Proteômica X Técnicas de Biologia Molecular

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Proteômica X Técnicas de Biologia Molecular 
Introdução
Proteoma: conjunto de proteínas codificadas pelo genoma.
Proteômica: estudo do conjunto de proteomas, que são responsáveis direta ou indiretamente pelo controle de todos ou quase todos processos biológicos. 
	“ A proteômica estuda de forma descritiva e quantitativa desde o conjunto de proteínas de uma organela subcelular até aquelas de um ecossistema, suas variações na população, mudanças em resposta a um ambiente ou decorrentes do desenvolvimento normal ou alterado, e modificações e interações com outras proteínas.”
Valledor Jorrin 
Metodologia 
Muitas das técnicas utilizadas em proteômica tem como foco a identificação de biomarcadores, mas são limitadas nas aplicações médicas diretas. Outras tem potencial para automatização e utilização na rotina clínica com propósito de diagnósticos e permitem a análise de muitos tipos de amostras e de alterações no padrão de expressão proteica associadas a uma doença.
As metodologias aplicadas em proteômica podem ser classificadas nos tipos bottom-up ou top-dwon.
O botton-up também shotgun, inclui separação por cromatografia líquida dos peptídeos obtidos após digestão tríptica de soluções proteicas complexas, seguidas de análise por espectrometria de massa. 
O top-dwon, ao contrário, é um processo no qual as proteínas intectas ( e não os peptídeos) são submetidas a análise por espectrometria de massa. 
As abordagens botton-up possuem muitas vantagens, como sensibilidade e reprodutibilidade, mesmo para proteomas complexos como os de soros e lisados celulares. 
Eletroforese Uni e Bidimensional
Inicialmente isoladas de matérias biológicos
Eletroforese Unidimensional
Eletroforese Bidimensional: duas etapas
100 a 2.000 spots(pontos)
Coloração: Azul de Coomassie, nitrato de prata entre outros. 
Limitações :concentração de proteínas ,dificuldade de extração de proteína intacta para analise top-down
Fracionamento de Peptídeos
Moléculas peptídicas são ionizadas utilizando métodos diferentes.
Cada peptídeo gerará diversos picos devido a presença de isótopos na molécula. De modo geral, considera-se a massa monoisotopica, como medida de massa da molécula para medida de massas posteriores.
Espectrometria de M/S
A fragmentação dos peptídeos tende a ocorrer na ligação peptídica fazendo com que se formem íons da série b e y.
Métodos de Ionização
MALDI (ionização a laser assistida por matriz)
ESI (ionização por electrospray)
MALDI
Ácidos aciano 4hidroxinâmico
SELDI (ionização de dessorção por laser de superfície melhorada)
IMS (espectrometria de massa por imagem)
ESI
Tipos de Analisadores
MALDI
 ionização por dessorção-liberação de uma subs através de uma superfície- a laser assistida por matriz.
Espectrometria de massas de TOF (time of flght- tempo de vôo) 
Componentes ionizados, são direcionados para o tubo a vácuo, onde serão separadas de acordo com sua massa e carga (m/z).
MALDI-TOF
Eletroforese 2D
É feita em gel de poliacrilamida, em função da separação de partículas pequenas (n) e proteínas.
Determina propriedades críticas da proteína, como ponto isoelétrico (pH neutro) e uma aproximada massa molecular.
Consiste na mobilidade das proteínas, quando expostas á um campo elétrico, após aplicação de voltagem, de acordo com sua massa/ carga.
1.500 a 2.500 manchas em um gel
Cromatografia líquida de alta eficiência
 HPLC – high performancy liquid chromatopgraphy 
Separa misturas complexas, de propriedades físico-químicas diferentes (pela carga da molécula e sua hidrofibicidade- apolaridade à h2O) por cromatografia de troca iônica ou de fase reversa
Fase estacionária, onde ocorre o empacotamento de resina em uma coluna.
Despejo em solução residual após detecção;
Fase estacionária
Fase em que as moléculas se ligarão à resina de acordo com afinide.
> , irá demorar para atravessar a coluna e provocará mistura de partículas presentes na coluna. (podem ser monitoradas em tempo real)
Pode ser acoplado ao espectrômetro, para determinação da massa.
Identificação de proteína
A eletroforese bidimensional (2D) é hoje a principal técnica na aplicação de amostras no espectrômetro de massas.
Identificação de spots através de softweres.
Espectrometria de massa: altamente sensível e requer menos materiais.
Características de determinada proteína é analisada e é identificada através de dados/ parâmetros universais de cada proteína.
Métodos Quantitativos
Espectrometria de Massa (MS)
Gel 2D
Reagentes identificáveis por MS
Métodos de quantificação livres de marcação.
Aplicação no estudo de doenças humanas
Doença da vaca louca
Surgimento:
1980 na Inglaterra (Reino Unido);
1986 a doença foi descrita por pesquisadores;
1987 a doença se alastra;
1992 a 1993, mais de 3500 casos foram registrados;
2003, 51 casos foram registrados. 
Contaminação
EEB: ingestão de alimentos ou derivados;
Tecido nervoso contaminados por instrumento.
CREUTZFELDT JACKOB: por canibalismo / animais contaminados. 
					
Sintomas
CREUTZFELDT - JACKOB DISEASE (Humanos)
Alterações comportamentais;
Alucinações;
Perda de memória;
Convulsões;
Dificuldades motoras;
Distúrbios neurológicos .
Encefalotatia espongiforme bovina (EEB)
Duração de 1 a 2 semanas;
Sinais neurológicos;
Alteração de comportamento;
Hipersensibilidade ao toque;
Hipersensibilidade a ruídos;
Ataxia.
Príons (proteína modificada)