Meios de cultura e Métodos de Esterilização

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - BACHARELADO
DISCIPLINA: MICOLOGIA GERAL
PROFA. RESPONSÁVEL: DRA. ELAINE MALOSSO
DOUTORANDA: MARCELA ALVES BARBOSA
MEIOS DE CULTURA E
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Recife,
2017
MEIOS DE CULTURA
 Robert Koch: 1880 - meios de cultura sólido (culturas puras)
 Meios de
cultura: qualitativa
+ quantitativa de
substâncias que
fornecem nutrientes
microrganismos
fora do seu meio
natural.
MEIOS DE CULTURA
 Diversidade metabólica dos microrganismos: vários tipos de meios 
de cultura para as variadas exigências nutricionais. 
Condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos
microrganismos: pH, pressão osmótica, umidade,
temperatura, atmosfera (aeróbia, micro aeróbia ou
anaeróbia)
Condições favoráveis de crescimento
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
Alguns fungos fitopatógenos não cultivados em meios de cultura
Fungos Ordem Nome Da Doença
Podosphaera leucotricha Erysiphales Míldio pulverulento da maçã
Erysiphe poligoni Erysiphales Míldio pulverulento do feijoeiro
Bremia lactucae Peronosporales Míldio brando da alface
Pseudoperonospora humili Peronosporales Míldio brando do lúpulo
Uromyces phaseoli Uredinales Ferrugem do feijoeiro
Uromyces pisi Uredinales Ferrugem da ervilha
Hemileia vastatrix Uredinales Ferrugem do cafeeiro
Ustilago maydis Ustilaginales Carvão do milho
Ustilago scitaminea Ustilaginales Carvão da Cana-de-açúcar
Importância em se Cultivar Fungos em Meios Artificiais
 Patogenicidade de um fungo fitopatógeno
MEIOS DE CULTURA
Importância em se Cultivar Fungos em Meios Artificiais
 Estudos de genética, fisiologia, bioquímica e morfológico
 Controle biológico
 Influência de fatores abióticos no crescimento e reprodução
 Efeito de substâncias tóxicas (fungicidas)
 Taxonomia clássica
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
Identificação
MEIOS DE CULTURA
 Não existe um meio de cultura universal, mas existem vários tipos
meios para diversas finalidades;
Classes:
Naturais
Composição química não definida, ex.: extratos de vegetais (malte, tomate,
peptona de soja) de animais (carne, cérebro, fígado, caseína) e de
microrganismos (levedura);
Artificiais ou sintéticos
Composição química conhecida, os seus componentes servem para suprir as
exigências nutritivas dos microrganismos.
Procedência dos constituintes 
MEIOS DE CULTURA
Consistência dos meios
 Sólidos: 1 a 2,0 % (ágar) - isolamento de colônia
 Semi-sólidos: 0,075 a 0,5 % - observação de motilidade
 Líquidos: sem agentes solidificantes - enriquecimento 
Agentes Solidificantes
MEIOS DE CULTURA
 Gelatina: proteína derivada da hidrólise parcial do colágeno
 Se liquefaz em 23°C;
 Poder ser utilizada como fonte de carbono e nitrogênio por alguns fungos;
 Está em desuso, utilizada como substrato para estudos enzimaticos.
 Silicagel (NaSiO3): substância inorgânica inerte e inatacável por
enzimas microbianas
 Alto custo;
 Dificil Manipulação.
MEIOS DE CULTURA
 Agar: polissacarídeo complexo rico em galactose, mas sem valor
nutricional, extraído de algas vermelhas marinhas (Gelidium, Gracilaria,
Pterocladia, Acanthopeltis e Ahmfeltia)
 Mais adequado e utilizado em meios de cultura;
 Não é um nutriente para a maior parte dos micro-organismos;
 Não é metabolizado durante o crescimento fúngico;
 Se liquefaz a cerca de 100ºC, mantendo-se nesse estado até aos 45ºC;
 Facilita a distribuição dos meios de cultura em outros recipientes;
 Inóculo de fungos meio fundido antes deste ser colocado em tubos ou
placas de Petri para solidificar;
 Adicionar aos meios fundidos certas substâncias termolábeis.
Agentes Solidificantes
Tipos de Agar
MEIOS DE CULTURA
 Agar: possui dois polissacarídeos: Agarose (gelificação) e Agaropectina
(viscosidade)
Tipo de Agar Concentração de Substâncias 
So4 N2 total Ca Mg Fe
Técnico1 1,7% O,1% 400 ppm 100 ppm -
Bacteriológico 1 0,9% O,1% 100 ppm 40 ppm -
Purificado2 0,7% O,1% 100 ppm 70 ppm 10 ppm
1: recomendado para meios de cultura
2: recomendado para imunoeletroforese e difusão em gel
MEIOS DE CULTURA
Funções dos meios de cultura
 Meios de pré-enriquecimento: dessensibilização de microrganismos
injuriados;
 Ex.: Água peptonada.
 Meios de enriquecimento: estimulam o crescimento de determinados
microrganismos, alguns podem inibir o crescimento de outros.
 Meios Diferenciais: contém substâncias que permitem estabelecer
diferenças entre microrganismos muito parecidos;
 Ex.: meio de Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes).
MEIOS DE CULTURA
 Seletivos: contém substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados 
grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros;
 Meios de triagem: meios que avaliam determinadas atividades metabólicas 
permitindo caracterização e identificação;
 Identificação: provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de 
organismos submetidos a identificação;
 Dosagem: empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e 
aminoácidos;
 Contagem: empregados para a determinação quantitativa da população 
microbiana;
 Estocagem ou manutenção: utilizados para conservação de microrganismos 
no laboratório - garantem a viabilidade de microrganismos.
Funções dos meios de cultura
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
 Fatores físicos: 
pH, 
temperatura, 
pressão osmótica
 pressão hidrostática
 Fatores químicos:
fontes de carbono,
nitrogênio,
hidrogênio
oxigênio,
enxofre, fósforo
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
pH
 pH ótimo encontra-se no valor médio da variação sobre o qual o
crescimento acontecerá,
 Fungos: crescem melhor em pH ligeiramente ácido;
Fungos filamentosos: 2-9 (ótimo: 5.5)
Leveduras: 2-8 (ótimo: 3.5 a 3.8)
Determinação pH
Papel indicador de pH
Potenciômetro
MEIOS DE CULTURA
Ajuste do pH
NaoH ou KOH HCl
Neutralizar Acidificar
 Ajustar antes de
adicionar Agar
 Fungos preferem pH
mais Ácido (5,5)
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
Temperatura
1. Psicrófilos – temperatura
ótima abaixo de 15 oC,
suscetíveis de crescer a 0 oC.
2. Mesófilos – temperatura
ótima 20o - 40 oC, maioria dos
patógenos humanos.
3. Termófilos – temperatura
ótima acima de 45 oC.
Fungos: mesófilos, termófilos e
psicrófilos. Maioria são mesófilos:
 Filamentosos: 0↔62ºC (ótima: 22 a
30ºC);
 Leveduras: 0↔47º (ótima: 22 a 30 ºC);
 Exceção: leveduras patogênicas entre
30 e 37ºC.
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
Pressão Osmática
 Isotônico - não há movimento de água para
dentro e para fora da célula;
 Hipertônico - água flui para fora da célula
resultando na desidratação e contração do
protoplasto;
 Hipotônico - água flui para dentro da célula, o
influxo da água força o protoplasto contra a parede
celular.
Não devem existir grandes diferenças na
concentração de solutos.
Ex: microrganismos marinhos necessitam de 
teores de sais mais elevados.
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
Pressão Hidrostática
 Água dos oceanos e lagos exercem pressão hidrostática.
 Bactérias barófilas: vivem em alta pressão “profundidade”.
Shewanella benthica
MEIOS DE CULTURA
 Macronutrientes (C, N, H, O, S, P).
 Carbono: um dos elementos mais importantes para o crescimento
microbiano.
Fatores necessários ao crescimento 
Carbono
 Fonte de carbono:
Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
 carboidratos
 lipídeos proteínas
 Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): 
Forma mais oxidada do carbono, a fonte de energia deve vir da luz ou
compostos inorgânicos.
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
 Fonte de Nitrogênio:
elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
 moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)
 moléculas inorgânicas (NH3, NO3
-, N2)
A capacidade de algumas
bactérias em utilizar o
nitrogênio atmosférico
(FBN) é de fundamental
importância para a vida
de todos os seres.
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
 Hidrogênio:
Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos
(água, sais e gases)
 Função:
 Manutenção do pH
 Formação de ligações de H entre moléculas 
 Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração
 Oxigênio:
 Aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos
 É obtido a partir das proteínas e gorduras.
Oxigênio molecular (O2), requerido por muitos para os processos de 
geração de energia.
 P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP
 S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas
 K – Atividade de enzimas
 Mg– Estabilidade dos ribossomos
 Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos
 Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos.
Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal.
 Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das
proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
 Outros macronutrientes:
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
 Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)
 Nem sempre sua adição é necessária
 Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura
podem apresentar deficiências desses elementos.
Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte
o N2 para NH3 durante a FBN.
MEIOS DE CULTURA
Fatores necessários ao crescimento 
 Outros componentes:
Metais em quantidades muito pequenas, necessários na 
composição de um meio de cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
MEIOS DE CULTURA
Usos do Meio Sólido em Micologia
 Estudos morfológicos
 Estudos sobre esporulação e germinação de esporos
 Isolamento de amostras ambientais
 Estudos sobre crescimento e atividade enzimática
Aspergillus niger, colônia em MEA. Aspergillus niger, conídios e conidióforo
Fonte: http://www.pfdb.net/html/species/s12.htm
Etapas de Preparação de Meio de Cultura
Dissolver as 
substâncias
Ajustar o pH e 
adicionar o ágar
Distribuir em 
Frascos Adequados Esterilizar
MEIOS DE CULTURA
MÉTODOS DE 
ESTERILIZAÇÃO
Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle 
do Crescimento Microbiano
 Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida
presente em determinado material ou ambiente.
 Desinfecção – Inativação ou redução do número de micro-
organismos presentes em material inanimado.
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Agentes Mecanismo de ação
Fenóis e derivados (fenol) desnaturação de proteínas
Álcoois (metílico, etílico, propílico - solvente para lipídios
- desnatura proteínas
Compostos de cloro (hipoclorito de sódio, 
cloramina, cloro)
- se combina com proteínas
- agente oxidante
Tintura de iodo e permanganato de 
potássio
agentes oxidantes
Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular
- altera permeabilidade celular
- diminui tensão superficial
Desinfecção
Métodos de Esterilização Físicos
Calor seco (estufa)
Calor úmido (Vapor sob pressão – autoclaves)
Radiação (Gama – Cobalto 60, Cobalto Ultravioleta)
Métodos de Esterilização Químicos
Óxido de Etileno (ETO)
Peróxido de Hidrogênio
Ácido Peracético
Formaldeído
Glutaraldeído
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Flambagem:
Métodos físicos
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
 Método simples;
 Alça de platina;
 Fácil execução
Calor seco
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos físicos
Incineração:
Vantagem:
Redução drástica de massa e volume a ser descartado;
Recuperação de energia;
Redução do impacto ambiental;
Esterilização dos resíduos.
Desvantagem:
Custo elevado de instalação e operação;
Exigências de mão-de-obra qualificada;
Presença de materiais nos resíduos que geram compostos tóxicos e
corrosivos.
Calor seco
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Ar quente ou Estufa
Temperatura - Tempo
171°C - 60 minutos
160°C - 120 minutos
149°C - 150 minutos
141°C - 180 minutos
121°C - 12 horas
Métodos físicos Calor seco
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos físicos Calor úmido
 Utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa destruir formas
vegetativas e esporuladas (100ºC/20min. Durante 3 dias
consecutivos).
Esterilização Fracionada - Tindalização
Aparelho de Banho-Maria
Filtração
 Filtros bacteriológicos – empregados para esterilizar materiais
termolábeis como soro, enzimas. São filtros de materiais diversos
como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto.
Filtros de Membrana tipo Millipore
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos físicos
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos físicos
 Gravitacional – vertical  Alto vácuo - horizontal
Esterilização por vapor
Autoclaves:
Funcionamento de uma autoclave
A - resistência B – cesto e tampa
E – registro da 
temperatura e pressão
D – chave de comandoC – válvula de ar
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos físicos Radiação ionizante
 Utiliza baixas temperaturas;
Radiação Beta:
Desintegração natural de elementos como o Iodo 131;
Radiação Gama:
Desintegração de certos elementos radioativos – Cobalto 60;
 Aplicações:
 Pode ser utilizado em materiais termossensíveis - artigos descartáveis 
(fios de sutura, luvas, seringas, tubos, algodão e outros);
 Alto poder de penetração
Métodos físicos Radiação não-ionizante
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
 Luz ultravioleta;
 Não tem poder de penetração;
 Aplicação: destruição de microrganismos do ar ou inativação
destes em superfície;
Câmara de fluxo laminar
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos químicos Óxido de Etileno (ETO)
 Gás incolor;
 Altamente inflamável;
 Miscível com água; C2H4O 
 Aplicação: produtos médico-hospitalares que não podem ser expostos ao 
calor.
 Desvantagens: 
 toxicidade;
 efeito carcinogênico, mutagênico e teratogênico;
 custo elevado;
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos químicos Agentes oxidantes
Peróxido de hidrogênio
 Água oxigenada concentração de 3 a 6% poder desinfetante e
esterilizante pode ser corrosivo para instrumentais;
 Ação: ataque da membrana lipídica, DNA e outros componentes das
células, radicais livres tóxicos;
 Possui baixa toxicidade;
 Cuidados:
Corrosivo;
limpeza prévia (material a ser esterilizado);
solução deve ser utilizada logo;
não usar em cobre, zinco, alumínio e bronze.
 Aplicação: desinfecção de lentes de contato e nebulizadores, capilares 
hemodializadores. 
Métodos químicos Ácido Peracético
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
 Produto tóxico e corrosivo;
 Ação esporicida em temperaturas baixas;
 Aplicação: materiais termossensíveis, tem que ser mergulhados no
líquido; materiais de alumínio anodizado não podem sofrer este processo de
esterilização.
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos químicos Aldeídos
Formaldeído:
 Gás incolor;
 Odor irritante; 
 Cáustico para a pele;
 Ação lenta;
 Concentração de 5% - 6-12 horas (bactericida); e 8% - 18 horas
(esporicida);
 Função fungicida, virucida e bactericida;
 Aplicação: cateteres, drenos e tubos de borracha, náilon, teflon, PVC e
poliestireno; artroscópios,ventriloscópios, enxertos de acrílico - apenas na
formulação aquosa.
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Métodos químicos Aldeídos
Glutaraldeído:
 Solução aquosa pH ácido (não esporicida);
 Formulações encontradas são:
solução ativada: (pH 7,5 a 8,5), atividade esporicida;
solução potencializada: pH de 3,4 a 3,5, função esporicida baixa;
 Ação: biocida, bactericida, virucida, fungicida e esporicida.
 Aplicação: esterilização de materiais termossensíveis, como: enxertos
de acrílico, cateteres, drenos e tubos de poliestireno; desinfecção de
alguns equipamentos endoscópios, entre outros.