QUANTIFICACA DE PROTEINAS EM SOLUCAO

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Métodos para Quantificação de 
Proteínas
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
CURSO DE BACHARELADO EM BIOTECNOLOGIA 
DISCIPLINA: QUÍMICA DE PROTEÍNAS 
Por que quantificar?
• Para saber o quanto há de proteina numa amostra 
• Para o cálculo de atividade específica (enzimática, 
bioatividade) 
• Para acompanhar etapas do processo de purificação 
• Para a confecção da tabela de purificação 
• Para o cálculo do Kcat (“poder catalítico”) das enzimas
Qual método utilizar?
– Sensibilidade – menos quantidade de proteína capaz de ainda 
 ser detectada. 
– Faixa de linearidade 
– Especificidade 
– Facilidade 
– Custo 
– Conhecimento da amostra (presença de contaminantes) 
– Concentração aproximada 
Métodos não colorimétricos
– Kjeldahl, 1880 
• Determina a quantidade de N derivado das proteínas 
(mas há outras moléculas compostas de N, também!!!)
https://www.google.com.br/search?q=August
+Beer&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjZ3djRo6vTAhULj5AKHUr6A0MQ_AUIBigB&
biw=1440&bih=775#tbm=isch&q=M%C3%89TODO+MACRO+E+MICRO+BRADFOR+PARA
+PROTE%C3%8DNAS&imgrc=1jOEecd21jtCBM:
Métodos não colorimétricos
– Kjeldahl, 1880 
• Determina a quantidade de N derivado das proteínas 
(mas há outras moléculas compostas de N, também!!!) 
– Determinar a massa seca da proteína pura 
– Determinar a composição de aminoácidos da 
proteína pura (usa massa molecular)
Métodos Espectrofotométricos
Visível (tungstênio e xenônio)
UV (deutério, hidrogênio, mercúrio)
Medida da quantidade de luz absorvida por soluções coloridas ou não. 
 
No procedimento básico, usa-se o espectro radiante que atravessa uma solução e 
sua absorção ou transmissão oferece informação sobre a qualidade e quantidade 
dos compostos do sistema.
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/04/Beer_lambert.png
T = I1/Io
%T = I1/Io x 100 
QUAL O PRINCÍPIO GERAL DA ESPECTROFOTOMETRIA?
Métodos Espectrofotométricos
QUE EQUIPAMENTO É UTILIZADO PARA MEDIR ABSORÇÃO DE 
ENERGIA ELETROMAGNÉTICA? 
Métodos Espectrofotométricos
NO CASO DAS PROTEINAS, NO 
QUE SE BASEIA SUA DETECÇÃO 
E QUANTIFICAÇÃO?
A detecção e quantificação de uma proteína por 
espectrofotometria se baseia nas propriedades de 
absorção de luz: (1) da ligação peptídica; (2) de grupos 
presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos que a 
constituem; (3) de produtos coloridos resultantes de 
reações entre a proteína e compostos químicos 
específicos.
Métodos Espectrofotométricos
Interação da 
radiação 
eletromagnética 
com a matéria
Espectro Contínuo

Cores do espectro visível
Cor Comprimento de onda Frequência
vermelho ~ 625-740 nm ~ 480-405 THz
laranja ~ 590-625 nm ~ 510-480 THz
amarelo ~ 565-590 nm ~ 530-510 THz
verde ~ 500-565 nm ~ 600-530 THz
ciano ~ 485-500 nm ~ 620-600 THz
azul ~ 440-485 nm ~ 680-620 THz
violeta ~ 380-440 nm ~ 790-680 THz
E = h.c/λ
E = h.ν
h= 6,6 x 10-34 J.s 
C = 299 792 458 m.s-1 
V = frequência = c/λ
http://pt.wikipedia.org/wiki/Cor
QUE COMPRIMENTOS DE ONDA SÃO USADOS?
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
•Comprimento de onda (λ)
•Período (p) = tempo 
necessário para completar um 
ciclo 
•Freqüência (f) = ciclos/s ou 
Hertz
 
 f= c/ λ 
 c = velocidade da luz no vácuo 3.1010 cm/s
Λ unidades
nm = 10-9 m
A= 10 -10 m
Energia (E)
E = h.f => E = h.c/λ
h= constante de Planck – 6,62.10-34 J/s
 4,14.10-15 eV/s
Métodos Espectrofotométricos
Interação da 
radiação 
eletromagnética 
com a matéria
Cada substância absorve, com maior 
intensidade, luz de certo comprimento de 
onda.
E COMO SE DETERMINA QUAL É ESSE COMPRIMENTO DE 
ONDA NO QUAL HÁ MAIOR ABSORÇÃO DE ENERGIA 
ELETROMAGNÉTICA POR UMA SUBSTÂNCIA? 
Por meio de curvas espectrais
Como são os Espectros de Absorção do NAD+ e do NADH?
Como vc poderia saber 
se NADH está sendo 
oxidado a NAD+ ?
Como são os Espectros de absorção de Proteínas e de 
Ácidos Nucléicos?
Métodos Espectrofotométricos
Log (I0/ I) =A=ε.c.l
Lei de Lambert-Beer
A= absorbância 
ε= coeficiente de absorptividade (coef. Extinção) [M; %] 
c= concentração do material absorvedor 
l= caminho (amostra + paredes cubeta) através do qual a 
 luz passa.
O QUE DIZ A LEI DE LAMBERT?
51%
100%
80%
64%
40,8%
io
i1
i2
i3
i4
A proporção de luz (fótons) incidente absorvida por um meio independe de sua 
intensidade, e cada camada do meio aquoso absorve uma fração igual de luz 
(fótons) que passa através dela
Caminho óptico
Ou seja, -di/dl ∞ i.c, onde i = luz incidente; l = caminho óptico 
e c = concentração 
1 cm 1 cm 1 cm 1 cm (l)
Concentração constante, caminho óptico variável
l = 4 cm
100%
io
40,8%
i
Juntando todas as cubetas
 -di/dL ∞ i.c
UM EXEMPLO DA LEI DE LAMBERT
Green laser light in a solution of Rhodamine 6B. The beam intensity becomes weaker 
as it passes through solution. (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Beer
%E2%80%93Lambert_law_in_solution.JPG)
Pierre Bouguer (1729) e de Johann Heindrich Lambert (1760) duas 
leis fundamentais: 
- A intensidade de luz (monocromática) transmitida por um corpo 
homogêneo é proporcional à intensidade de luz incidente. Isto é: 
 
- A intensidade de luz (monocromática) transmitida decresce 
exponencialmente com o aumento da espessura da camada do 
corpo homogêneo 
It/Io = 10 –cba onde c= concentração; 
ba= constante
T = 10-cba
log T = log 10 -cba 
log T = -cba log 10
log T = -cba -log T = cba
log 1/T = cba log Io/It = cba
 log Io/It = Absorbância
Johann Heinrich Lambert (26 de Agosto de 1728, em Mulhouse (Alsácia), 
então parte do território Suíço - 25 de Setembro de 1777) foi um matemático 
de origem francesa, radicado na Alemanha. A obra de Lambert inclui a 
primeira demonstração de que Pi é um número irracional (1768), o 
desenvolvimento da geometria da regra, o cálculo da trajetória de cometas. 
Também se interessou por cartografia e definiu a projeção de Lambert. Foi 
um dos criadores da fotometria e autor de trabalhos inovadores sobre 
geometrias não euclidianas. 
Matematicamente, como expressar a Lei de Lambert ?
-di/dl ∞ i.c ou -di/dl = kic ou - di/i = kcdl 
Integrando essa equação, temos: 
-∫di/i = kc∫dl, com i variando de io a i e l variando de 0 a l 
- Lni = kcl -[Lni – Lnio] = kc (l-0) - Ln(i/io) = k.c.l 
Ln(i/io)-1 = k.c.l Ln (io/i) = k.c.l 2,303Log(io/i) = k.c.l 
Log (Io/I) = k/2,303 . c.l log (io/i) = ε.c.l 
 
A = ε.c.l
ε.c.l= 10Io/I
ε = coeficiente de absortividade
OU A ∞ C 
O QUE DIZ A LEI DE BEER?
64%
100%
80%
100%
51%
io
i1
i0
i1
i1
A luz (fótons) incidente absorvida é proporcional ao número de moléculas da 
substância absorvente através da qual a luz (fótons) passa.
Caminho óptico
1 mg/mL 4 mg/mL2 mg/mL
100%
Ou seja, -di/dc ∞ i.l, onde i = luz incidente; l = caminho óptico 
e c = concentração 
Concentração variável, caminho óptico constante
Matematicamente, como expressar a lei de Beer? 
-di/dc ∞ i.l 
-di/i = k.l.dc Integrando esta equação, temos: 
-∫di/i = kl∫c, com i variando de io a i; c variando de 0 a c 
-[Lni – Lnio] = k.l (c- 0) 
-Ln(i/io)= klc, 
Ln (i/io)-1 = k.l.c Ln(io/i) = k.l.c 2,303Log(io/i) = k.l.c 
Log (io/i) = k/2,303 . l .c log (io/i) = ε.l.c 
 
A = ε.c.l
A = log1/T 
Log(io/i)= = log1/Tε = coeficiente de absortividade
August Beer (31 Julho, 1825 – 18 November, 1863) foi um físico e 
matemático alemão. 
Nasceu em Trier, onde estudou matemática e ciências naturais. 
Trabalhou para Julius Plücker em Bonn, onde tirou Ph.D. em 1848 e 
tornou-se um “lecturer” em 1850. 
Beer tornou-se professor de matemática em Bonn em 1855. 
 
Em 1854, Beer publicou seu livro “Einleitung in die höhere Optik”. 
Suas descobertas com àquelas de Johann Heinrich Lambert, deram 
origem a Lei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer
• Transmitância:
• Na lei de Lambert-Beer 
T = I / I0
T = 10-Ɛlc
Lei de Lambert-Beer
• Absorbância
• Na lei de Lambert-Beer 
A = - log10 T
A = - log10 T = log10(1/T ) = -log10(10-Ɛlc)
Lei de Lambert-Beer
A = absorbância
A = ε c l quando a concentração é expressa em mol/L
 
ε = absortividade/absortividade molar
l= caminho óptico
c= concentração
A linearidade da lei de Lambert-Beer é limitado por fatôres químicos e 
instrumental 
 
Causas da não-linearidade, incluem: 
 
• Desvios nos coeficientes de absortividade em concentrações elevadas 
 (> 0,01 M), devido à interação eletrostática entre moléculas nas proximidades; 
• Espalhamento da luz devido a partículas na amostra (suspensão); 
• Fluorescência ou fosforescência da amostra; 
• Mudanças no índice de refração; 
• A alta concentração do analito; 
• Mudanças no equilíbrio químico em função da concentração; 
• Luz não-monocromática (os desvios podem ser minimizados utilizando uma parte 
relativamente plana do espectro de absorção, como o máximo de uma banda de absorção) 
• Luz difusa 
Quais são as Limitatações da Lei de Lambert-Beer? 
Métodos Espectrofotométricos
A=ε.c.l
Quando ε é conhecido, pode-se descobrir a concentração da 
proteína utilizando a lei de Lambert-Beer
Como determinar o valor de ε?
Determinar o valor de ε
• Determinação do coeficiente de extinção molar 
(ε) para proteínas desnaturadas 
– Calculado a partir da composição de aminoácidos 
• Determinação do coeficiente de extinção molar 
(ε) para proteínas nativas
ε = (número de Tyr x 1280) + (número de Trp x 5690) + (número de Cys x 60) 
ε = (número de Tyr x 1490) + (número de Trp x 5500) + (número de Cys x 62,5) 
Variável de proteína para proteína
E COMO CALCULAR, NA PRÁTICA, O VALOR DE ε, SEM USAR ESSAS 
FÓRMULAS ACIMA? 
Espectrofotômetro a 280 nm
TryptophanTyrosinePhenilalanine
λ = 280 nm
•Visível (400 a 780 nm) e Ultravioleta (180 a 380 
nm) 
•Cubeta de vidro (plástico) X Cubeta de quartzo
•Valores de absorbâncias (280 nm) para soluções 
contendo 1 mg/mL de proteínas são variáveis 
– BSA (1 mg/mL) = 0,660 
– Lisozima do ovo de galinha (1 mg/mL) = 2,63
A=ε.c.l
POR QUÊ?
RACIOCINE!!!
Espectrofotômetro a 280 nm
• Determinação do coeficiente de extinção 
• Proteína é recuperada após quantificação 
• Absortividade molar pode variar de proteína para 
proteína 
• Interferências 
– Ácidos nucleicos 
– Detergentes: Triton X-100
A=ε.c.l
Métodos Colorimétricos
• Métodos 
– Bradford 
– Lowry 
– Ácido bicinconínico 
– Biureto
Principais etapas
Passo 1: Preparação da solução estoque da 
proteína de referência
Passo 2: Construção da curva de calibração
Passo 3: Determinação da concentração da 
proteína desconhecida
Bradford
Bradford M.M. A rapid and sensitive 
method for quantitation of microgram 
quantities of protein utilizing the 
principle of protein-dye-binding. Anal 
Biochem 1976; 72:248-54. 
mg/mL
The scientist who developed and patented the Bradford protein assay, a method to quickly quantify the 
amount of protein in a sample
Bradford, 1976
▪ Corante Coomassie Brilliant Blue G-250 
▪ Alteração de coloração após ligação com proteínas 
▪ Coloração azul intensa – forma desprotonada (λ entre 595 e 620 
nm) 
▪ Forma desprotonada – interação com grupos NH3+ das cadeias 
laterais das proteínas e também com resíduos aromáticos 
▪ Vantagens: Maior rapidez e sensibilidade em relação ao método 
de Lowry
Coomassie Brilliant Blue G-250
CBB G-250 has two additional methyl groups in relation to 
R-250. Both dyes work by binding to proteins through ionic 
interactions between the sulfonic acid groups in the dye 
and the positive amine groups in the protein, and through 
Van der Waals attractions.
gracy
Nota
Bradford M.M. Um método rápido e sensível para quantificação de microgramasnullquantidades de proteína utilizando o princípio da ligação proteína-corante.nullAnalBiochem 1976; 72: 248-54.nullnullO CBB G-250 possui dois grupos metil adicionais em relação ao R-250.nullnullAmbos os corantes trabalham ligando-se a proteínas através de interações iônicas entre os grupos de ácido sulfônico no corante e os grupos positivos de amina na proteína, e através denullVan der Waals atrações.nullnullCBB R-250 (R significa a tonalidade ligeiramente avermelhada na cor azul do corante) enullCBB G-250 (G significa o tom esverdeado no corante). G-250 oferece um mais rápido protocolo de coloração
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23246?gclid=COXKq9Xa5ssCFUIfhgodpQ8CUw&s_kwcid=
CBB R-250 (R signifies the slightly reddish tint in the blue color of the dye) and 
CBB G-250 (G signifies the greenish tint in the dye). G-250 offers a faster 
staining protocol. 
https://info.gbiosciences.com/blog/how-to-choose-between-g250-or-r250-coomassie-dyes
O reagente de Bradford contém como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em 
solução ácida. Este ao ligar-se às proteínas, tem a sua absorbância alterada de 465 nm para 595 nm. Esta interação 
entre o corante Coomassie com a proteína, estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança 
de coloração inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína (ver Fig.).
O que é o Reagente de Bradford para dosagem de Proteínas?
A absorbância pode ser medida em um espectrofotômetro ou leitor de microplacas utilizando o comprimento de 
onda de 595 nm. A comparação dos resultados com uma curva padrão, com valores de concentrações 
conhecidos, permite a determinação da concentração da proteína em estudo.
Tempo de incubação (min./max.) 15 min/60 min. Comprimento de onda utilizado, 595 nm Limite. 
Linear para ensaio padrão 0,2 - 1,4 mg/ml IgG 0,2 - 0,9 mg/ml BSA
http://www.bioagency.com.br/novo/folders/500-0006N.pdf
Proteína é um polímero 
formado pela união de 
aminoácidos
http://w
w
w
2.iq.usp.br/docente/giordano/A
ulas/
A
ula180809.pdf
S/Prot. C/ lysozyme
gracy
Nota
O reagente de Bradford contém como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 emnullsolução ácida. nullnullEste ao ligar-se às proteínas, tem a sua absorbância alterada de 465 nm para 595 nm. Esta interaçãonullentre o corante Coomassie com a proteína, estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudançanullde coloração inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína (ver Fig.).nullnullA absorbância pode ser medida em um espectrofotômetro ou leitor de microplacas utilizando o comprimento denullonda de 595 nm. A comparação dos resultados com uma curva padrão, com valores de concentraçõesnullconhecidos, permite a determinação da concentração da proteína em estudo.nullTempo de incubação (min./max.) 15 min/60 min. Comprimento de onda utilizado, 595 nm Limite.nullLinear para ensaio padrão 0,2 - 1,4 mg/ml IgG 0,2 - 0,9 mg/ml BSA
O reagente de Bradford contém como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em 
solução ácida. Este ao ligar-se às proteínas, tem a sua absorbância alterada de 465 nm para 595 nm. Esta interação 
entre o corante Coomassie com a proteína,estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança 
de coloração inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína (ver Fig.).
O que é o Reagente de Bradford para dosagem de Proteínas?
A absorbância pode ser medida em um espectrofotômetro ou leitor de microplacas utilizando o comprimento de 
onda de 595 nm. A comparação dos resultados com uma curva padrão, com valores de concentrações 
conhecidos, permite a determinação da concentração da proteína em estudo.
Tempo de incubação (min./max.) 5 min/60 min. Comprimento de onda utilizado, 595 nm Limite. 
Linear para ensaio padrão 0,2 - 1,4 mg/ml IgG 0,2 - 0,9 mg/ml BSA
http://www.bioagency.com.br/novo/folders/500-0006N.pdf
Proteína é um polímero 
formado pela união de 
aminoácidos
http://w
w
w
2.iq.usp.br/docente/giordano/A
ulas/
A
ula180809.pdf
Bradford, 1976
▪ Desvantagens: Variação da absortividade específica para 
diferentes proteínas devido à baixa sensibilidade ou baixa 
massa molecular das proteínas 
▪ Pode apresentar baixa reprodutibilidade (qualidade do coomassie)
Bradford
• Faixa de linearidade 
1-25 µg de proteínas 
2 to 1500 µg/mL 
The Bradford assay is linear over a short range, typically from 0 µg/mL 
to 2000 µg/mL 
• Preparo da solução de Coomassie
gracy
Nota
O ensaio de Bradford é linear ao longo de um curto intervalo, normalmente a partir de 0 μg / mL
para 2000 μg / mL
Procedimento Bradford
• Construção da curva-padrão 
• Proteína padrão – BSA 
• Solução estoque - 5 mg/mL (água) 
• Soluções diluídas (0,2 a 1 mg/mL) 
• Pipetar 0,1 mL de cada solução diluída 
• Pipetar 5 mL da solução de Bradford 
• Agitação e repouso por 10 min (não mais que 1 h) 
• Leitura a 595 nm (zerar) 
• Plotar resultados na curva-padrão (adicionar fator de 
diluição) 
Procedimento Bradford
• Construção da curva-padrão 
• Proteína padrão – BSA 
• Solução estoque - 5 mg/mL (água) 
• Soluções diluídas (0,2 a 1 mg/mL) 
• Pipetar 0,1 mL de cada solução diluída 
• Pipetar 5 mL da solução de Bradford 
• Agitação e repouso por 10 min (não mais que 1 h) 
• Leitura a 595 nm (zerar) 
• Plotar resultados na curva-padrão (adicionar fator de 
diluição) 
Checar se, de fato, as 
concentrações de BSA são as 
que se pretendia
Como é construida uma Curva de Calibração ou Curva Padrão? 
A partir de leituras de absorção de padrões de várias concentrações
0 100 200 300 400 500 600
[mg/mL]
Faixa ótima de 
trabalho
(mg/mL)
Curva padrão
• A280 (1 mg/mL) = 0,660 (BSA) 
Concentração 
Teórica (mg/mL)
A280 Concentração 
Real
0 0 0
0,2 0,120 0,182
0,4 0,238 0,361
0,6 0,365 0,553
0,8 0,,472 0,715
1,0 0,602 0,912
COMO CALCULAR A CONCENTRAÇÃO REAL?
Curva-padrão
Concentração 
Real
Quantidade de 
proteína usada no 
ensaio (ug)
A595
 0 0 0
0,182 4,55 0,209
0,361 9,03 0,382
0,553 13,83 0,537
0,715 17,88 0,683
0,912 22,80 0,810
Gráfico de dispersão - média de C.
Regressão linear: y = ax + b 
serve para determinar a concentração das substâncias, onde:
y é o valor da absorbância
x é a concentração
R2 avalia a variação dos resultados obtidos na curva. 
Quanto menor a variação, o resultado de R2 estará mais próximo de 1 (resultado ideal)
Quanto mais próximo de 1, mais precisas serão as determinações.
TUBO Repetição I Repetição II Repetição III Repetição IV Média
01 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
02 0,0641 0,0397 0,0136 0,0432 0,0401
03 0,1380 0,0993 0,1114 0,1029 0,1129
04 0,2429 0,1661 0,1558 0,1705 0,1838
05 0,3145 0,2456 0,2240 0,2583 0,2594
06 0,4086 0,2961 0,3367 0,3038 0,3363
ab
s
0
0,1
0,2
0,3
0,4
ug/0,1ml proteina
0 25 50 75 100
y = 0,0034x - 0,0174
R² = 0,9919
Curva-padrão
F = cotgφ = CatAdj /Cat Op 
F = (0,80 - 0,22) mg.mL-1 / (0,75 – 0,20) 
F = 0,58 / 0,55 F = 1,055 mg.mL-1 
Veja: 1 / 0,9381 = 1,066 mg.mL-1 ~ 
F
Com base na Lei de Lambert-Beer, deve-se grafar absorbâncias (A) versus 
concentrações conhecidas da amostra padrão. O fator F de calibração deve ser 
calculado a partir da cotangente da reta, ou F = cotg φ
Concentração (mg/mL)
A 5
95
φ
CALCULANDO O FATOR
CALCULANDO CONC. DESC.
ε = 0,93 mg-1. mL cm-1
CALCULANDO ε 
Procedimento do ensaio
• 100 µL da amostra 
• 5 mL da solução de coomassie 
• Agitar e deixar em repouso por 10 min 
• Leitura a 595 nm 
• Calcular a concentração de proteína com base na 
curva de calibração e levando em conta o fator de 
diluição da amostra
Como se calcula a Concentração de uma amostra desconhecida?
http://www.google.com.br/search?as_q=ESPECTROFLUORIMETRIA&hl=pt-BR&rlz=1W1ADBS_pt
(Cx)
Interferentes Bradford
Biureto
Biureto (Gornall et al., 1949)
Ligações peptídicas das proteínas reagem com o 
Cu2+ presente no reagente de Biureto, sob 
condições alcalinas, e produzem um complexo 
de cor púrpura que pode ser medida a 540 nm.
Biureto
• Muito menos sensível que outros métodos 
• 0,5 a 5 mg 
• Muito utilizado na dosagem de proteínas de plasma sanguíneo, alimentos 
como leite, urina, saliva etc. 
• Interferentes 
– Tris 
– Amônia 
– Açucares redutores e aminas reagem com o cobre, impedindo à formação do 
complexo 
– Peptídeos também ragente com o Biureto
Outros interferentes
Reagentes
– Reagente de Biureto 
– 1,5 g CuSO4.5H2O 
– 6 g Tartarato de sódio e potássio 
– H2O qsp 500 mL 
– Adicionar 300 mL de NaOH 10% (m/v) 
– Completar o volume para 1 L com H2O destilada. 
– A r m a z e n a r e m f r a s c o p l á s t i c o p o r t e m p o 
indeterminado
Curva
– Solução estoque de BSA (20 mg/mL) 
– Preparar soluções diluídas a partir da solução estoque. 
Ex: 0 - 20 mgP/mL 
– Misturar 300 µL de cada uma das soluções diluídas 
(padrão) com 1400 µL do reagente de biureto. 
– Incubar a temperatura ambiente por 10 a 15 min 
– Leitura a 540 nm
Ensaio
• Incubar 300 uL da amostra+ 1400 uL do Reagente de 
biureto 
• Agitar e deixar de 10-15 min a temperatura ambiente 
• Realizar a leitura a 540 nm. 
• Utilizar a curva-padrão para o cálculo da concentração 
de proteína 
Lowry ou Folin-Ciocalteu
Lowry et al., 1951
1 - Íons Cu2+ são reduzidos a Cu1+ após interação com 
ligações peptídicas. 
2 - O Cu1+ causa a redução do ácido fosfomolíbdico-
túngstico resultando numa coloração azul que pode 
ser quantificada pela absorbância a 750 nm.
Reagente de Folin-Ciocalteu – 
Molibdato, tungstato e ácido fosfórico
www.google.com.br/search?q=Lowry+para+proteinas&biw
Lowry
• Faixa ideal de concentração 
– 5 a 100 µg de proteínas
• Interferências 
• EDTA 
• Ditiotreitol 
• 2-mercaptoetanol 
• NH4+ 
• Tirosina 
• Triptofano 
• Cisteína 
• Cistina 
Reagentes para o ensaio
• Reagente A 
– CuSO4.5H2O 0,1% (m/v) 
– Tartarato de sódio ou potássio 0,2% (m/v) 
– Na2CO3 10% (m/v) 
– Volume final ajustado com água destilada 
Armazenar por tempo indeterminado
• Reagente B 
– Misturar 1 volume do Reagente A com 2 volumes de SDS 5% e 1 
volume de NaOH 0,8 M 
– Estável por até 2 semanas à temperatura ambiente 
Reagentes para o ensaio
• Reagente C 
– 1 volume do reagente de Folin-Ciocalteu e 5 volumes de água 
destilada
Curva-padrão
• Proteína padrão – BSA 
• Solução estoque - 5 mg/mL 
• Soluções diluídas (0,25 mg/mL) 
• Incubar 400 uL da solução de BSA + 400 uL do 
Reagente B por 10 min a temperatura ambiente. 
• Adicionar o Reagente C e deixar por 30 min a 
temperatura ambiente 
• Realizar a leitura a 750 nm. 
Ensaio
• Incubar 400 uL da amostra+ 400 uL do Reagente B 
por 10 min a temperatura ambiente. 
• Adicionar o Reagente C e deixar por 30 min a 
temperatura ambiente 
• Realizar a leitura a 750 nm. 
• Utilizar acurva-padrão para o cálculo da concentração 
de proteína 
Resumindo
Vantagens: 
• Sensibilidade 
• Pouco consumo de amostra 
• Baixo custo 
Desvantagens: 
• Interferentes 
• Absortividade muito variável entre as amostras 
• Longo tempo de análise 
• Estreita faixa de linearidade 
Interferentes
Ácido Bicinconínico
Ácido Bicinconínico
1 - Sob condições alcalinas, o Cu2+ se complexa com ligações 
peptídicas e se reduz a Cu+. 
2 - Interação do Cu+ + BCA para formar um complexo de cor 
púrpura que pode ser detectada a 562 nm.
Ácido Bicinconínico
• Faixa de linearidade 
– 0,2 a 50 µg de proteínas
• Vantagens 
• Rapidez 
• Sensibilidade 
• Reagente estável por mais de uma semana
Ácido Bicinconínico
Interferentes
Reagentes para o ensaio
• Reagente A 
– Bicinconitato de sódio (0,1 g) 
– Na2CO3.H2O (2 g) 
– Tartarato de sódio (0,16 g) 
– NaOH (0,4 g) 
– NaHCO3 (0,95 g) 
– Água destilada qsp 100 mL 
– Ajustar pH para 11,25 com NaHCO3 ou NaOH
• Reagente B 
– CuSO4.5H2O (0,4 g) 
– Água destilada qsp 10 mL 
Reagentes para o ensaio
• Solução de trabalho (BCA) 
– Reagente A – 100 vol 
– Reagente B – 2 vol 
OBS: Coloração verde e estável a temperatura ambiente 
por 1 semana.
Curva padrão
– Solução estoque de BSA (5 mg/mL) 
– Preparar soluções diluídas a partir da solução estoque. 
Ex: 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 mgP/mL 
– Pipetar 980 µL da solução BCA e adicionar 20 µL de 
cada uma das soluções diluídas 
– Incubar a 60 °C por 1 h 
– Após incubação, deixar atingir a temperatura 
ambiente (máximo 1 h) 
– Leitura a 562 nm
Ensaio
– Pipetar 980 µL da solução BCA e adicionar 20 µL da 
amostra 
– Incubar a 60 °C por 1 h 
– Após incubação, deixar atingir a temperatura 
ambiente (máximo 1 h) 
– Leitura a 562 nm
Uso de Microondas
• Radiação eletromagnética não-ionizante 
• Frequencia de 2,45 GHz (2,45 bilhões de oscilações/s) 
• Adaptar cada método 
• 10 s (Lowry) 
• 20 s (BCA) 
Outros métodos
• PBQ (Zaia et al., 1990, 1992, 1993) 
• P-benzoquinona + proteína = produto (350 nm) 
• 10 x mais sensível que biureto 
• Menor custo que Lowry 
• Krystal et al 1985, 1987 
• Prata amoniacal + proteínas = produto (420 nm) 
• 100 x mais sensível que Bradford