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Genética Molecular

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DNA e estrutura molecular dos cromossomos
O material genético deve replicar-se, controlar o crescimento e o desenvolvimento do organismo e permitir que o organismo se adapte a mudanças no ambiente.
1865- Mendel- genes transmitem a informação genética- HEREDITARIEDADE “Genética clássica”
Papel do Material genético:
- Genotípica: Replicação, o material genético deve estocar informação genética e transmitir com precisão para a prole, de geração para geração.
- Fenotípica: Expressão gênica, o material genético deve controlar o desenvolvimento do fenótipo do organismo. Zigoto -> Adulto
- Evolutiva: Mutações, o material genético deve sofrer mudanças para produzir variações que permitem aos organismos adaptar-se a modificações no ambiente de modo que ocorra a evolução.
1868- Miescher – “Nucleína” substância rica em N e P ( Descobriu que o DNA está dentro do núcleo da célula).
Outros estudos genéticos estabeleceram uma CORRELAÇÃO entre padrões de transmissão dos genes e o comportamento dos cromossomos durante a reprodução sexual, dando fortes evidências de que os gênes geralmente estão situados em cromossomos.
Os cromossomos são compostos de PROTEÍNAS e ÁCIDOS NUCLEICOS-Desoxirribonucleico (DNA) e Ribonucleico (RNA). 
A INFORMAÇÃO GENÉTICA é ESTOCADA em ÁCIDOS NUCLEICOS e não em proteínas. Na maioria dos organismos, a informação genética é codificada na estrutura do DNA. Entretanto em alguns vírus pequenos , a informação genética é codificada no RNA.
Evidências de que o DNA é o material genético:
- Localização: Maior parte do DNA das células está situada nos cromossomos, enquanto RNA e proteínas são também abundantes no citoplasma.
- Correlação: Entre a quantidade de DNA por célula e o número de conjuntos de cromossomos por célula. Céls somáticas 2n contém duas vezes mais quant. de DNA das céls geminativas (gametas) da mesma espécie.
- Composição: DNA a mesma em todas as céluas de um organismo, enquanto RNA e proteínas é altamente variável de um tipo de célula para outra.
- Estabilidade: o DNA é mais estável qe o RNA ou as proteínas.
Estrutura dos ácidos nucleicos: DNA e RNA
São macromoléculas compostas por subunidades repetidas chamadas de NUCLEOTÍDEOS.
Cada nucleotídeo é composto por um GRUPO FOSFATO, um açúcar com cinco carbonos PENTOSE e uma BASE NITROGENADA que é rica em nitrogênio.
DNA: açúcar 2-desoxirribose (ácido desoxirribonucleico), é chamado assim pois no carbono 2’ apresenta ausência de Oxigênio.
RNA: açúcar Ribose (ácido ribonucleico)
Bases Nitrogenadas: No DNA: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. No RNA são as mesmas só muda a Timina pela Uracila.
Purinas: Adenina e Guanina (bases com dois aneis)
Pirimidinas: Citosina, Timina e Uracila (bases com um só anel)
O RNA é MAIS REATIVO que o DNA devido o oxigênio no carbono 2’ e é diferente em relação a pentose.
1953- Watson e Crick: deduziram a estrutura da molécula de DNA.
Evidências:
- Chargaff et al.: Descobriram que a concentração de Timina era sempre igual à concentração de Adenina e a concentração de Citosina era sempre igual à de Guanina. Notando que existia alguma inter-relação fixa. Os dados também mostraram que a concentração total de pirimidinas era igual a concentração total de púricas.
- Difração de raios X: quando os raios x passam pelas fibras de moléculas purificadas, eles são desviados pelos átomos das moléculas de modo específicos, chamados padrões de difração, que dão informações sobre a organização dos componentes das moléculas. Watson e Crick usaram os dados de Franklin que indicaram que o DNA era uma estrutura bifilamentar altamente ordenada com subestruturas repetidas espaçadas a cada 0,34 nanômetro ao longo do eixo da molécula.
Conclusões de Watson e Crick:
DNA: dupla hélice
Cadeias polinucleotídicas helicoidizadas uma ao redor da outra;
A helicoidização cria sulcos (maior, menor): posiciona em forma diferente a hélice quando gira. A diferença entre o sulco maior e o menor é importante quando se examinam as interações do DNA com proteínas que regulam a expressão gênica. Algumas proteínas ligam-se ao sulco maior e outras no menor.
Rotação para a direita, com 10 pares de bases por giro;
Cada cadeia polinucleotídica consiste em uma sequência de nucleotídios ligados por uniões fosfodiester;
Adenina- Timina (duas pontes de hidrogênio) e Citosina- Guanina (três pontes de hidrogênio);
Complementares: Os dois filamentos de uma dupla hélice de DNA são complementares. (a complementariedade dos dois filamentos da dupla hélice, torna o DNA adequado para estocar e transmitir informação genética de geração a geração).
Antiparalelas: um filamento vai de 3’- 5’ e a fita complementar vai de 5’-3’. Essa polaridade oposta dos filamentos complementares de uma dupla hélice de DNA tem um papel importante em replicação, transcrição e recombinação do DNA;
Formas: A (encontrada em altas concentrações de sais, a fita gira para a direita, 11PN/ D:2,3 nm) B (baixas concentrações de sais, a fita gira para a direita, 10PN/ D:1,9 nm) e Z (gira a fita para a esquerda, 12PN/ D:1,8 nm). Em condições fisiológicas é encontrada a forma B, quando tem alguma alteração é a forma A e Z.
Interações: Ligações covalentes, Interações hidrofóbicas (é onde tem vários compostos que são impermeáveis a água entre as bases nitrogenadas), Pontes de hidrogênio (entre os pares de bases, ligação fraca), Ligação fosfodiester ( liga um nucleotídeo ao outro para formar a fita, é uma ligação forte).
Estrutura do DNA: Super hélices negativas 
Super-hélices são introduzidas em uma molécula de DNA quando um filamento ou ambos são cortados e quando os filamentos complementares de uma ponta são girados ou torcidos ao redor um do outro com a outra ponta fixa no espaço e portanto não podendo girar.
Super- helicoidização negativa (esquerda): A fita de DNA gira para a direita, com a super-helicoidização negativa gira ao contrário (para a esquerda) fazendo com que a molécula de DNA dobre, assim diminui os giros para a direita.
Cromossomo Procarioto:
São Monoplóides (apenas um conjunto de genes é estocado em um só cromossomo). O DNA forma alças com o RNA (40 a 50 alças). Na super-helicoidização o DNA faz a alça independentemente, não precisa do RNA.
Cromossomo Eucarioto:
A maioria dos eucariontes são diplóides Homo sapiens (2n-46 cromossomos), cada cromossomo contém uma molécula de DNA.
Há diferenças na compactação do DNA entre as fases do ciclo celular. 
Cromatina: Consiste primariamente em DNA e PROTEÍNAS com menos quantidades de RNA. As proteínas são de duas classes principais: Proteínas básicas (de carga positiva em pH neutro) HISTONAS e um grupo heterogênio de proteínas ácidas (carga negativa em pH neutro) NÃO-HISTONAS.
As histonas têm um importante papel estrutural na cromatina, estão presentes em quantidades equivalentes de DNA. Consiste em 5 classes: H1, H2a, H2b, H3 e H4. Estão presentes em quase todos os tipos de células. Nos espermatozóides são substituídas por protaminas.
Os cinco tipos de histonas estão presentes em proporções molares de aproximadamente: 1H1, 2H2a, 2H2b, 2H3, 2H4. Quatro desses 5 tipos estão associadas ao DNA para produzir as subunidades da cromatina NUCLEOSSOMOS.
1º Nível de condensação: A cromatina visualizada em microscopia eletrônica mostra uma série de contas elípticas unidas por um filamento. Essas contas são os nucleossomos que são envoltos por um segmento de DNA. Essa estrutura formada pelo nucleossomo (duas moléculas de cada histona: H2a, H2b, H3, H4- octâmero) e o DNA (146 pares de nucleotídeos) é resistente a nuclease e é chamado de cerne do nucleossomo. As histonas protegem o segmento de DNA no cerne do nucleossomo de clivagem por endonucleases.
A subunidade completa de cromatina consiste: no cerne do nucleossomo, no DNA ligador e nas proteínas não-histônicas associadas, todos estabilizados pela ligação de uma molécula de histona H1 com o exterior da estrutura.
A histona H1 se junta ao cerne do nucleossomo e puxa mais DNA totalizando 166 pares de nucleotídeos.
Os cromossomos metafásicossão os mais condensados dos cromossomos eucarióticos normais.
2º Nível de condensação: envolve um dobramento adicional ou super-hélice da fibra de nucleossomo de 10 nm, para produzir a fibra de cromatina de 30 nm característica dos cromossomos mitóticos e meióticos. A histona H1 está envolvida nesta super-helicoidização da fibra de 10 nm do nucleossomo para produzir a fibra de cromatina de 30 nm. Os nucleossomos se agrupam em 6 e vão se encaixando uma na outra se empilhando formando uma fibra, aumenta o diâmetro e diminui a extensão.
3º Nível de condensação:As proteínas não histônicas formam um arcabouço que está envolvido na condensação da fibra de cromatina de 30 nm nos cromossomos metafásicos muito compactados. Este terceiro nível de condensação parece envolver a separação de segmentos das moléculas gigantes de DNA presentes em cromossomos eucarióticos em domínios super-helicoidizados independentemente, ou alças. A fibra se liga ao arcabouço formando alças, esse arcabouço circula para ficar mais compacto. O scafold se circulariza e fica mais compacto formando o cromossomo.
Centrômero: o centrômero de um cromossomo metafásico pode ser reconhecido como uma região de constrição, onde o cromossomo não parece ter-se duplicado. Possui 3 regiões principais: I e III são pequenas sequências limites conservadas e a região II é um segmento central rico em A – T. A função do centrômero é de unir as cromátides irmãs.
Telômero: 3 funções: 
Prevenir a fusão dos cromossomos
Impedir a degradação pelas exonucleases
Facilitar a replicação sem perder material genético
Os telômeros de cromossomos eucarióticos possuem sequências únicas de nucleotídeos repetidas em tandem TTAGG.
- Grampo: bases de Hoogesten: quatro grupos guaninas formam um tipo de ponte de hidrogênio pareando e dando estabilidade para a ponta do cromossomo.
- Alças em t: POT-1: protege da degradação o filamento na ponta 3’ que invade uma repetição telomérica. TFR-2: Evita a fusão ponta a ponta do cromossomo. TFR-1.
Sequências Repetidas de DNA
Os cromossomos dos procariontes contêm quase que exclusivamente moléculas de DNA com sequências únicas de pares de bases (não repetidas), isto é, cada gene está presente apenas uma vez no genoma. Se as moléculas de DNA em cromossomos procariotos são quebradas em vários segmentos pequenos, cada fragmento conterá uma sequência diferente de pares de bases. Os cromossomos eucariontes são mais complexos. Algumas sequências de bases são repetidas muitas vezes no complemento cromossômico haplóide, essas sequências são chamadas de DNA repetitivo, representa um componente principal do genoma eucariótico.
As sequências de DNA presentes em eucariontes são comumentes agrupadas em 3 classe:
Sequências únicas de DNA: 1 a 10 cópias por genoma.
Sequências de DNA moderadamente repetitivas: 10 a 105 cópias do genoma.
Sequências de DNA altamente repetitivas: mais de 105 cópias do genoma
Replicação do DNA
Características da replicação:
- Conservativa
- Semi-conservativa
- Dispersiva
(1958) Meselson e Stehl: usaram isótopo pesado de nitrogênio 15N em lugar do nitrogênio leve normal 14N, para aumentar a densidade do DNA e então estudaram as mudanças na densidade durante replicação por centrifugação de gradiente de densidade. Foi mostrado que a replicação do DNA ocorre semiconservativamente em vários outros microrganismos.
(1957) Taylor: desmonstrou primeiro a replicação dos cromossomos eucarióticos semiconservativa. Ele marcou os cromossomos de Vicia faba cultivando as pontas de raízes por 8h em meio contendo 3H-timidina radioativa. As pontas da raiz foram removidas do meio radioativo, lavadas e transferidos para um meio contendo colchicina (liga-se a microtúbulos e impede a formação de fibras funcionais do fuso), os cromossomos não sofrem separação anafásica normal e duplica o número no núcleo a cada ciclo celular.
Distrubuição da radioatividade por auto-radiografia: ambas as cromátides de cada par foram similarmente marcadas na primeira c-metáfase. Na segunda c-metáfase, apenas uma das cromátide de cada par era radioativa. Estes são exatamente os resultados esperados se a replicação do DNA for semiconservativa, havendo uma molécula de DNA por cromossomo.
Replicação Semi-conservativa
(1963) Cairns: A replicação semiconservativa do cromossomos de E. coli começava em um sítio específico (ORIGEM) e continuava sequencialmente e bidirecionalmente ao redor da estrutura circular.
Nos cromossomos bacterianos e virais, geralmente há uma única origem que controla a replicação (um REPLICON). Nos cromossomos eucariontes várias origens controlam coletivamente a replicação do DNA (ocorrem em lugares específicos, cada origem controla a replicação de uma unidade de DNA, vários replicons).
Origem de replicação Ori-C: 245 pares de nucleotídeos, duas sequências repetidas conservadas diferentes. Uma sequência de 13pb está presente como três repetições em tandem (ricas em A-T, facilitando a formação de uma região localizada de separação de filamentos (bolha de replicação). Sequência de 9pb repetidas quatro vezes intercaladas com outras sequências.
Replicação do DNA “in vitro” 
Procarioto
Velocidade da síntese: adição de 30.000 nucleotídedos por minuto
Sentido da Síntese: Essa adição tem sentido 5’- 3’.
A Precisão é muito grande, de acrescentar nucleotídeos com pouco erro. A cada 1 bilhão de nucleotídeos adicionados 1 erro.
DNA-Polimerase
São 3 tipos:
DNA Pol I: atividade polimerase no sentido 5’- 3’ e exonuclease nos sentidos 5’- 3 e 3’- 5’.
DNA Pol II: atividade polimerase no sentido 5’- 3’ e exonuclease no sentido 3’- 5’.
DAN Pol III: atividade Polimerase no sentido 5’- 3’ e exonuclease no sentido 3’- 5’.
Exonuclease: capacidade de clivar a ligação fosfodiester e para agir precisa ter uma extremidade livre. Retira os nucleotídeos errados e repara o erro.
Processividade: Capacidade da enzima de ligar e não desligar na adição dos nucleotídeos. A DNA Pol III é a principal DNA-replicase pois tem uma processividade alta, ela não desliga e continua adicionando nucleotídeos. As outras ligam (adicionam nucleotídeos) e desligam (soltam).
Para não soltar da fita de DNA a DNAPol III possui uma subunidade β (2 monômeros) essa subunidade prende a enzima na fita de DNA gerando a alta processividade (que impede que ligue e desligue). A atividade exonuclease é no sentido 3’-5’ (se errar a sequência do nucleotídeo volta para reparar, evitando o erro).
Replicação é semiconservativa, bidirecional e por ataque nucleofílico.
A enzima traz o nucleotídeo com três fosfatos. O OH livre da extremidade 3’ ataca o fosforo e cliva os outros dois fosfatos, se ligando ao terceiro que tem o nucleotídeo.
Para a enzima começar a adicionar os nucleotídeos precisa que já tenha um pedaço de fita nova no sentido 5’- 3’ tendo o OH livre para atacar o fosforo que a enzima traz.
Enzimas/ Proteínas/ sequências replicativas
DNA molde
Nucleotídeos trifosfatados
DNA Pol III: enzima principal
Helicase: Quebra as pontes de hidrogênio e abre a bolha de replicação separando as fitas moldes (abre as duas fitas e adiciona giros no resto da fita)
Primase: adiciona o primer inicial de RNA que tem tamanho de 10-60 ribonucleotídeos de tamanho. Os primers de RNA fornecem as 3’-OH livres necessárias para o ataque nucleofílico do fósforo do nucleotídeo trifosfato que a DNA Pol adiciona.
Girase: Topoisomerase tipo II (para não formar muitos giros extras). A girase cliva as duas fitas de DNA e gira de forma negativa impedindo que adicione mais giros, gasta energia.
SSB- PTN: Proteínas monoméricas que ligam em sequências de DNA símples impedindo a junção das fitas.
Ligase: Faz a ligação do último nucleotídeo com o primeiro do primer que é retirado.
DNA Pol I: Retira os primers e adiciona a sequência de DNA no lugar.
Replicação em Eucarioto
A replicação de DNA em eucariotos é restrita a fase S (duplicação) do ciclo celular. Em todas as células, as decisões para continuar no ciclo celular ocorrem em dois pontos: entrada da fase S e entradana mitose. Estes pontos de verificação ajudam a garantir que o DNA se replique apenas uma vez durante cada divisão celular.
Existem 5 tipos de DNA polimerase em eucariotos:
- DNA Pol alfa: Replicação no núcleo, atividade polimerase 5’-3’ e não possui atividade exonuclease.
- DNA Pol delta: Replicação no núcleo, atividade polimerase 5’-3’, e exonuclease 3’-5’.
- DNA Pol epsilon: Replicação no núcleo, atividade polimerase 5’-3’, exonuclease 3’-5’.
- DNA Pol gama: Replicação na mitocôndria, atividade polimerase 5’-3’, exonuclease 3’-5’.
- DNA Pol beta: Reparo na mitocôndria, atividade polimerase 5’-3’, não possui atividade exonuclease.
DNA Pol delta e epsilon possuem a mesma processividade, mas no Snustad trata como sendo a Pol de replicação a DNA Pol delta.
PCNA: Tem o mesmo efeito da subunidade β, para se tornar ativo tem que interagir com o fator C de replicação.
Para a DNA Pol delta agir precisa do PCNA, mas para o PCNA ativar e ligar na Pol delta precisa interagir com o fator C de replicação. Depois da interação, o PCNA consegue se ligar a Pol delta garantindo a processividade.
Forquílha de replicação são duas enzimas polimerizando uma para cada lado, diferente de procarioto que a mesma enzima polimeriza dos dois lados.
Replicação:
Molde de DNA: Precisa de Mg+2 para começar a replicar, é necessário para o funcionamento da enzima.
dNTPs: Nucleotídeos trifosfatados
Helicase: desenrolamento (rompe as pontes de hidrogênio e separa as fitas).
DNA Pol alfa: forma um complexo com a DNA-Primase. Adiciona os primers iniciais. A primase adiciona os primeiros 10 ribonucleotídeos (RNA) e a Pol alfa adiciona mais 20 Desoxirribonucleotídeos, formando uma extensão de 30 nucleotídeos (10 RNA + 20 DNA)
DNA Pol delta: Maior processividade
Proteína A: Mesma função que as SSB, impede que as pontes de hidrogênio se fundem.
Ribonuclease: Degradam o primer de RNA. Depois a DNA Pol delta preenche as partes do primer de RNA com DNA.
DNA ligase: ATP, restaura a ligação fosfodiester.
Topoisomerase: Quebra as fitas para tirar os giros extras.
Replissomo: Tudo que está na forquílha de replicação. Mais componentes no replissomo dos eucariotos.
Em eucariotos a DNA Pol delta adiciona 3.000 nucleotídeos por minuto apenas e tem mais material genético comparado com procarioto. No entanto replica mais rápido, pois são vários replicons, diferente de procarioto.
Em eucarioto termina mais rápido, pois tem várias origens de replicação (começa em vários pontos e no final se encontram).
Homo sapiens 10.000 origens de replicação (10.000 replicons)
Duplicação de nucleossomos nas forquílha de replicação
O nucleossomo divide-se em duas metades de nucleossomos enquanto o replissomo passa fazendo a replicação do DNA. Na fase S do ciclo celular há um aumento de histonas que se ligam as metades dos nucleossomos, formando uma metade velha e outra nova. Essa duplicação do nucleossomo ocorre por um mecanismo dispresivo.
Telomerase
As DNA Polimerases não podem replicar o segmento terminal do DNA do filamento descontínuo de um cromossomo linear. Nas ponta da molécula de DNA que se replica descontinuamente, não haveria filamento de DNA para dar uma 3’-OH livre (primer) para polimerização de desoxirribonucleotídeos após o primer de RNA do fragmento de Okazaki terminal ter sido removido. A enzima telomerase contém um molde de RNA que estende a ponta 3’ do filamento molde e não o espaço oposto do filamento molde. A telomerase adiciona essas repetições de RNA no telômero e a DNA Polimerase catalisa a síntese do filamento complementar.

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