Produção de biomassa. labenge

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Universidade Federal do Paraná
Setor de Tecnologia
Departamento de Engenharia Química
TQ-046 Laboratório de Engenharia Química II
ProfaDrª Michele Rigon Spier
AMANDA CHAVES DE OLIVEIRA 
ARTHUR SCHAITZA
GABRIELLE OTTO SANT’ANA
HÉRCULES PLESTCH
MARCOS ALBUQUERQUE LEONARDI
MARCOS VINÍCIUS PEREIRA DA COSTA
PRODUÇÃO DE BIOMASSA
CURITIBA
 2018
SIMBOLOGIA
DMSO = dimetil sulfóxido
T = temperatura do ambiente;
td = tempo de duplicação ou tempo de geração;
Yx/s = fator de conversão de substrato em biomassa;
μmáx = velocidade específica máxima de crescimento;
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores encontrados na literatura para parâmetros referentes à fermentação alcoólica da levedura Saccharomyces cerevisiae.
Tabela 2 – Valores referentes ao tempo de duplicação para diferentes concentrações de DMSO.
Tabela 3 – Valores referentes ao tempo de duplicação para diferentes temperaturas.
Tabela 4 – condições iniciais do cultivo analisado.
Tabela 5 – Dados obtidos para diferentes amostras em diferentes momentos do cultivo. 
Tabela 6 – Dados calculados para a concentração celular a partir da absorbância.
Tabela 7 – Parâmetros cinéticos do cultivo analisado.
Tabela 8 – Contagem de células em câmara hemtimétrica.
Tabela 9 – Número médio de células em cada quadrículo.
Tabela 10 – Comparativo entre o a concentração obtida por métodos diferentes.
LISTA DE FIGIURAS
Figura 1 – Representação gráfica do aumento de biomassa ao longo do tempo.
Figura 2 – Representação gráfica do consumo de substrato ao longo do tempo.
Figura 3 – Representação gráfica da conversão de substrato em biomassa.
Figura 4 – Variação do pH ao longo do tempo.
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO
Os processos biológicos têm se mostrado uma maneira eficiente de se produzir determinados nichos de produtos em pequena e larga escala. Isso se deve aos estudos biotecnológicos que permitiram um adequado controle do processo de replicação celular, e da formação de seus subprodutos, bem como do metabolismo celular, pelo ajuste das condições do ambiente de cultura (temperatura, pressão, composição do substrato, pH, nível de aeração).
Dentre os microorganismos utilizados para a bioprodução destacam-se as bactérias e os fungos. Dentro deste segundo grupo, além dos famosos cogumelos que podem ser diretamente consumidos como alimento, as leveduras tem importante papel. Uma das mais utilizadas em nível industrial é a Saccharomyces Cerevisiae, a qual é utilizada em processos fermentativos, como na produção de pães e cervejas.
Os processos fermentativos são de grande importância para a produção de alimentos (bebidas alcoolicas, queijos, iogurtes, manteigas), bem como na produção de medicamentos, como os antibióticos, e até na produção de enzimas. Nesta via metabólica, fermentação, as células, em meio anaeróbio, transformam monossacarídeos (carboidratos simples) em etanol e gás carbônico (fermentação alcoólica), ou formam ácido lático e demais compostos orgânicos em menor quantidade (fermentação lática) juntamente com energia, utilizada pela célula para a manutenção de seu metabolismo.
Para processos industriais são utilizados biorreatores, que compreendem uma gama de operações, tais como: a preparação do susbtrato, preparo do meio de propagação das células microbianas, controle da transformação do substrato em produtos, e finalmente, a separação das células do produto final.
No presente trabalho será analisada uma cultura da levedura Saccharomyces Cerevisiae com o uso de diversos testes para o cálculo de parâmetros que caraterizam a produção de biomassa. Este estudo é interessante como forma preliminar de se preparar um inóculo de biomassa para a injeção deste em um biorreator, de modo a produzir de maneira controlada algum produto final de interesse, como a cerveja, por exemplo.
2. OBJETIVOS
Dentre os objetivos dessa prática tem-se, principalmente, a introdução de conceitos da Engenharia Bioquímica e sua aplicação experimental a partir da produção em escala laboratorial de biomassa através do cultivo em meio líquido da levedura Sacharomycescerevisiae. 
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
São eles:
a) Utilização de um microorganismo aeróbio (levedura) para o preparo de inóculo para processamento industrial;
b) Preparo do meio de cultivo para crescimento da linhagem microbiana necessária para a formação da biomassa;
c) Monitoramento do crescimento microbiano por microscopia óptica;
d) Identificação das fases de crescimento;
e) Monitoramento dos parâmetros de cultivo, tais como: Biomassa (X); Substrato (S); pH; Aeração forçada;
f) Obtenção de dados, cálculo e análise para determinação dos parâmetros cinéticos do bioprocesso: μmax, td, YX/S
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
	3.1 	Processos Fermentativos
Com o constante avanço tecnológico da biotecnologia, atualmente, cada vez mais produtos das indústrias química, farmacêutica e alimentícia se baseiam em processos biológicos, como a fermentação, na produção em larga escala de seus materiais. Existem dois metabolismos possíveis para a fabricação destes produtos: metabolismo primário (ex: etanol) ou secundário (ex: antibióticos). 
Para otimizar e aprimorar a produção de enzimas, existem vários estudos sobre processos fermentativos(PESSOA-JÚNIOR etal.,1996). Mas, a real aplicação industrial de qualquer enzima só é viável se as condições utilizadas no processo fermentativo forem favoráveis e se a enzima produzida em larga escala apresentar os mesmos níveis de atividade e produtividade obtidos em escala laboratorial(TONG, INLOES, 1990).
A ampliação da produção para larga escala necessita de algumas condições como primeiramente definir o microrganismo a ser utilizado, o meio de cultivo e as condições de agitação e aeração mais adequadas ao processo. (TONG, INLOES, 1990). 
Por usar material vivo, os processos fermentativos necessitam de um sistema de controle muito mais rigoroso e complexo. Diversas variáveis devem ser controladas neste tipo de processo, porém podemos destacar como as mais relevantes: a temperatura, a concentração de substrato, pH, agitação e aeração. Isso porque, essas variáveis impactam o estado do organismo vivo, além de influenciarem a velocidade do processo (MIGUEL, 2006). 
Existem principalmente duas formas de conduzir um processo de fermentação que seriam por processos descontínuos ou descontínuo˗alimentados (WARD, 1991; BORZANI, 2001). 
	3.2 	Saccharomycescerevisiae
Destaca-se como a espécie mais explorada comercialmente entre as leveduras e apresenta grande emprego no Brasil, notadamente, na indústria de produção de etanol. Esta é uma dentre as 14 espécies do gênero Saccharomyces, descoberta há maisde 150 anos, sendo responsável pela produção de etanol através da fermentaçãono Brasil (TONIATO, 2013).
O uso de Saccharomysescerevisiaecomo uma fonte na obtenção de enzimas mostra-se uma alternativa viável e bem prática devido à grande manipulação desta cepa em plantas industriais (SILVA et al., 2001). Esta levedura consta de células pequenas, ovais e apresenta uma reprodução vegetativa por brotamento (BYERS, 1981). 
Vários são os fatores que influenciam o cultivo de Saccharomysescerevisiae. O crescimento celular depende de fatores como temperatura, pH, componentes do meio de cultura e disponibilidade de oxigênio para a célula (SILVA et al., 2001). 
	3.3 	Influência de temperatura
As temperaturas ótimas de trabalho com leveduras encontram-se entre 25 e 35°C. Essa faixa se deve a diversos motivos, dentre eles pode-se destacar o fato de que para temperaturas em demasiado altas ocorre a inibição da síntese de ácidos graxos e esteróis (STARR, 1962), além de que, por mais que temperaturas mais elevadas façam com que as reações se processem com uma maior velocidade, estas maiores temperaturas também oferecem risco de desnaturação de enzimas (MIGUEL, 2006). 
	3.4 	Influência
do pH
A influência do pH tem especial importância quando se leva em conta a especificidade de cada cepa de leveduras, de forma que o cultivo de cada uma se dá de forma ótima em uma faixa específica de pH, além disso, enzimas submetidas a valores extremos de pH (ácidos ou básicos) correm o risco de desnaturação (HALL, 1996) 
	3.5 	Influência do meio de cultura
A função do meio de cultura é fornecer os nutrientes necessários à reprodução da população de leveduras. Desta forma, é de extrema importância que este meio forneça substrato suficiente, normalmente sob a forma de carbono e nitrogênio (MIGUEL, 2006). A seleção da fonte de carbono é de especial cuidado no processo, visto que diversos açúcares causam intensa repressão catabólica da síntese de várias enzimas, podendo reduzir assim a velocidade de crescimento da população (LILLY, 1979). 
	
	3.6 	Influência da agitação e aeração
A multiplicação da população da levedura depende consideravelmente da concentração de oxigênio disponível. Para que ocorra a oxidação de um mol de glicose são necessários seis mols de oxigênio. Desta forma, torna-se evidente a importância dos mecanismos de aeração e agitação do meio (MIGUEL, 2006). 
	3.7 	Parâmetros cinéticos
Em processos biotecnológicos comerciais, os fatores microbiológicos com grande 	influência 	no 	processo 	são: 	coeficientes 	de conversãosubstrato/produto; velocidade de crescimento celular ou formação de produto; tempo de duplicação de células (HAMER, 1985). 
Desta forma, a velocidade específica máxima de crescimento (μmáx), conversão do substrato em biomassa (Yx/s) e tempo de geração tg, foram usados para avaliar a cinética de reprodução das células estudadas. 
Abaixo na tabela 1 estão compilado os valores encontrados na literatura para os parâmetros cinéticos.
Tabela 1 – Valores encontrados na literatura para parâmetros referentes à fermentação alcoólica da levedura Saccharomyces cerevisiae.
	Autores
	μmáx (h-1)
	Yx/s
	T (°C)
	Aiba & Shoda (1969)
	0,43
	---
	30
	Bazua & Wilke (1977)
	0,448
	---
	30
	Ghose & Tyagi (1979)
	0,40
	0,09
	30
	H. Dominguez, M. J. Núnez, R. Chamy, J. M. Lema (1993)
	0,19
	0,28
	30
	Jarzebski et al. (1989)
	0,24
	0,13
	30
	Maiorella, Blanch & Wilke (1984)
	0,461
	0,11
	---
	Pratima Bajpai & Argyrios Margaratis (1987)
	0,35
0,35
	0,043
0,043
	30
35
Segundo reportado por Pavlak M. C. M. (2011) o meio de cultivo utilizado reativar as leveduras foi Ágar Saboraud-glicose com a seguinte composição: 2% de glicose, 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura, 1,8% de ágar.
	Santos J. R. A. et al. (2010) como meio de cultura o GLP, contendo glicose (20 g/L), extrato de levedura (5 g/L), peptona (3 g/L), e Agar (1,5 % P/V).
Tabela 2 – Valores referentes ao tempo de duplicação para diferentes concentrações de DMSO.
	DMSO (%)
	
	Controle (0%)
	0,03%
	0,07%
	0,3%
	0,7%
	1%
	3%
	td (h)
	2,165
	2,223
	2,225
	2,223
	2,282
	2,320
	2,810
Fonte: Leite J. E. C. (2010).
Tabela 3 – Valores referentes ao tempo de duplicação para diferentes temperaturas.
	Temperatura (°C)
	20
	24
	27
	30
	36
	38
	40
	td (h)
	5
	3,5
	3,0
	2,2
	2,1
	---
	4,0
Fonte: USP, Baptista A. S. (2010).
4. MATERIAIS E MÉTODOS	
4.1. Cultivo do meio
Em um Erlenmeyer previamente limpo e seco foram adicionados 200ml de solução e feito o cultivo aeróbio da levedura com temperatura e vazão de entrada e saída dos gases controladada . Na entrada dos é colocado um filtro (tamanho de poros igual a 45 µmetros) a fim de reter qualquer impureza proveniente do ar assim como qualquer outro microrganismo que poderia vir a contaminar o cultivo. Os frascos foram autoclavados a 121ºC por 15 minutos e preenchidos com meio de cultura imersos em um banho termotizado. 
4.2. Análises
Primeiro, avaliou-se o teor de sólidos solúveis utilizando um refratômetro de mão. Em seguida, foi feita a análise do valor da absorbância em 660 nm. A contagem de células é feita em uma câmara de Neubauer. A última análise realizada o pH de cada amostra.
4.2.1. Teor de sólidos solúveis 
Foram adicionadas duas gotas de cada amostra no refratômetro e leu-se o valor em º Brix de sólidos solúveis. Esses valores foram transformados para g/L e assumiu-se que todos os sólidos solúveis eram os açucares dissolvidos, afinal esses foram os únicos sólidos solúveis que foram acrescentados ao sistema.
4.2.2. Determinação de biomassa por medida indireta 
Diluiu-se as amostras, e mediu-se a absorbância em 660 nm num espectrofotômetro, então utilizou-se a reta de calibração para transformar o valor da absorbância em concentração celular (cél/mL). 
4.2.3. Contagem das células em câmara hematimétrica
Uma alíquota de 0,1mL foram transferidas para a câmara de Neubauer coberta com uma lamínula. A contagem foi feita em um microscópio ótico, em 5 quadrículos e contou-se as células que estavam dentro desses e nas bordas direitas e superiores. 
O resultado foi obtido pela equação 1: 
(1)
Em que: 
 - fator de diluição;
 - é o número de células por mL de solução;
 - é o número de esporos contados,;
- o número de quadrículos contados e Vq o volume do quadrículo (4x10-6mL). 
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
	As condições físico-químicas do cultivo de S. cerevisiae estudado se encontram na tabela 4.
Tabela 4 – condições iniciais do cultivo analisado.
	Meio de Cultivo (mL)
	Sacarose
(g/L)
	Extrato de Levedura (g/L)
	Inóculo inicial (g/L)
	pH inicial
	Temperatura (°C)
	200
	60
	2,5
	≈0,33
	4,0 – 5,0
	28
	Os resultados obtidos durante referentes à análise dos parâmetros de interesse serão compilados na tabela 5.
	
Tabela 5 – Dados obtidos para diferentes amostras em diferentes momentos do cultivo. 
	Amostra
	Tempo de cultivo (h)
	Concentração de Substrato (°Brix)
	Absorbância
A 660 nm
	Diluição
	pH
	1
	0
	6
	0,092
	1:7
	4,65
	2
	4
	5,8
	0,19
	1:7
	4,54
	3
	19
	3,2
	0,503
	1:7
	4,5
	4
	22
	3
	0,536
	1:7
	4,47
	5
	25
	2,2
	0,796
	1:7
	4,31
	6
	43
	1,2
	0,747
	1:7
	4,26
	7
	46
	1
	0,735
	1:7
	4,19
	8
	49
	0,8
	0,714
	1:9
	4,18
	9
	67
	0,4
	0,825
	1:9
	4,18
	10
	70
	---
	0,696
	1:9
	4,18
	Utilizando a equação da reta, equação 2, para a determinação da concentração celular fornecida é possível obter a concentração de células por mL da amostra.
	Onde y é o logaritmo na base 10 do número de células por mililitro e x é a absorbância obtida para o comprimento de onda de 660 nm. A partir do número de células e considerando a massa de uma célula como sendo de 48,4 pg obtém-se a concentração mássica de biomassa presente em cada amostra, permitindo verificar a evolução deste parâmetro ao longo do tempo. Os dados de concentração mássica ao longo do tempo estão na tabela 6.
Tabela 6 – Dados calculados para a concentração celular a partir da absorbância.
	Amostra
	Tempo de cultivo (h)
	Log da concentração mássica celular
	Concentração mássica celular
(g/L)
	Concentração de substrato (g/L)
	1
	0
	-0,630122219
	0,23435692
	60
	2
	4
	-0,34307401
	0,453864265
	58
	3
	19
	0,042263452
	1,102207728
	32
	4
	22
	0,067414163
	1,167922871
	30
	5
	25
	0,22393922
	1,674708482
	22
	6
	43
	0,198792463
	1,580492584
	12
	7
	46
	0,192382606
	1,557337014
	10
	8
	49
	0,290053808
	1,950086196
	8
	9
	67
	0,347247076
	2,224575121
	4
	10
	70
	0,279947727
	1,905231386
	0
	A representação gráfica dos dados da tabela 6 facilita a visualização do comportamento do cultivo ao longo do tempo. A figura 1 compreende o gráfico do log da concentração mássica celular pelo tempo.
Figura 1 – Representação gráfica do aumento de biomassa ao longo do tempo.
	
	A figura 2 compreende o consumo de substrato durante o período em questão.
Figura 2 – Representação gráfica do consumo de substrato ao longo do tempo.
	Nos dois gráficos é perceptível
dois comportamentos distintos dos dados plotados, até 25 h de cultivo há um crescimento da biomassa de maneira acentuada, bem como um grande consumo de substrato. Isto apresenta grande similaridade com o que se espera na fase log, a partir deste ponto há uma estabilização do aumento da biomassa, e uma redução na taxa de consumo de substrato. Depreende-se então que a partir deste ponto o cultivo entra na fase estacionária. Como durante o período de 72 horas foram preparadas 10 amostras distintas, e os intervalos entre cada coleta não é constante devido à impossibilidade técnica de coletá-las no período da madrugada sendo coletados durante o período de atividade do laboratório, cria-se discrepância ao se tentar obter linhas de tendência. Isto se deve ao fato de que variações inerentes decorrentes da incerteza dos equipamentos e instrumentos e da precisão humana são amplificados em intervalos, entre a coleta das amostras, maiores e não totalmente uniformes. Posto isto se percebe o comportamento geral do cultivo, e o relaciona com a teoria estabelecida a respeito do fenômeno observado.
	A fase log não foi observada considerando os primeiros pontos das curvas das figuras 1 e 2. Como o intervalo de tempo entre as duas primeiras amostras é de 4 horas pode-se concluir que a fase lag teve uma breve duração, não percebida pelo intervalo adotado, ainda é possível teorizar que o inóculo se ambientou rapidamente ao meio de cultivo.
	Para futuros experimentos, sugere-se alterar o regime de coleta das amostras, aumentando o número de coletas, principalmente nos períodos onde se verificou que há uma transição do comportamento para uma determinação mais precisa das fases de crescimento da levedura.
	A velocidade máxima específica, o tempo de duplicação e o fator de conversão de substrato e biomassa são expostos na tabela 7
Tabela 7 – Parâmetros cinéticos do cultivo analisado.
	μmáx (h-1)
	td (h)
	Yx/s
	0,15
	4,75
	0,026
 
	A velocidade específica máxima obtida se apresentou abaixo dos valores observados na literatura, apresentando uma maior semelhança com os dados obtidos por Dominguez H. et al. apresentado na tabela 1, contudo deve-se ressaltar que todos os resultados apresentados na tabela 1 ocorreram em uma temperatura levemente superior aquela que o cultivo estudado foi submetido. O tempo de duplicação também foi superior aos apresentados nas tabelas 2 e 3. Mas novamente as condições não eram as mesmas. Quando comparado às informações fornecidas pela orientadora da prática, que o tempo de duplicação estaria entre 2 e 3h, há também uma significativa discrepância. O fator de conversão de substrato em biomassa ficou abaixo dos dados compilados na tabela 01, sendo mais próximos mas ainda abaixo daqueles obtidos por Ghose & Thyagi, que também utilizaram em seus experimentos uma temperatura de 2°C acima daquela em que o cultivo estudado foi submetido. Um aspecto importante que deve ser ressaltado é que algumas análises foram realizadas por diferentes membros da equipe, que implica em um aumento significativo nos erros, e análises como a determinação da concentração de substrato tendem a apresentar grandes desvios já que dependem da interpretação do observador quanto ao valor aferido.
	A figura 3 apresenta no mesmo gráfico a evolução da concentração de biomassa e de substrato ao longo do tempo.
Figura 3 – Representação gráfica da conversão de substrato em biomassa.
	Na figura 3 fica evidente que grande parte da massa de substrato é utilizada pela levedura para processos metabólicos como a duplicação celular e outros mecanismos indispensáveis a vida como a transcrição e tradução gênica, etc. Tais processos metabólicos geram resíduos, como o CO2, de modo que as condições do cultivo como o pH variam ao longo do tempo. Este comportamento foi apresentado na tabela 5, mas para uma melhor visualização será também exibido na figura 4.
Figura 4 – Variação do pH ao longo do tempo.
	A acidificação do meio se deve a combinação do CO2 produzido pelas células com a H2O, formando ácido carbônico. Com o aumento da concentração de H+ na suspensão há uma diminuição do potencial hidrogeniônico.
	 A concentração celular também foi obtida, para um determinado tempo, pelo método da contagem de células em câmara hematimétrica. A tabela 8 compila os dados refrentes a este método.
Tabela 8 – Contagem de células em câmara hemtimétrica.
	Amostra
	Fator de diluição
	N° de quadrículos contados
	N° total de células
	N° médio de células por quadrículo
	Conc. Celular (cél/mL)
	6
	9
	5
	225
	45
	4,9 10-3
 
	A tabela 9 mostra a contagem referente a cada quadrículo.
Tabela 9 – Número médio de células em cada quadrículo.
	N° do quadrículo
	N° de células contada
	1
	41
	2
	52
	3
	44
	4
	38
	5
	50
	
Através da equação 02 e usando a massa de cada célula foi obtida uma concentração mássica de biomassa para a amostra 6, 43 horas, de 4,9 (g/L). Este valor foi superior ao valor calculado utilizando uma medida indireta. A tabela 10 mostra estes dois valores.
Tabela 10 – Comparativo entre o a concentração obtida por métodos diferentes.
	Concentração mássica através da contagem de células (g/L)
	4,9
	Concentração mássica calculada (g/L)
	1,58
	Ambos os valores estão na mesma ordem de grandeza, o que sugere que a metodologia empregada no cálculo foi adequada. A diferença numérica já era esperada e isto se deve a vários fatores como a validade da linearização empregada para a determinação da concentração celular através da absorbância, erros em cascata ocorridos pela linearização destes valores e na obtenção da equação da reta para a fase log além de erros experimentais na aferição da concentração de substrato, nas diluições realizadas no laboratório e também como já citado anteriormente devido ao fato de ser um experimento com fins didáticos as medidas foram realizadas por diferentes membros do grupo e que cria mais um fator de geração de erros randômicos.
 
6. CONCLUSÃO
Na prática, foi possível obter conhecimento específico sobre a produção de biomassa, de suma importância para diversos processos de alto valor agregado e que pouco são pouco abordados na graduação. Somado a isso, desenvolveu-se a capacidade de analisar parâmetros cinéticos e correlacioná-los ao crescimento da biomassa.
A velocidade específica máxima obtida se apresentou abaixo dos valores observados na literatura, apresentando uma maior semelhança com os dados obtidos por Dominguez H. et al. O tempo de duplicação foi superior aos apresentados na literatura entretanto, as condições do experimento não eram idênticas . Já o fator de conversão de substrato em biomassa ficou próximo, mas ainda abaixo, daqueles obtidos por Ghose & Thyagi, 
Deve ser pontuado que algumas análises foram realizadas por diferentes membros da equipe, o que resulta em um aumento significativo nos erros de análises, como a determinação da concentração de substrato o qual depende diretamente interpretação do analista.
7. REFERÊNCIAS
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Microorganismos na fermentação alcólica – Leveduras e Bactérias. Disponível:https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3504007/mod_resource/content/1/aula%2010%2031-10-2017.pdf. Acesso em 24/03/2018.
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