Identificação de Bastonetes Gram Negativos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA
IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS
Professor: Dr. Renato Motta Neto
INTRODUÇÃO:
	As provas bioquímicas de identificação bacteriana se baseiam, de um modo geral, na degradação de substratos incorporados aos meios de cultura com produção de compostos finais de metabolismo, que tenham pH definido e possibilitem a mudança de cor do meio. Para uma correta interpretação destes testes, é importante conhecer a fórmula e funcionamento bioquímico de cada prova empregada.
ÁGAR TRÍPLICE AÇÚCAR FERRO (TSI)
Habilidade do microorganismo em degradar carboidratos específicos incorporados ao meio, com ou sem produção de gás ou H2S.
	
	Funcionamento TSI
	
	
	Produção Gás
	Bolhas ou rachaduras
	Base
	Produção de H2S
	Pigmento negro
	
	Fermentação glicose
	Cor amarela
	Superfície
	Fermentação lactose
	Cor amarela
URÉIA
Habilidade do microorganismo em produzir a enzima uréase. Essa prova apresenta particular importância na identificação prévia do gênero Proteus, que possui forte atividade ureásica.
CITRATO
	Habilidade de evidenciar a capacidade da bactéria de utilizar citrato como única fonte de carbono
. 
DESAMINAÇÃO DA FENILALANINA
	Dentre as enterobactérias, apenas os gêneros Morganella, Providencia e Proteus possuem enzimas capazes de desaminar a fenilalanina em ácido fenil pirúvico, que é detectado pela adição de cloreto férrico 10%.
SIM
	Meio capaz de fornecer as provas de motilidade, sulfeto e indol. A motilidade é visualizada pela turvação completa do meio, a partir da linha de inoculação. Após a leitura das provas de sulfeto (pigmento negro no meio), verifica-se a produção de indol pela adição de quatro gotas do reativo de Kovacs na superfície do meio, agitando-se suavemente. A formação de um anel rosa-vermelho na superfície indica reação positiva.
VM 
	Via ácida mista, as bactérias que seguem essa via de metabolização do piruvato produzem, com freqüência, ácido o suficiente para manter o pH abaixo de 4,4 ( o ponto divisório do indicador vermelho de metila), esse teste proporciona uma característica valiosa para a identificação de espécies bacterianas que produzem ácidos fortes a partr da glicose. Para a leitura após incubação de 18-24h adiciona-se duas gotas do reativo vermelho de metila, o aparecimento de cor vermelha indica prova positiva.
VP
	Esta prova baseia-se na conversão do ácido metil carbinol (acetoína) em diacetil através da ação do hidróxido de potássio e oxigênio atmosférico. O diacetil é convertido num complexo vermelho sob ação catalítica do alpha-naftol e creatina Ocorre a formação de acetoína e de butileno glicol constitui uma via alternativa do metabolismo do ácido pirúvico.As bactérias que utilizam essa via de fermwentação como certas cepas do grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Hafnia produzem apenas pequenas quantidades de ácidos mistos , que podem ser insuficientes para reduzir o pH do meio contendo vermelho de metila para produz\ir uma mudança de cor.
DESCARBOXILAÇÃO DE AMINOÁCIDOS
	Muitas espécies de bactérias possuem enzimas capazes de descarboxilar aminoácidos específicos no meio de cultura. A enzima descarboxilase remove uma molécula de CO2 de um amminoácido para formar aminas de reação alcalina.
LISINA CADAVERINA ORNITINA PUTRESCINA
ARGININA CITRULINA
TABELA DE IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTÉRIAS
	Bactéria
	Gás
	Lac
	H2S
	Ure
	Ind
	Mob
	Orn
	Lis
	Cit
	Fal
	E.coli
	+
	+
	-
	-
	+
	+/-
	+/-
	+
	-
	-
	Shigella
	-
	-
	-
	-
	-/+
	-
	-/+
	-
	-
	-
	S.sonnei
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	+
	-
	-
	-
	Salmonellasp
	+
	-
	+
	-
	-
	+
	+
	+
	+
	-
	S.typhi
	-
	-
	+/-
	-
	-
	+
	-
	+
	-
	-
	C.freudii
	+
	-/+
	+
	+/-
	-
	+
	-/+
	-
	+
	-
	C.diversus
	+
	-/+
	-
	+/-
	+
	+
	+
	-
	+
	-
	K.pneumoniae
	+
	+
	-
	+
	-
	-
	-
	+
	+
	-
	K.oxytoca
	+
	+
	-
	+
	+
	-
	-
	+
	+
	-
	E.aerogens
	+
	+
	-
	-
	-
	+
	+
	+
	+
	-
	E.cloacae
	+
	+
	-
	+/-
	-
	+
	+
	-
	+
	-
	Serratia spp
	+
	+
	-
	-
	-
	+
	+
	+/-
	+
	-
	P.vulgaris
	+
	-
	+
	+
	+
	+
	-
	-
	-/+
	+
	P.mirabilis
	+
	-
	+
	+
	-
	+
	+
	-
	+/-
	+
	P.penneri
	+
	-
	+
	+
	-
	+
	-
	-
	-
	+
	P.rettgeri
	-/+
	-
	-
	+
	+
	+
	-
	-
	+
	+
	P.stuartii
	-
	-
	-
	-/+
	+
	+
	-
	-
	+
	+
	M.morgani
	+
	-
	-
	+
	+
	+
	+
	-
	-
	+
	Edwardsiella
	+
	-
	+
	-
	+
	+
	+
	+
	-
	-
	Y.enterocolitica
	-
	-
	-
	+/-
	+/-
	-
	+
	-
	-
	-
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES
INTRODUÇÃO:
	Os bacilos Gram negativos não fermentadores compreendem um grupo de microorganismos aeróbios, não esporulados, que se caracterizam pela incapacidade de utilizar carboidratos como fonte de energia através de fermentação, degradando-os pela via oxidativa.
Principais Gêneros:
Pseudomonas aeruginosas, Acinetobacter baumanii, Stenotrophomonas maltophila e o complexo Burkholderia cepacia
Pseudomonas aeruginosa
Colônias grandes, com odor característico;
Produção de pigmento verde-azulado (piocianina e fluoresceína)
Oxidase positiva;
Motilidade positiva;
OF-glicose positiva.
Acinetobacter baumanii
Crescem bem em Agar Mac Conkey;
Oxidase negativa;
Imóveis;
Resistentes à penicilina;
Catalase positiva;
OF-Glicose positiva;
Apresentam-se como cocos ou cocobacilos Gram negativos;
Crescem a 42C
Burkholderia cepacia
Mobilidade positiva;
Oxidase positiva;
Lisina positiva;
Resistente as polimixinas
INTERPRETAÇÃO
	A interpretação é realizada anotando-se o resultado de todas as provas e utilizando uma tabela de provas bioquímicas para enquadrar o microorganismo em identificação. Algumas espécies, pouco freqüentes podem não ser classificadas dentro das características bioquímicas adotadas pelas provas convencionais sugeridas. Nestes casos, será necessário a utilização de um maior número de provas fenotípicas, como por exemplo: citrato, uréia, acetamida, ONPG, uréia, hidrólise da esculina dentre outras.
www.unifesp.br/dmed/dipa/lemc/imagens/image18.jpg
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
ROTEIRO AULA: COPROCULTURA
Professores: Dr. Renato Motta Neto, Dra.Vânia de Sousa Andrade, Dra. Maria Celeste Nunes de Melo.
JUSTIFICATIVA
- As culturas de fezes são largamente utilizadas no diagnóstico de gastroenterites inespecíficas e demais infecções do trato intestinal. Tais culturas representam um dos exames bacteriológicos requisitados com freqüência, serem estas infecções um dos problemas de maior incidência, particularmente, nos grupos de indivíduos de faixa etária mais baixa.
EXECUÇÃO:
1 parte: Técnica de isolamento e identificação
- Retirar uma amostra da suspensão de fezes (semeadas em caldo nutriente) utilizando a alça bacteriológica e semear nos meios sólidos (MAc Conkey e meio SS).
- Incubar as placas na estufa bacteriológica (18-24 horas / 37ºC).
2 parte: Provas bioquímicas
- Retirar uma amostra da suspensão de fezes (semeadas em caldo nutriente) utilizando a alça bacteriológica e semear nos tubos contendo os seguintes meios de cultura:
- TSI (Agar Tríplice Açúcar Ferro)
- SIM (Sulfeto-Indol-motilidade)	
- CIT (Meio de Citrato Simmons)	
- FAL (Desaminação da Fenilalanina)
- VM (Teste de vermelho de metila)		
- VP (Teste de Vogues Poskauer)	
- AGAR NUTRIENTE
- Incubar as placas na estufa bacteriológica (18-24 horas / 37ºC).
3 parte: Identificação Sorológica
- Preparar uma suspensão densa (aspecto leitoso) da bactéria a ser testada, utilizando-sesolução salina a 0,85%. A massa bacteriana será proveniente do agar nutriente inclinado (semeado na 2ª etapa). Coloca-se a salina sobre o crescimento ocorrido na superfície do meio, e após alguns minutos, agitar o tubo de modo a obter a suspensão bacteriana.
- Sobre uma lâmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspensão bacteriana a ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura homogênea (1-2 minutos). O aparecimento de aglutinação, nesse intervalo de tempo, indica positividade da reação.