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Enzimas Camila Nobre Enzimas 1. Importância do Estudo de Enzimas 2. Breve Histórico 3. Nomenclatura e Classificação de Enzimas 4. Enzimas e Cofatores 5. Como as Enzimas Funcionam 6. Modelo Chave-Fechadura X Encaixe Induzido 7. Fatores Que Interferem A Atividade Enzimática 1. Cinética Enzimática 2. Tipos de Inibição da Atividade Enzimática 3. Enzimas Reguladoras 1. Importância do Estudo de Enzimas Por Que Estudar Enzimas? • Um organismo vivo deve ser capaz de se autoreplicar e catalisar reações químicas eficiente e seletivamente; • Importância das Catálises: reações químicas necessárias para sustentar a vida ocorrendo em escala de tempo útil; Por Que Estudar Enzimas? • Enzimas: Catalisadores Biológicos: – Alta eficiência catalítica; – Alto grau de Especificidade pelo substrato; – Aceleram Reações Químicas; – Funcionam em soluções aquosas sob condições muito suaves (pH e temperatura fisiológicos); – Não são consumidas durante a reação • Coordenação de sequências organizadas de reações: conservação e transformação de energia; Enzimas Processos Fisiológicos Ocorram de modo ordenado Homeostasia Por Que Estudar Enzimas? • Muitas doenças decorrem da deficiência, ausência ou hiper- atividade de certas enzimas; • Importantes ferramentas práticas na Indústria Química, Processamento de Alimentos e Agricultura. Enzimas Catalisadores Aumentam a velocidade das reações Atuam diminuindo a energia de ativação 2. Histórico do Estudo de Enzimas Breve Histórico • Catálise biológica início séc. XIX • digestão da carne: estômago; • digestão do amido: saliva. • Eduard Buchner (1897): • extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool; • enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva. • Década de 50: • Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas. Enzimas X Proteínas Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA que possuem atividade enzimática e são chamadas de RIBOZIMAS, as enzimas são PROTEÍNAS. 3. Nomenclatura e Classificação de Enzimas Nomenclatura e Classificação de Enzimas • Século XX - quantidade de enzimas descritas; • Adicionava-se sufixo ASE ao nome do substrato – enzimas que hidrolisam: • gorduras (lipo - grego) - LIPASE • amido (amylon - grego) - AMILASE • proteínas – PROTEASE • Nomes arbitrários • Tripsina e pepsina - proteases • Catalase - H2O2 • Nomenclatura existente se tornou ineficaz; Classes de Enzimas N0 Classe Tipo de reação catalisada 1 Oxirredutases Transferência de elétrons (íons hidreto ou átomos H) 2 Transferases Reações de transferência de grupos 3 Hidrolases Reações de hidrólise 4 Liases Adição de grupos em ligas duplas ou remoção de grupos com a formação de ligas duplas 5 Isomerases Transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros 6 Ligases Formação de ligações C-C, C-S, C-O, C-N pelo acoplamento da clivagem do ATP ADP + D-Glicose-6-fosfato ATP + D-Glicose IUB – ATP : glicose fosfotransferase E.C. 2.7.1.1 2 - classe - Transferase 7 - subclasse - Fosfotransferases 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor 1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato Nome trivial: Hexoquinase Nomenclatura e Classificação de Enzimas 4. Enzimas e Cofatores Enzimas e Cofatores • Apoenzima: parte proteica da enzima • Cofator: grupamento químico adicional não protéico requerido pela enzima – Coenzima: cofator não está ligado covalentemente à enzima • Exemplo: íons inorgânicos – Grupo Prostético: cofator ligado covalentemente à enzima • Exemplo: vitaminas • Holoenzima: apoenzima + cofator (enzima ativa) 5. Como as Enzimas Funcionam: Catálise Enzimática e Complexo Enzima-Substrato Definições - Enzimas • Ação catalítica: fornecer uma ambiente específico onde uma dada reação é energeticamente mais favorável; • Sítio Ativo: cavidade da enzima onde ocorre a reação enzimática; • Substrato: molécula que se liga ao sítio ativo e sofre a ação da enzima; • Complexo Enzima Substrato: proposto por Wurtz (1980): E + S E S E + P E – Enzima S - Substrato(s) P – Produto(s) ES - Complexo Enzima -Substrato Sítio Ativo Aceleram reações químicas: H2O2 H2O O2 + Catalase Definições - Enzimas Condições da Reação Energia Livre de Reação (kJ/mol) Velocidade Relativa Sem catalisador 75,2 1 Platina 48,9 2,77 x 104 Catalase 23,0 6,51 x 108 Definições - Enzimas Não são consumidas na reação: H2O2 H2O O2 + Catalase E + S E + P Definições - Enzimas Atuam em pequenas concentrações: 1 molécula de Catalase decompõe 5 000 000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo. Não alteram o estado de equilíbrio: •Abaixam a energia de ativação; •Keq não é afetado pela enzima. Diferença entre a energia livre de S e P Caminho da Reação Energia de ativação com enzima Energia de ativação sem enzima S P Definições - Enzimas Energia de Ativação S P Energia de Ativação: energia necessária para que a reação ocorra em uma das duas direções: - Alinhamento dos grupos químicos reagentes, Formação de cargas transientes instáveis, Rearranjos de ligações, entre outras transformações. Reação Catalizada por Enzima Os catalisadores aumentam a velocidade da reação, não afetando seu equilíbrio, diminuindo a energia de ativação E + S E S E P E + P 6. Modelo Chave-Fechadura X Encaixe Induzido Complexo Enzima Substrato 2 modelos propostos: – Chave-Fechadura – Encaixe Induzido Modelo Chave-Fechadura • Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou Chave-Fechadura, que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato. •Interação específica e exclusiva entre duas moléculas biológicas mediada por superfícies moleculares com formas complementares; • Uma enzima totalmente complementar ao seu substrato seria muito eficiente? Modelo Encaixe Induzido • Haldane (1930), Linus Pauling (1946); • Energia de Ligação: é a energia derivada da interação enzima-substrato. É a maior fonte de energia livre usada pelas enzimas para diminuir a energia de ativação das reações. • Koshland (1958): enzima e o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição. • A enzima é complementar ao seu estado de transição (interações ótimas entre enzima e substrato só ocorrem no estado de transição); Modelo Encaixe Induzido Energia de Ligação - Considerações • Energia resultante das interações fracas entre a enzima e o substrato; • Responsável pela especificidade enzima-substrato; • Diminui a entropia entre moléculas reagentes, favorecendo a orientação correta para choques efetivos); • Provoca retirada da camada de solvatação dos reagentes; • Ajuda a compensar termodinamicamente qualquer tensão ou torção que o substrato precise sofrer para reagir; • Responsável pelo ajuste induzido (mudança conformacional enzimática); • A enzima é complementar ao seu substrato no estado de transição; Hexoquinase – D-Glicose7. Fatores Que Afetam a Atividade Enzimática Fatores Que Afetam a Atividade Enzimática • Fatores decorrentes da natureza proteica das enzimas: - pH; - temperatura; • Fatores decorrentes da formação do complexo ES: - concentração do substrato; - concentração da enzima; • Presença de inibidores; • Presença de ativadores. % a ti vi d a d e e nz im á ti ca m á x im a pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9 pH ótimo varia para diferentes enzimas 7.1. Cinética Enzimática Fatores Que Afetam a Atividade Enzimática • Fatores decorrentes da natureza protéica das enzimas: - pH; - temperatura; • Fatores decorrentes da formação do complexo ES: - concentração do substrato; - concentração da enzima; • Presença de inibidores; • Presença de ativadores. Efeito da Concentração do Substrato E E E E S + S P P + Baixa concentração de substrato Formação do produto é PROPORCIONAL à concentração de substrato E E E E E E E E Efeito da Concentração do Substrato 100 % de saturação do centro ativo da enzima S S S S + S S + P P P P P P P P Formação do produto é PROPORCIONAL à concentração de substrato E E E E E E E E E E E E S S Efeito da Concentração do Substrato [Substrato] em excesso S S S S S S S S + + P P P P P P P P S S S S S S S S Velocidade da reação independe da [S] E E E E E E E E E E E E S S S S V Quantidade de produto formado em unidade de tempo Quantidade de substrato transformado em unidade de tempo Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada! Estudo da velocidade da reação (V): E + S E S E + P Equação de Michaelis-Menten Victor Henri (1903): E + S ES 1913 Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra E + S K1 K-1 ES Kp E + P Etapa rápida Etapa lenta Equação de Michaelis-Menten Numericamente, Km pode ser expresso como a [substrato] necessária para que a velocidade da reação seja metade da velocidade máxima Km= [S] V máx [S] Vo Vmax 2 Interpretando Km • Característico de cada enzima • Pode refletir a afinidade da enzima pelo seu substrato • É numericamente IGUAL a [substrato] na qual a velocidade da reação é metade da Vmáx Km Pequena [substrato] é necessária para que a reação atinja metade da Vmáx Km Grande [substrato] é necessária para que a reação atinja metade da Vmáx Comparação entre Km´s Hexoquinase • Presente em todas as células • Km=30M Capaz de metabolizar mais glicose conforme o aporte Saturada Glicoquinase • Presente no fígado • Km=10mM Após refeições [glicose] na veia porta hepática é da ordem de mM 7.2. Tipos de Inibição da Atividade Enzimática Inibidores e Importância do Estudo • São agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou cessando a reações enzimáticas; • Enzimas catalisam praticamente todos os processos celulares, o que não torna surpresa o fato de inibidores enzimáticos serem os mais importantes agentes farmacêuticos conhecidos; • Estudos com inibidores também oferecem informações válidas sobre mecanismos enzimáticos e têm ajudado a definir algumas vias metabólicas; Tipos de Inibição da Ativ. Enzimática • Quanto ao tipo: – Inespecífica: • inibidor a atividade de todas as enzimas • ex: agentes desnaturantes – Específica: • inibidor a atividade de uma única enzima ou de um grupo restrito de enzimas: – irreversível – reversível Inibição Irreversível • Inibidor se combina com grupo funcional (sítio ativo) da enzima; • Forma um complexo estável; • Forma-se ligação covalente entre inibidor e enzima; Inibição Irreversível • Inibição da enzima ciclo-oxigenase (COX) pelo acetilsalicilato: Cox SÍNTESE Processo biológicos, ex. sensação de dor Prostaglandinas Inibição Reversível • Inibidor forma com a enzima composto instável; • Inibição não envolve formação de ligação covalente; • Podem ser dos tipos: – Competitiva; – Incompetitiva; – Mista ou não-competitiva. Inibição Reversível Competitiva Estrutura semelhante à do substrato Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima E + S ES E + P EI + I Inibição Reversível Competitiva Enzima Sítio Ativo IC S S IC IC IC IC S P P S S S S S S S P P P P Inibição Reversível Competitiva [substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente afinidade da enzima pelo substrato Na presença do inibidor competitivo Km da enzima Inibição Reversível Competitiva Intoxicação por Metanol: Metanol Álcool desidrogenase Infusão EV Etanol URINA Formaldeído Inibição Reversível Incompetitiva Não se Liga ao Sítio Ativo da Enzima Liga-se ao Complexo ES E I S I S I S S E I S S Inibição Reversível Incompetitiva Vmax, Km igualmente Quantidade de enzima livre, não-complexada Na presença do inibidor incompetitivo Inibição Reversível Mista Liga-se tanto ao Sítio Ativo da Enzima como a Outro Sítio Liga-se ao Complexo ES e à Enzima Livre Inibição Reversível Mista [substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente afinidade da enzima pelo substrato e a quantidade de enzima livre Na presença do inibidor misto Km da enzima Vmax
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