a
4ºC do sêmen canino. 68f. Dissertação (Mestrado
em Ciências Veterinárias) Universidade Estadual do
Ceará, Fortaleza, 2006.
CARDOSO, P.B.S.; CRUSCO, S.E.; RODRIGUES,
M.P.; NICHI, M.; GOES, P.A.A.; BARNABE, V.H.
Avaliação da viabilidade espermática in vitro do
sêmen canino no diluidor gema de ovo-leite
desnatado refrigerado a 5ºC por 48 horas. In: XVII
Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 2007,
Curitiba. Anais... Curitiba, 2007, Colégio Brasileiro
de Reprodução Animal, p.170.
CHIRINÉA, V.H.; MARTINS, M.I.M.; SOUZA, F.F.;
TEBET, J.M,; PAPA, F.O.; LOPES, M.D.
Características morfofuncionais do sêmen canino
refrigerado e congelado, usando dois diferentes meios
diluentes. Ciência Animal Brasileira, v.7, p.407-415,
2006.
CONCANNON, P.W., BATTISTA, M. Canine semen
freezing and artificial insemination. In: KIRK R.W.
(Ed), Current veterinary therapy, 1989. Philadelphia:
WB Saunders, 1989. p. 1247-1259.
ENGLAND, G. C. W.; PONZIO, P. Comparison of
the quality of frozen-thawed and cooled-rewarmed
dog semen. Theriogenology, v.46, p.165-171, 1996.
GILL, H.P.; KAUFMAN, C.F.; FOOTE, R.H.; KIRK,
R.W. Artificial insemination of Beagle bitches with
freshly collected, liquid stored and frozen-stored
semen. American Journal of Veterinary Research,
v.31, p.1807-1813, 1970.
HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. Reprodução Animal.
7ª ed. São Paulo: Manole, 2004. 513p.
HARROP, A.E. Artificial insemination in dogs – the
first transatlantic conception. British Veterinary
Journal, v.112, p.338-340, 1956.
HERMANSSON, U.; LINDE-FORSBERG, C.
Freezing of stored, chilled dog spermatozoa.
Theriogenology, v.65, p.584-593, 2006.
INAMASSU, A.; UECHI, E.; LOPES, M.D.
Viabilização do teste hipo-osmótico em cães e sua
relação com outras variáveis espermáticas. Revista
Brasileira de Reprodução Animal, v.23, p.302-304,
1999.
JOHNSTON, S. D.; KUSTRITZ, M. V. R.; OLSON,
P. N. S. Canine and feline theriogenology.
Philadelphia: W.B.Saunders, 2001. 592p.
LINDE-FORSBERG, C. Regulations and
recommendations for international shipment of
chilled and frozen canine semen. In: CONCANNON,
P.W., ENGLAND, G., VERSTEGEN, J., LINDE-
FORSBERG, C. Recent advances in Small Animal
Reproduction. New York: International Veterinary
Information Service, 2001. DOI: A1209.0501.
MICHAJOLOV, N.N. Milk as a semen diluent.
Journal of American Veterinary Medical Association,
v.117, p. 337, 1950.
MEIRELLES, L.S.; MALSCHITSKY, E.; NEVES,
A.P.; VIEIRA, M.J.; KELLER, A.; HOTT, A.K.;
MORAIS, I.M.A.; GARBADE, P.; GREGORY,
R.M.; MATTOS, R.M. Leite em pó desnatado não
inativado e leite desnatado UHT para a preservação
e fertilidade do sêmen eqüino resfriado. Ciência
Rural, v.28, p.467-470, 1998.
NUNES, D.B., ZORZATTO, J.R., COSTA E SILVA,
E.V., ZÚCCARI, C.E. Efficiency of short-term
storage of equine semen in a simple-design cooling
system. Animal Reproduction Science, v.104, p. 434-
439, 2008.
OETTLÉ, E.E. Sperm morphology and fertility in
the dog. Journal of Reproduction and Fertility, v. 47,
p.257-260, 1993.
PEÑA-MARTINEZ, I. Canine fresh and
cryopreserved semen evaluation. Animal
Reproduction Science, v.82- 83, p.209-224, 2004.
PONGLOWHAPAN, S.; ESSÉN-GUSTAVSSON,
B.; LINDE-FORSBERG, C. Influence of glucose and
frutose in the extenderduring long-term storage of
chilled canine semen. Theriogenology, v.62, p.1498-
1517, 2004.
QUINTELA, A.T.; GUSMÃO, A.L.; LOPES, M.D.;
SILVA, J.C.; ALVARENGA, M.A., RESENDE, J.;
MENEZES, M.; PORTELA, A.P.; ALMEIDA, A.K.
Hyposmotic test with distillated water to evaluate
sperm plasma membrane integrity of dog semen –
preliminary data. In: 15th International Congress of
Animal Reproduction, 2004. Porto Seguro. Anais…
Porto Seguro, 2004. Colégio Brasileiro de
Reprodução Animal, p.518.
ROMAGNOLI, S. Canine artificial insemination
with fresh, refrigerated and frozen semen. In:
Veterinary Sciences Congress, 2002, Oeiras. Anais…
Oeiras, 2002, Sociedade Portuguesa de Ciências
Veterinárias, p.167-170.
ROTA, A., STROM, B., LINDE-FORSBERG, C.
Effects of seminal plasma and three extenders on
canine semen stored at 4ºC. Theriogenology, v.44,
p.885-900, 1995.
SEAGER, S.W.J. Artificial insemination in dogs. In:
BURKE, T.J. (Ed). Small Animal Reproduction and
Infertility: A Clinical Approach to Diagnosis and
Treatment. Philadelphia: Lea & Febiger, 1986, p.
44 Ciência Animal, 17(1):37-44,2007
207-217.
SHAHIDUZZAMAN, A.K.; LINDE-FORSBERG,
C. Induced immotility during long term storage at
+5ºC degrees C does not prolong survival of dog
spermatozoa. Theriogenology, v. 68, p. 920-933,
2007.
SILVA, A. R.; CARDOSO, R.C.S.; UCHOA, D.C.;
SILVA, L.D.M. Effect of Tris-buffer, egg yolk and
glycerol on canine semen freezing. The Veterinary
Journal, v.164, p.244-246, 2002.
SILVA, A. R.; SATZINGER, S.; LEITE, L. G.;
SILVA L. D. M. Gestação obtida por inseminação
artificial com sêmen canino refrigerado transportado
à distância – relato de caso. Clínica Veterinária, n.
50, p. 56-66, 2004.
STRÖM, B.; ROTA, A.; LINDE-FORSBERG, C.
In vitro characteristics of canine spermatozoa
subjected to two methods of cryopreservation.
Theriogenology. v. 48, p. 247-256, 1997.
STRÖM-HOLST, B., LARSSON, B., LINDE-
FORSBERG, C., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H.
Evaluation of chilled and frozen-thawed canine
spermatozoa using a zona pellucida binding assay.
Journal of Reproduction and Fertility, v.119, p.201-
206, 2000.
TSUTSUI, T.; TEZUKA, T.; MIKASA, Y.;
SUGISAWA, H.; KIRIHARA, N.; HORI, T.;
KAWAKAMI, E. Artificial insemination with
canine semen stored at a low temperature. Journal
of Veterinary Medical Science, v.65, p.307-312,
2003.
UCHOA, D.C.; SATZINGER, S.; AMARAL, M.C.;
SILVA, L.D.M. O uso de diferentes diluidotes para
inseminação artificial com sêmen canino
refrigerado. In: XVII Congresso Brasileiro de
Reprodução Animal, 2007, Curitiba. Anais...
Curitiba, 2007, Colégio Brasileiro de Reprodução
Animal, p.182.
VERSTEGEN, J.P.; ONCLIN, K.; IGUER-
OUADA, M. Long-term motility and fertility
conservation of chilled canine semen using egg-yolk
added Tris-glucose extender: in vitro and in vivo
studies. Theriogenology, v.64, p.720-733, 2005.
Recebido em:20.06.07 Aceito em:21.07.07