aula 22 Terapia gênica

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Terapia Gênica 
Biotecnologia Molecular Farmacêutica
Geraldo Renato de Paula
 possibilidade de modificar o genoma do homem;
 após a descrição genética;
 talvez signifique o último nível de busca do autoconhecimento:
1: grandes filósofos- relação do homem consigo mesmo e com o ambiente;
2: perspectiva da escala evolutiva e o interior o psíquico revelado;
3: nível molecular – identificação única de cada indivíduo;
 conhecimento genes responsáveis por causar doenças; 
 este conhecimento cresce diariamente; 
 nova abordagem na terapia de doenças.
Terapia gênica: consiste na introdução de genes que produzirão produtos terapêuticos nos indivíduos portadores de doenças genéticas ou outras; 
“ Podemos antecipar o cultivo in vitro de células germinativas e manipulações tais como a substituição de cromossomos e segmentos. A aplicação final da biologia molecular será o controle direto de sequências nucleotídeos nos cromossomos humanos, combinados ao reconhecimento, seleção e integração dos genes desejados” Lederberg 1963.
1970 primeiro experimento de engenharia genética em humanos;
Década de 1970, fortemente marcada por discussões sobre segurança; 
Várias questões ainda necessitam ser melhor esclarecidas:
Como as células alvos para a correção serão acessadas?
Como o gene terapêutico será entregue?
Qual a proporção de células alvo terão que adquirir o gene para controlar a doença?
A transcrição do gene terapêutico necessita ser precisamente controlada para ser efetiva?
A superexpressão do gene poderá causar problemas fisiológicos?
As células modificadas serão mantidas indefinidamente ou novas aplicações serão necessárias? 
Protocolo: 
1: isolamento do gene e seus elementos reguladores
2: inserir este gene em um vetor
3: inserir o vetor no indivíduo doente;
Importante: 
In vivo: o gene é inserido diretamente no organismo;
 ex vivo: células são retiradas, modificadas, cultivadas e reintroduzidas no indivíduo;
 a definição do protocolo irá depender da doença: 
Quando a doença afeta um órgão específico este deve ser tratado diretamente;
 quando a doença tem efeito sistêmico, os alvos comuns são fígado (intensa atividade metabólica) e o músculo (facilidade de acesso);
 doença monogenética recessiva: apenas há expressão do gene funcional e na maioria das vezes em baixo nível;
 doença monogenéticas dominantes: requer o silenciamento do gene anormal.
 J. Biosci. 39(3), June 2014, 537–541.
Estratégias de tratamento: 
1- doenças derivadas da ausência de ptn funcional (genéticas clássicas) Ex: hemofilia, Fibrose cística, anemia falciforme, etc;
- Adição in vivo ou ex vivo do gene “normal” sob o controle de reguladores para produção de ptn terapêutica.
2- proliferação celular anormal: câncer
 Introdução nas células neoplásicas de gene suicidas;
 genes codificadores de toxinas;
 genes que codificam citocinas que ativam o sistema imune, que o capacita ao combate de células tumorais;
3- presença de ptn anormal dominante Ex: leucemia mielóide crônica, oncogene BCR/ABL atividade enzimática alterada;
- Estratégia ablativa – bloqueia a expressão do oncogene por RNA antisense.
Estratégias de tratamento: 
4- Doença infecciosa –viral: AIDS
 RNA que interfere com a proliferação viral;
5- Vacinas de DNA
Obs: benefícios reais até o momento são frustrantes
 Métodos de transferência devem ser aprimorados;
Métodos físicos e químicos de transferência gênica:
 Microinjeção do DNA nu (vetor plasmidial diretamente no músculo), pouco eficiente, utilizado em vacinas;
 Biobalística: DNA é liberado lentamente e pode apresentar bons níveis de expressão;
 limitação: uso clínico limitado a superfícies expostas;
Eletroporação: não está bem estabelecido para terapia gênica;
 Lipossomos ou outros polímeros catiônicos: baixa eficiência, alta segurança, baixo custo, DNA de grande tamanho.
Vetores:
 os vetores podem ou não se integrar ao genoma da célula alvo;
 apresenta maior ou menor estabilidade;
 plasmidial: o gene é inserido em um plasmídio de expressão em eucariotos, promovendo a síntese da ptn desejada nas células ou tecidos;
 Viral: o transgene substitui regiões gênicas dos vírus;
As sequências substituídas quase sempre são responsáveis pela patogenicidade do vírus; 
 esses vetores são ditos atenuados ou incapazes de causar doença;
 DNA linearizado – pouco estável;
 DNA mitocondrial;
 cromossomo artificial
Vetor ideal:
 capacidade de acomodação do transgene de tamanho ilimitado;
 baixa imunogenicidade e citotoxicidade;
 expressão estável;
 direcionamento para tipos celulares específicos;
 baixo custo;
 fácil produção e manipulação;
 possibilidade regular a expressão do gene exógeno;
 ainda não existe
Vetores retrovirais:
Vantagem de inserir o seu genoma no genoma da célula, gerando estabilidade ao transgene;
 contudo a inserção é aleatória;
 partícula frágil, dificultando manipulação e a obtenção em altos títulos, só infecta células em divisão;
 infecção viral ocorre através do reconhecimento de receptores na superfície celular pelas glicoptns, o nucleocapsídeo contendo o genoma diplóide (RNA) penetra no citoplasma celular;
Ocorre então transcrição reversa formando DNA dupla fita, em que os genes do vírus são flanqueados por sequencia repetitiva longa (LTR);
 esse genoma é então integrado ao genoma celular pela integrase;
 possui a sequência empacotadora psi.
Adenovirus:
 São muito eficientes em infectar uma grande quantidade de tecidos;
 não possui envelope e sua partícula é muito estável;
 pode inserir uma grande quantidade de DNA;
 desvantagens é que não se insere no genoma da célula, e gera resposta imune no tecido transfectado.
Adeno-associados:
São vírus defectivos e dependem da co-infecção com um vírus auxiliar;
 característica marcante é se inserir em ponto específico do cromossomo 19;
 desvantagem é que seu genoma é pequeno não permitindo a inserção de grande quantidade de DNA.
Herpes-virus:
- Tropismo pelas células neuronais, além da latência que levaria estabilidade a expressão;
- Desvantagem é tendência a destruir as células infectadas 
 Vetores não virais apresentam 2 principais limitações:
1- frequência de transfecção é menor;
2- a duração da expressão gênica é menor 
- Resultados animadores no tratamento de distrofia muscular em camundongos. 
- Aumento da massa muscular dos camundongos por mais de 2 anos após uma única aplicação
Terapia gênica de melanoma:
Estimulação do sistema imune do paciente;
Alta letalidade em estágios em que há formação de metástase;
Nestes caso de 10 a 20% desses tumores respondem a imunoterapia;
 ensaio clínico envolvendo 10 pacientes no estágio IV, foi realizada a transferência do gene HLA-B7 (MHC), que estimula a migração linfócitos T;
 resultou na expressão da ptn que limitou o crescimento do tumor e houve remissão parcial em parte dos pacientes.
Terapia gênica cardiovascular:
Início em 1994 e aumentando ao longo dos anos;
 diversas enfermidades;
 fator que favorece a abordagem é que o transgene não necessita ser expresso por longos períodos;
 a expressão transitória suficiente para gerar uma resposta biológica, como crescimento de vasos colaterais pode ser suficiente;
 os mais empregados são VEGF (vascular endothelial growth factor) e FGF (fibroblast growth factor) ambos são potentes estimuladores de desenvolvimento de células endoteliais;
 baixo índice de mortalidade observado (9 de100 pacientes com isquemia crítica e 3 em 85 com isquemia do miocárdio), nenhuma das mortes foi atribuída ao procedimento.
Terapia gênica Hemofilia A:
Níveis deficientes de fator VIII,
 baixos níveis de expressão são suficientes para corrigir o quadro clínico;
 fibroblastos obtidos por biópsia de pele são cultivados in vitro e transfectados com um plasmídio contendo o gene;as células que passam a expressar o fator VIII, são selecionadas, expandidas in vitro sendo posteriormente administradas aos pacientes;
 resultados correção do quadro clínico em parte significativa dos pacientes.
Terapia gênica da Fibrose cística :
É uma das doenças genéticas mais frequentes (1:2500 nascimentos);
 disfunção das glândulas exócrinas, que produzem secreções mais espessas;
 no pulmão, essas obstruem a passagem de ar e retêm bactérias, facilitando as infecções bacterianas;
 no trato gastrintestinal, a falta de secreção adequadas comprometem o processo digestivo;
 o gene CFTR (cystic fibrosis transmebrane conductance regulator) codifica uma ptn que regula a transferência de cloreto e sódio pela membrana;
 transferência mediada por lipossomos através de spray nasal com resultados positivos de expressão e restabelecimento do transporte de cloreto normal.
Métodos biológicos de transferência gênica
Imunodeficiência combinada severa:
Transferência do gene adenosina deaminase (ADA) ex vivo para linfócitos;
 base molecular a ADA converte deoxiadenosina para deoxiinosina que é usada para a síntese de nucleotídeos;
 o acúmulo de deoxiadenosina é tóxico e leva a morte dos linfócitos;
 resultado número de linfócitos retornou ao normal e manteve-se estável por 6 meses, inclusive com desenvolvimento de RI;
 desvantagem é que a vida dos linfócitos é limitada e novas aplicações periódicas seriam necessárias levando ao alto risco de contaminação e alto custo;
 tratamento ideal seria modificação em células tronco do SI localizadas na medula óssea, onde todas as células do SI seriam modificadas expressando o gene ADA.
Câncer:
Acúmulo de mutações que leva á perda do controle do ciclo celular;
 objetivo remover o tecido tumoral do organismo;
 a estratégia é dar a este tecido propriedades especiais que possibilite a sua eliminação;
 expressar genes que chamem a atenção do sistema imune;
 tornar as células sensíveis a uma pró-droga, através da inserção de um gene suicida (timidina quinase - ganciclovir; citosina deaminase - 5-fluorocitocina);
 expressão de genes supressores de tumor levando a célula a apoptose (p53).
Phases of Clinical Trials
# Subs.
Length
Purpose
% Drugs Successfully Tested
Phase I
20 – 100
Several months
Mainly Safety
70%
Phase II
Up to several 100
Several months- 2 yrs.
Short term safety; mainly effectiveness
33%
Phase III
100s – several 1000
1-4 yrs.
Safety, dosage & effectiveness
25-30%
Phase IV
Up to 1000
Up 4 yrs
Safety
25- 30%
- Aprovada (EMA, 2012) a primeira terapia gênica para uso em humanos (Nature Biotechnology, vol 30, number 12, Dec 2012);
Tratamento de uma raríssima (300 a 500 pacientes na Europa) deficiência de lipase lipoproteína (LPL). 
Glybera (Amsterdam Molecular Therapeutics); 
 O preço do tratamento depende do peso do paciente, em média um paciente necessita de 19 vials de Glybera, a um custo de €44,000 (about $50,000) per vial.
O alto preço para tratamento não é novo na área da saúde. Recorde prévio Soliris (eculizumab), ~$540,000. 
Transplante de fígado pode custar $250,000–300,000;
 Terapia de reposição enzimáticas (ERTs) para doenças raras podem chegar a $50,000/ano,
Tratamento da hemophilia pode chegar a $100,000/ano.