Aula 4 Eletroforese

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MSc. BRUNO DA SILVA GOMES 
ELETROFORESE 
bsgomes100@gmail.com 
FACULDADE UNINASSAU 
BIOLOGIA MOLECULAR 
BIOLOGIA MOLECULAR 
DEFINIÇÃO 
 A Eletroforese em gel é uma técnica usada para 
separar fragmentos de DNA (ou outras 
macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base 
no tamanho e carga 
 
 Envolve a passagem de uma corrente através de um 
gel contendo as moléculas de interesse. 
 
 Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão 
se mover através do gel em diferentes direções ou em 
diferentes velocidades 
 
 Isso permite que sejam separadas umas das outras. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de 
carga por massa. 
 
 Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de 
DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. 
 
 Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos 
diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma 
amostra, e o quão grandes eles são em relação aos outros. 
 
 Podemos também determinar o tamanho absoluto de um 
pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA 
"padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos 
conhecidos. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
Reagentes 
Solução 
tampão 
ionizada 
Polímeros Corantes 
BIOLOGIA MOLECULAR 
O termo eletroforese  migração de uma partícula 
carregada sob influência de um campo elétrico. 
Várias biomoléculas como ácidos nucleicos, 
possuem carga positiva ou negativa em um 
determinado valor de pH. 
Assim, quando submetidos a um campo elétrico, 
essas partículas carregadas irão migrar para o 
cátodo ou ânodo, dependendo de sua carga líquida 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 O equipamento necessário para a eletroforese consiste 
basicamente de dois itens 
o Uma fonte de tensão e uma unidade de eletroforese. 
 
 As unidades de eletroforese estão disponíveis em duas 
formas, as quais permitem realizar migração na vertical ou 
na horizontal. 
 
 Géis para eletroforese vertical são disponíveis 
comercialmente e são utilizados rotineiramente para 
separar proteínas em gel de poliacrilamida. 
 
 O gel é formado entre duas placas de vidro que são 
mantidas juntas por uma pinça, porém separados por um 
espaçador 
BIOLOGIA MOLECULAR 
Polímeros 
Macromoléculas formadas a partir de unidades 
estruturais menores (os monómeros) 
 
 Gel de agarose 
o Separação de moléculas maiores 
o Poros maiores 
• DNA e RNA 
 
 Gel de poliacrilamida 
o Separação de moléculas menores 
o Poros menores 
• DNA, RNA e proteínas 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 O processo de eletroforese envolve um gel 
 
 Uma placa de material gelatinoso. 
 
 Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos 
de um polissacarídeo chamado agarose, que vem na 
forma de flocos secos em pó. 
 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
 Quando a agarose é aquecida em um tampão (água 
com alguns sais) e deixada para esfriar, forma um gel 
sólido ligeiramente mole. 
 
 No nível molecular, o gel é uma matriz de moléculas 
de agarose que são mantidas unidas por ligações de 
hidrogênio e formam micro poros. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 Em uma extremidade, o gel tem cavidades 
semelhantes a bolsos chamadas poços, onde as 
amostras de DNA serão colocadas 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel 
deve ser colocado em uma caixa de gel. 
 
 Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo 
positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um 
eletrodo negativo. 
 
 O corpo principal da caixa, onde o gel é colocado, é 
preenchido com uma solução tampão contendo sal 
que pode conduzir corrente. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
Uma vez que o gel 
esteja na caixa, 
cada uma das 
amostras de DNA 
que queremos 
examinar é 
cuidadosamente 
transferida para 
um dos poços. 
Um poço é 
reservado para 
uma escada de 
DNA, um padrão 
de referência que 
contém 
fragmentos de 
DNA de 
comprimentos 
conhecidos. 
A seguir, a caixa é 
ligada e a corrente 
começa a fluir 
através do gel. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
As moléculas de DNA têm carga negativa devido 
aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-
fosfato, assim elas começam a se mover através da 
matriz de gel, para o polo positivo. Quando a 
energia é ligada e a corrente passa através do gel, 
diz-se que o gel está correndo. 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 A voltagem típica para o gel de agarose e DNA correr 
é na faixa de 80-120V. 
 
o Uma voltagem maior faz o gel correr mais rápido, mas 
também pode derretê-lo se a corrida levar um longo 
período de tempo. 
 
o Uma voltagem mais baixa faz o gel correr mais 
lentamente (que pode ser conveniente quando se 
deseja programar a hora de conclusão, por exemplo, 
para depois do almoço). 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
BIOLOGIA MOLECULAR 
Aplicação de eletroforese 
 A partir de um fragmento de DNA encontrado na cena 
de um crime, qual dos três suspeitos é culpado? 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 Separação de moléculas, como DNA, RNA e 
proteínas 
 
 Detectar produtos de PCR, Western Blot, Nothern Blot 
e Southern Blot 
 
o Western blot (proteínas), Southern blot (DNA) e 
Northern blot (RNA).