Reação em cadeia da polimerase PCR

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Replicação de DNA in vitroREAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASEPolymerase Chain Reaction (PCR)(Mullis & Faloona, 1987)Replicação exponencial de uma sequência genômica alvo in vitro, catalisada por uma DNA polimerasetermo-resistente 
A REAÇÃO REQUERPresença dos quatro tipos de desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dTTP e dGTP)Utilização de um par de iniciadores (primers), que flanqueiam a região a região genômica que se pretende amplificarPrimers são oligonucleotídeos de fita simples de DNA quimicamente sintetizadas, contendo de 20 a 30 nucleotídeos, complementares às extremidades da região do DNA que se deseja amplificar Enzima para síntese de DNA 
A TÉCNICA ENVOLVE VÁRIOS CICLOS DE REAÇÃO E CADA CICLO DE PCR ENVOLVE:Desnaturação térmica da molécula de DNA alvo de fita dupla (90ºC a 96ºC) Anelamento dos primers por redução da temperatura até o ponto ideal (entre 40 e 65C)Extensão da síntese da nova fita de DNA (72ºC) 
DNA alvoPrimer 1Primer 2DesnaturaçãoAnelamentoExtensão
Representação esquemática de um ciclo da reação em cadeia da polimerase (PCR)5´3´
CARACTERÍSTICAS DA TÉCNICAFitas recém-sintetizadas funcionam como molde para o próximo cicloObtenção de acúmulo exponencial de cópias (DNA de fita dupla) da região delimitada pelos primersUtiliza quantidades pequenas de material inicial O rendimento é melhor para regiões compreendidas entre 100-1000 pares de basesProdutos da reação analisados por eletroforese em gel corado com brometo de etídeo
A AUTOMAÇÃO DA TÉCNICA FOI PERMITIDA POR MEIO DEIsolamento da DNA polimerase da bactéria Thermus aquaticus, que habita fontes de água quente (a enzima é capaz de catalisar a síntese de DNA na faixa de temperatura de 70ºC a 80ºC e de se manter estável entre 94 e 95ºC) Desenvolvimento de equipamentos denominados termocicladores
TERMOCICLADORES 
APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS AMPLIFICADAS NO GEL DE AGAROSE
VISUALIZAÇÃO DO GEL SOB LUZ UV E DOCUMENTAÇÃO
APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCRConstrução de bibliotecas de cDNA (DNA complementar) a partir de quantidades diminutas de mRNADesenvolvimento de técnicas de sequenciamento e clonagem gênica e de marcadores moleculares de DNADiagnóstico de câncer e de doenças hereditárias em humanos (Anemia falciforme, fibrose cística, distrofia muscular de Duchenne)
APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE PCRAplicações forenses Detecção de agentes infecciososMelhoramento genético animal assistido por marcadores moleculares (Identificação de locos com efeitos sobre caracteres de importância econômica e de locos associados a doenças hereditárias)Melhoramento genético vegetal
PARÂMETROS DA REAÇÃO DE PCR Temperatura de anelamento depende do tamanho e da sequência dos primers (primers mais longos e com maior conteúdo de guanina (G) e citosina (C) apresentam anelamento mais estável) Tempo para extensão de aproximadamente 1 min/kb de sequênciaNecessários de 20 a 30 ciclosTempo de aproximadamente 30” para a desnaturação térmica do DNA de fita dupla (para DNA com alto conteúdo de GC pode-se aumentar o tempo e a temperatura)
Aspectos importantes para o delineamentodos primersPreferir primers com um conteúdo G/C de 45 a 55% e com a presença de bases G e C na extremidade 3’ terminal Optar por primers de 18 a 25 basesDeve-se evitar Repetições sucessivas de polipurinas e polipirimidinasAuto-complementaridade dos primersComplementariedade entre os dois primersComplementaridade entre os primers e a sequência do DNA-alvo fora dos sítios de priming
Entre as limitações da técnica destacam-seFalta de conhecimento da sequência-alvoContaminação de amostrasEspecificidadePadronização das condições ótimasA reação de PCR pode ser otimizada observandoTempo de extensãoTemperatura de pareamento Concentração do tampão Número de ciclos