Aula PURIFICAÇÃO

Prévia do material em texto

MICOLOGIA GERAL
Métodos Usados na Purificação, Identificação e 
Preservação de Fungos
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - BACHARELADO
Recife, 
2017
Professora responsável: Dra. Cristina M. S. Motta (UFPE)
Doutoranda: Marcela Alves Barbosa (UFPE)
Purificação de Culturas
 Eliminar micro-organismos contaminantes do fungo em estudo a fim 
de se obter culturas puras.
 Aplicações em estudos de taxonomia, fitopatologia, bioquímica,
fisiologia, genética, citologia.
Purificação de Culturas
1. Técnica da Lamínula
2. Técnica do Abaixamento de pH
3. Técnica da Cultura Monospórica
4. Técnica do Meio Seletivo
5. Técnica da Adição de Inibidores
Purificação de Culturas
1.Técnica da Lamínula
 Cultura de fungo contaminada por Bactérias
Esporos ou fragmentos 
do micélio
BDA 
 Variação da Técnica da Lamínula
Placa com meio de 
Cultura
3 mm
Cultura contaminada 
com bactéria
3 mm
Furador
2. Técnica do Abaixamento do pH
 Fungos Suportam melhor o pH ácido
3 a 5 gotas
Ácido Lático a 25%
100 mL de Meio de Cultura
 Ajuste do pH do meio de cultura
3. Técnica da Cultura Monospórica
 Eliminar um fungo contaminante da cultura fúngica que se deseja
trabalhar
Água Destilada 
Esterilizada
3. Técnica da Cultura Monospórica
 Eliminar um fungo contaminante da cultura fúngica que se deseja
trabalhar
4. Técnica do Meio Seletivo
 Fungos da ordem Mucorales
Placa Contaminada com Rhizopus sp. Cultura de Mucor sp.
Microestruturas de Rhizopus sp. Microestruturas de Mucor sp.
4. Técnica do Meio Seletivo
Uso do Meio Malt-Salt Agar (MAS): Possui NaCl que possui as seguintes
funções:
 Inibe o crescimento bacteriano;
 Retarda o crescimento de outros fungos, como os Mucorales;
 Retarda, mas não inibe completamente, o crescimento de muitos outros
fungos permitindo, assim, o isolamento de espécies que crescem mais
lentamente.
5. Técnica da Adição de Inibidores
 Culturas contaminadas com bactérias
Uso de Antibióticos
 Método barato
 Rápido
 Eficiente
Outros Agentes Químicos Inibidores
Substância Organismo Característica
Fungo Bactéria
Clortetraciclina - + Inibe bactérias G+ e G-. Adicionar pós 
autoclavagem
Cristal Violeta - + Inibe Bactérias G-
Ciclo Heximida + - Inibe alguns fungos filamentosos e 
leveduras, mas pouco efeito sobre fungos 
patógenos humanos
Ácido Lático - + Acidifica o meio
Verde Malaquita + - Seleciona Fusarium sp
Nistatina (micostatina) + - Inibe muitos fungos exceto Pytium sp.
Penicilina ? + Inibe Bactérias G+
Polimixina (sulfato) - + Inibe Bactérias G-
Rosa de Bengala ± + Inibe a maioria das Bactérias e reduz o 
crescimento fungico
Estreptomicina - + Maioria das bactérias (meio neutro a 
ligeiramente alcalino). Pós autoclavagem
* sinais +, -, ± e ? indicam,respectivamente, inibição, sem efeito, mais ou menos e sem informação.
Identificação de Fungos 
Taxonomia - construção
de um esquema de
classificação conveniente
para os organismos.
A Taxonomia Envolve
 Identificação, atividade de reconhecer que um organismo, sob estudo,
é similar a organismos previamente caracterizados;
 Classificação, arranjo dos fungos com características morfológicas
similares, principalmente, em grupos, e
 Nomenclatura, denominação de um fungo de acordo com as regras
estabelecidas no Código Internacional de Nomenclatura Botânica.
Taxonomia Requer
 Conhecimento das Características Morfológicas
Chaves de 
Identificação
Identifica
Classifica
A taxonomia visa ordenar a diversidade e
arranjar os inúmeros fungos em uma forma
coerente, inteligível e útil.
Identificação
 Exame direto das estruturas fúngicas,
 Cultivo em meios de cultura adequados,
 Uso de microscópio para verificar determinadas características
morfológicas
 Dados da cultura e colônia fúngica,
 Chaves de identificação para fungos.
Identificação
 Utilização de técnicas especiais para evidenciar algumas
características morfológicas ou mesmo bioquímicas;
 Podem ser utilizados caracteres biológicos e/ou fisiológicos
(capacidade de um fungo infectar hospedeiros, patogenicidade);
 Citológicos, genéticos, sorológicos, cromatográficos e eletroforéticos.
Técnicas Utilizadas para Identificação de Fungos
1. Técnica do Exame Direto
2. Técnica do Cultivo em Meio
3. Cultura em Lâmina (Método de Riddell)
4. Cultura em Gota Pendente
5. Cultura em Membrana de Diálise
6. Provas Bioquímicas
1. Técnica do Exame Direto
Lactofenol-azul de algodão
Azul de Amann
Características Observadas
 Tamanho, forma e cor dos esporos,
 Presença ou ausência de septos nos esporos e no micélio,
 Tamanho, cor e forma dos conidióforos,
 Esporos formados dentro ou fora de determinadas estruturas, etc..
 Presença de Estruturas Vegetativas Especializadas (Clamidósporo,
Esclerócio, Estolões, Rizóides)
Syncephalastrum sp.
1. Técnica do Exame Direto
Lactofenol-azul de algodão
Ou Solução de Glicerina a 5%
Cultura de Levedura:
(Rhodotorula sp.)
A Técnica do Exame Direto Somente é feita quando o material permitir a
visualização de crescimento fúngico ou, mesmo, quando o material doente
apresentar características de infecção fúngica.
Folha de Café com Ferrugem
Pão Contaminado
Pano Branco
a) Colocar uma gota do corante Azul de Amann em uma lâmina seca;
b) Pegar um pedaço de fita adesiva transparente de 9 cm e segurar entre
os dedos com a face aderente para fora;
c) Tocar a área contendo a colônia fúngica, para que ocorra a adesão das
estruturas na fita adesiva;
c) Transferir a fita adesiva, com a face aderente para baixo, para a lâmina
com o Azul de Amann, ao mesmo tempo em que estica a fita e pressiona
as suas extremidades para fixá-la na lâmina. A fita funciona como uma
lamínula;
d) Retirar o excesso do corante com papel de filtro e observar as estruturas
fúngicas ao microscópio ótico;
e) Para tornar a lâmina permanente, as suas margens devem ser vedadas
com esmalte incolor.
1. Técnica do Exame Direto
2. Técnica do Cultivo em Meio
Aspergillus sp. em Czapek’s Solution Agar (CZ)
Determinadas espécies de fungos requerem meios específicos para a sua
identificação.
Dados significativos para identificação
1. Caracteres em meio sólido:
a. período de tempo antes do crescimento ser notado
b. velocidade de crescimento
c. textura da cultura
d. cor do micélio vegetativo e do corpo de frutificação
e. crescimento superficial e/ou em profundidade
f. modificações provocadas no meio de cultura
g. morfologia e características do micélio, conidióforo e esporos
2. Caracteres em meio líquido:
a. crescimento na superfície (anel ou película)
b. crescimento em profundidade (turvação do meio)
c. formação de sedimentos (nulo, abundante, escasso, etc.)
3. Cultura em Lâmina ou Microcultivo
Apresenta Vantagem de permitir observar as estruturas, nas posições
relativas que realmente ocupam durante o crescimento fúngico.
Esquema de cultura em lâmina de acordo com Riddell.
A – Adição da lamínula esterilizada sobre o
inóculo do fungo em Ágar Czapek;
B - Adição da lamínula esterilizada sobre o
inóculo do fungo em Ágar Czapek;
C – Cultura com 7 dias a temperatura ambiente
(28 ± 2ºC).
A
B
C
3. Cultivo de Penicillium aurantiogriseum sob lamínula 
3. Cultivo de Penicillium aurantiogriseum sob lamínula 
Retirar a lamínula e invertê-la ao montar em lâmina contendo líquido de
montagem ou, simplesmente, um corante.
Inverter a Lamínula
4. Cultura em Gota Pendente
Técnica muito utilizada para estudar a germinação de esporos,anastomose, brotamento, septação e outros caracteres.
Placa de Petri
Papel de Filtro
Bastão de Vidro
Lâmina
Anel de Vidro
Solução de
Nutrientes
Lamínula
Vaselina
5. Cultura em Membrana de Diálise
Membrana de diálise ou
papel celofane são
depositados em placa
contendo água destilada e
autoclavados.
O fungo é inoculado em placa com
meio de cultura e os quadrados de
membrana/celofane são dispostos
ao redor do ponto de inoculação.
6. Provas Bioquímicas
 Características mais importantes para identificação de leveduras
 Alterações produzidas no meio pela ação do fungo, no reconhecimento
de metabólitos produzidos ou apenas na modificação provocada no
meio de cultura.
 O valor taxonômico de cada uma destas provas isoladamente é por
vezes limitado e, somente o resultado de várias provas, consideradas
conjuntamente, permitem a identificação mais precisa dos fungos.
6. Provas Bioquímicas
 Prova de Assimilação (Auxanograna para carbono)
 Prova de Fermentação (Zimograma)
 Requerimentos Vitamínicos
 Redução de Nitratos
 Crescimento em Etanol
 Outras Provas Bioquimicas
Prova de Assimilação (Auxanograna para carbono)
M
L
G
D
R
S
A
D- dextrose
R- rafinose
G- galactose
L- lactose
S- sacarose
M- maltose
Meio Yeast Nitrogen Base (YNB, meio completo sem fonte de carbono
Prova de Assimilação (Auxanograna para carbono)
Várias fontes de nitrogênio (nitrato, nitrito ou amônia) da mesma forma
descrita para os açúcares. Neste caso, é utilizado o meio Yeast Carbon
Base (YCB, meio completo sem fonte de nitrogênio).
S N
B
S- sulfato de
amônio
N- nitrato de
potássio
Prova Fermentação (Zimograma)
Verificar a ocorrência de fermentação de vários açúcares, com produção
de gás, CO2, e de substâncias que podem alterar o pH do meio de cultura.
Para este teste o meio utilizado é o YNB com 2% de glicose.
Requerimentos Vitamínicos
O crescimento de alguns fungos em meio sem a adição de vitaminas é
considerado uma característica importante para a sua identificação.
Solução de Vitamin-Free
Yeast Base (VFYB).
O Após 4 a 7 dias o crescimento
pode ser avaliado de acordo com
uma escala de turbidez.
Reinoculação em (VFYB).
Avaliação da capacidade 
em produzir suas próprias 
vitaminas
Redução de Nitratos
Alguns fungos podem reduzir o nitrato a nitrito, amônia ou nitrogênio livre.
Teste de Urease
Crescimento em Etanol
 Tubos contendo YNB com 4% de etanol
são inoculados com a levedura a ser
testada, para determinar a capacidade
de crescer utilizando etanol como única
fonte de carbono.
 O crescimento é verificado de acordo
com uma escala de turbidez. Verifica-
se, também, a ocorrência de formação
de película, anel ou sedimentos.
Outras Provas Bioquímicas
 Algumas reações químicas podem ser utilizadas para determinar
diferenças entre basidiomicetos que apresentam basidiomas grandes.
 Entre os reagentes utilizam-se ácidos (H2SO4, HCl, HNO3), base
(KOH), reativos iodados (lugol, reativo de Melzer), solução de sulfato
ferroso a 10% e outros.
Métodos de Preservação de Fungos
Meio de cultura
Deve ser específico para cada cultura de fungo
EX: Espécies de Aspergillus e Penicillium - Ágar Czapek
EX: Espécies de Fusarium e Dematiacaeo - Ágar Batata 
Dextrose
EX: Mucorales - Ágar Malte e Ágar Batata Dextrose
Condições ótimas de crescimento das culturas
Temperatura
Deve ser adequada para cada cultura de fungo
Mesofílicos - 15 a 30ºC
Termofílicos – ≥45ºC
Psicrofílicos - ≤20ºC
Condições ótimas de crescimento das culturas
Luz
Com luminosidade
Sem luminosidade
Algumas culturas esporulam próximo a luz ultra violeta
Algumas culturas para esporular requerem períodos com e sem 
luminosidade
Condições ótimas de crescimento das culturas
Aeração
Condições ótimas de crescimento das culturas
A maioria dos fungos são aeróbios, obtendo em cultura, o
oxigênio disponível dentro dos tubos ou garrafas.
pH
A maioria dos fungos crescem bem numa faixa de 
pH entre 3 e 7.
Condições ótimas de crescimento das culturas
Atividade de Água
A maioria dos fungos necessitam de água disponível;
Algumas espécies crescem bem em baixa atividade de água.
Ex: Espécies de Eurotium, Xeromyces bisporus.
MÉTODOS DE PRESERVAÇÃO
Liofilização
Imersão em óleoSubcultivo
CriopreservaçãoDesidratação
Imersão em água
SUBCULTIVO ou Repique contínuo
Transferência para um meio 
sólido ou líquido
Estoque em condições 
favoráveis
Cultura
REATIVAÇÃO
 
Remover uma pequena porção 
da cultura para outro meio de 
cultura e aguardar crescimento
 
DESVANTAGENS
Perigo de variação
Perda da 
patogenicidade
Perda das 
características 
fisiológicas ou 
morfológicas
Contaminações por 
esporos do ar ou 
levadas por ácaros
Supervisão constante
VANTAGENS
Método barato Rápido 
crescimento da 
cultura
Viabilidade da 
Coleção por 
muitos anos 
IMERSÃO EM ÓLEO MINERAL – Sherf, 1943
Cultura viável 
Imersa em óleo 
mineral 
esterilizado
Reativação 
Deve cobrir a 
colônia e o meio 
de cultura
Remoção de parte 
da colônia 
Para placa de Petri com 
meio sólido específico
Para caldo 
glicosado 
Meio sólido 
específico
Cultura 
preservada 
em óleo 
mineral
 
REATIVAÇÃO DAS CULTURAS
Cultura em caldo 
glicosado (28º±2ºC) 
com até 10 dias
Cultura em 
meio de cultura 
adequado
VANTAGENS
Diminui a 
atividade 
metabólica 
Reduz a 
desidratação
Viabilidade longa em 
algumas espécies
Algumas espécies só 
sobrevivem a este 
método
Não requer 
equipamentos
As culturas não são 
infestadas por ácaros
DESVANTAGENS
Seleção natural 
devido às 
condições adversas 
Contaminação por 
esporos do ar
Crescimento lento 
na reativação
Estoque em óleo mineral sob ágar inclinado (Smith & Onions, 1994).
IMERSÃO EM ÁGUA 
Castellani (1939)
Suspensões de 
células 
Blocos de 6mm da 
cultura Discos de cultura
Imersos em água destilada 
esterilizada contida em tubos 
de McCartney
Cultura viável 
REATIVAÇÃO
Cultura viável
CULTURAS ESTOCADAS SOB ÁGUA DESTILADA ESTERILIZADA
Remover um bloco de 
aproximadamente 6 
mm da cultura
Transferir o bloco 
para água 
destilada 
esterilizada e 
lacrar o tubo
REATIVAÇÃO
Cultura sob água 
destilada 
esterilizada
CULTURAS ESTOCADAS SOB ÁGUA DESTILADA ESTERILIZADA
Remover um bloco e 
colocar com o micélio para 
baixo, em um meio de 
cultura específico e 
aguardar crescimento
Transferir para meio 
de cultura específico 
contido em tubo de 
ensaio
VANTAGEM
Baixo custo
DESVANTAGEM
Viabilidade Perda da patogenicidade
em algumas culturas
 Adicionar a suspensão (± 1ml) de esporos ao gel gelado e agitar;
DESIDRATAÇÃO
 Distribuir cristais de sílica gel em frascos com tampa de rosca e
esterilizar por calor seco (170ºC/1h);
Sílica gel – Perkins, 1962
 Preparar uma suspensão de esporos, de culturas com boa
esporulação, em leite desnatado a 5% (w/v) gelado (4ºC);
Recuperar a cultura espalhando alguns cristais sobre a superfície
de um meio.
 Resfriar os frascos em banho de gelo por 30 a 40 minutos;
 Manter em banho de gelo por 2 a 4 dias para secagem dos
cristais;
 Rosquear as tampas dos frascor e manter a 4ºC;
REATIVAÇÃO
Cultura sob sílica 
gel
CULTURAS ESTOCADAS SOB SÍLICA GEL
Transferir poucos cristais 
de sílica para a superfície 
de um meio específico e 
aguardar crescimento
Transferir para meio 
de cultura específico 
contido em tubo de 
ensaio
Evita ataque de 
ácaros pelas 
condiçõessecas
Vários inóculos 
podem ser obtidos de 
um único tubo
Estabilidade das 
culturas
VANTAGENS
Método barato 
e simples
Ampla variedade de 
fungos esporulantes 
incluindo 
representantes dos 
Basidiomycota
DESVANTAGENS
Contaminações por esporos do ar 
por repetidas repicagens
Limitado para fungos esporulantes não sendo indicado para 
Pythium, Phytophthora e outros Oomycota, fungos micelianos e 
com esporos delicados
DESIDRATAÇÃO
 Solo autoclavado por 2 vezes;
 Suspensão de esporos (1ml) em água destilada esterilizada;
 Incubação a 20-25ºC/5-10 dias; 
 Tubos são guardados em refrigerador (4-7ºC).
1 mL da 
suspensão para 
solo autoclavado
por 2 vezes;
Tubos são 
guardados em 
refrigerador 
(4-7ºC)
Suspensão de 
esporos em 
água destilada 
esterilizada
Fechamento dos tubos
REATIVAÇÃO
Cultura em solo
CULTURAS ESTOCADAS EM SOLO
Espalhar poucos grãos 
de solo contendo o 
fungo sobre a superfície 
de um meio de cultura 
específico e aguardar 
crescimento
Transferir para 
meio de cultura 
específico contido 
em tubo de ensaio
O ataque de ácaros 
é limitado
Vários inóculos 
podem ser obtidos de 
um único tubo
Estabilidade das 
culturas
VANTAGENS
Método barato 
e simples
Viabilidade das 
culturas
DESIDRATAÇÃO
DESVANTAGENS
Os fungos que não resistem a 
desidratação, não sobrevivem bem
Variação após estoque
Contaminações por esporos do ar por 
repetidas repicagens
DESIDRATAÇÃO
DESIDRATÃÇÃO POR CONGELAMENTO
LIOFILIZAÇÃO – Raper & Alexander, 1945
 Distribuir 1 mL da solução: leite desnatado 10% (w/v) + glutamato de
sódio 5% (w/v) esterilizado por vapor fluente por 30 minutos por dois dias
em tubos de penicilina;
 Adicionar a estes tubos esporos dos fungos;
 Pré-congelamento por 12 horas;
Congelamento a -
40ºCLiofilizador
Secagem a vácuo
Leite+fungo
Esquema do processo de liofilização
Tampas dos tubos de 
penicilina evidenciando a 
abertura Antes e depois da liofilização
A B
Fontes: www.phase-technologies.com/ html/figure.html;
muse.widener.edu/ ~rpj0001/lyo/ 
REATIVAÇÃO
Cultura
liofilizada
CULTURAS ESTOCADAS SOB LIOFILIZAÇÃO
Adicionar água 
destilada esterilizada 
(≈1 mL) e aguardar 
20 min
Espalhar sobre a 
superfície de meio 
de cultura sólido 
específico e 
aguardar 
crescimento
Transferir para 
meio de cultura 
específico contido 
em tubo de 
ensaio
VANTAGENS
Não há 
contaminação
Estabilidade
Longa viabilidade
Fácil postagem 
das culturas
DESVANTAGENS
Culturas jovens 
não devem ser 
liofilizadas
Processo complexo e 
caro
Pode ocorrer 
danos genéticos
Alguns fungos não 
sobrevivem bem
CRIOPRESERVAÇÃO (Hwang, 1996)
Cultura
Nitrogênio líquido
Temperaturas -100ºC 
a -190ºC
0,5 ml Suspensão de células de fungos 
em glicerol a 10% esterilizado
Tubos de polipropileno de 2ml
Congelamento gradual (-10º min -1)até -50ºC em um 
congelador programável
VANTAGENS
Não há 
contaminação
Longa viabilidade 
principalmente abaixo de 
-130ºC
DESVANTAGENS
Culturas jovens 
não devem ser 
liofilizadas
Processo 
complexo
Pode ocorrer 
danos genéticos
Evaporação do 
nitrogênio líquido
Vários fungos 
sobrevivem bem
Alto custo
Conservação do 
vasilhame
Tanques de 
nitrogênio líquido
Cuidados ao retirar as culturas preservadas em nitrogênio líquido
OOMYCOTA
SELEÇÃO DE TÉCNICAS DE PRESERVAÇÃO
 A escolha do método de preservação depende das exigências do
organismo.
 Nitrogênio líquido (-10ºC min-1); 
Óleo mineral (para algumas culturas que não sobrevivem ao estágio 
de congelamento), até 6 meses; 
 Água destilada esterilizada, até 2 anos.
*
ZYGOMYCOTA
Nitrogênio líquido; 
 Água destilada esterilizada
SELEÇÃO DE TÉCNICAS DE PRESERVAÇÃO
ASCOMYCOTA
 Nitrogênio líquido; 
 Sílica gel, poucas espécies sobrevivem: 
Ex: Neurospora crassa
Aspergillus nidulans
Penicillium griseoroseum
SELEÇÃO DE TÉCNICAS DE PRESERVAÇÃO
BASIDIOMYCOTA
.
Criopreservação abaixo de -130ºC (melhor); Transferência seriada
sobre ágar com ou sem óleo;
Nitrogênio líquido;
 Liofilização
 As espécies com parede espessa, porém a viabilidade é baixa;
 Lascas de madeira: micélio das espécies que habitam a madeira.
SELEÇÃO DE TÉCNICAS DE PRESERVAÇÃO
Ferrugens
 Nitrogênio líquido (sobre o hospedeiro ou os esporos podem ser
coletados);
 Liofilização (quando os esporos podem ser coletados)
SELEÇÃO DE TÉCNICAS DE PRESERVAÇÃO
Anamorfos (Fungos imperfeitos)
 Liofilização;
 Aspergillus, Paecilomyces e Penicillium, em ágar inclinado a -18ºC 
por 6 meses a 2 anos; 
 Solo: Fusarium, de 10 a 20 anos; 
 Silica gel para Hyphomycetes (menos indicado, baixa viabilidade); 
 Alguns dermatófitos;
 Nitrogênio líquido (mais indicado).
SELEÇÃO DE TÉCNICAS DE PRESERVAÇÃO
Leveduras
 Liofilização; 
 Sílica gel (baixa viabilidade); 
 Nitrogênio líquido (mais indicado).
Fungos que formam líquens
 Nitrogênio líquido com taxa de resfriamento -10 a -20ºC min-1 em
glicerol a 10% (v/v).
LIMPEZA E PREVENÇÃO DE ÁCAROS
 Ácaros dos gêneros Tyroglyphus e Tarsonemus;
 Procedência: solos, plantas, corpo de frutificação de fungos, sapatos,
insetos ou culturas recebidas de outros laboratórios;
 Danos: se alimentam das culturas de fungos;
 Transferem estruturas de fungos e bactérias, contaminando outras
culturas.
LIMPEZA E PREVENÇÃO DE ÁCAROS
 Exame do material recebido no laboratório em ambiente separado;
 Selar as culturas que chegam, estocá-las em refrigerador enquanto
estão em observação;
 Limpeza das superfícies de trabalho;
 Proteger as culturas contra contaminação aérea e poeira;
 Limpeza regular das bancadas e armários com acaricida (Ex:
Actellic 25EC, Fargro Ltd).
HIGIENE
LIMPEZA E PREVENÇÃO DE ÁCAROS
 Envolve o uso de substâncias químicas acaricidas (cânfora e
paradiclorobenzeno – PDB, nos armários e caixas;
 Cypro e Kelthane, nos tampões dos tubos, que são tóxicas aos
fungos, portanto as culturas não afetadas devem ser preservadas ou
removidas;
 Método de vaporização de óleo, impede a infestação por ácaros,
porém não os matam;
Método usado como último recurso ou quando houver uma
mudança para novo local;
Quando envolver um grande número de culturas.
FUMIGAÇÃO