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Mutações de DNA As moléculas de DNA de um organismo não são estáticas. Freqüentemente, suas bases estão expostas a agentes, naturais ou artificiais, que provocam modificações na sua estrutura ou composição química. Modificações na informação genética, que resultam em células ou indivíduos com alterações fenotípicas, são denominadas de mutações. Mutante é todo organismo que exibe uma forma diferente da de seus ascendentes, a qual é o resultado da presença de uma mutação. Mutação refere-se a qualquer modificação súbita e hereditária no conjunto gênico de um organismo, que não é explicável pela recombinação da variabilidade genética preexistente. Essas modificações incluem: 1- mudanças no número de cromossomos 2- mudanças grosseiras na estrutura cromossômica (aberrações cromossômicas) 3- e alterações nos genes individuais. A mutação é a fonte básica de toda a variabilidade genética, constituindo a matéria prima para a evolução. A recombinação apenas rearranja essa variabilidade em combinações novas e a seleção natural (ou artificial) simplesmente preserva as combinações mais bem adaptadas às condições ambientais existentes (ou desejadas). Mutações espontâneas - Todos os seres vivos sofrem um certo número de mutações, como resultado de funções celulares normais ou interações aleatórias com o ambiente. Mutações induzidas – São mutações que ocorre devido ao tratamento com determinados compostos. Tais compostos são denominados de agentes mutagênicos. Muitos mutagênicos atuam diretamente no DNA, devido a sua capacidade de atuar como uma determinada base ou de incorporar-se à cadeia polinucleotídica. O efeito de um dado mutagênico é medido pelo grau em que ele aumenta a freqüência de mutação. Qualquer base do DNA pode ser mutada. Uma mutação pontual envolve modificação em um único par de bases (substituição, adição ou deleção) e pode ser o resultado de um mau funcionamento do sistema celular que replica ou repara o DNA, inserindo uma base incorreta na cadeia polinucleotídica que está sendo sintetizada, ou de uma interferência química diretamente sobre uma das bases do DNA. A maioria das mutações úteis para a análise genética de muitos processos biológicos são mutações letais condicionais. Essas mutações são aquelas letais em um ambiente, nas denominadas condições restritivas, mas são viáveis em um segundo ambiente, em condições permissivas. Mutantes auxotróficos - são incapazes de sintetizar um metabólito essencial (ex: um aminoácido) e que é sintetizado pelos indivíduos de tipo selvagem da espécie. esses mutantes crescem e se reproduzem quando o metabólito é fornecido pelo meio (a condição permissiva) e não cresce quando o metabólito está ausente (condição restritiva). Mutantes sensíveis à temperatura - que são viáveis em uma determinada temperatura, mas não em outra, por exemplo, uma enzima que é ativa em temperaturas baixas, mas parcialmente ou totalmente inativa em temperaturas elevadas. Mutações a nível molecular: Modificações tautoméricas - alteram o pareamento de bases normal, A timina se parea com guanina e a adenina pode parear com a citosina. Quando a adenina parea com a citosina, o par A *.C (o asterisco denota a forma tautomérica), incorpora, uma citosina na cadeia de DNA no lugar reservado a uma timina. No próximo ciclo de replicação, a adenina irá parear com uma timina, e a citosina, incorporada errone- amente em uma das fitas da cadeia, será mantida e irá parear com uma guanina. Assim uma das cadeias-filhas das moléculas de DNA irá conter um par G.C no lugar do par de bases correta A.T. As mutações resultantes de modificações tautoméricas nas bases do DNA envolvem a substituição de um par de bases por outra – mutação pontual. Transição - a substituição de uma purina por outra purina ou de uma pirimidina por outra pirimidina. Transversão – é a substituição de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. Um terceiro tipo de mutação pontual é a mutação que modifica a fase de leitura, porque altera a fase de leitura de todas as trincas de pares de bases no gene, depois de sítio mutado. A maioria das bases colocadas erradas durante a replicação em E. coli é corrigida pela atividade 3’ → 5’ da DNA polimerase III. Considerando os sítios de mutações no interior de uma seqüência de DNA, a pergunta que surge é: todos os pares de bases de um gene são igualmente suscetíveis à mutação ou existem sítios em que a probabilidade de ocorrer uma mutação é maior? Sítios quentes (hoptspots) - sítios que ocorre um número de mutações maior, diferentes mutagênicos pode ter diferentes “sítios quentes”. Mutações silenciosas – mutações sem efeito aparente. Elas dividem-se em 2 grupos: aqueles que envolve troca de base no DNA, mas não envolve em troca de aminoácido presente na proteína, ou aqueles que levam à troca do aminoácido, mas a substituição não afeta a atividade da proteína. Essas últimas são chamadas de mutações neutras. Mutação direta ou deletéria - é aquela que inativa o gene. A ocorrência de uma Segunda mutação em um local diferente do genoma, que de alguma forma compensa a primeira mutação é denominada mutação supressora ou reversão de um segundo sítio, pois suprime os efeitos da mutação original. Mecanismos de reparo do DNA A maioria das mutações é desvantajosa para as células. Para que essas células sobrevivam, elas necessitam de mecanismos enzimáticos para reverter os efeitos de processos mutagênicos. Como vimos no estudo de mutações do DNA, as bases podem ser alteradas ou perdidas, as ligações fosfodiésteres podem ser quebradas e as fitas livres podem ser cruzadas e covalentemente ligadas. Essas lesões são produzidas por radiações ionizantes, como a luz ultravioleta (U.V), por exemplo, e compostos químicos. Os mecanismos de reparo do DNA atuam no DNA lesado de tal forma que a informação genética perdida em uma fita pode ser recuperada a partir da fita complementar. Os sistemas de reparação são melhor compreendidos e estidados no E. coli. Reparação por fotorreativação enzimática Um mecanismo de reparo bem estudado é a remoção dos Dímeros de Pirimidinas que são formados pela exposição do DNA a luz U.V. Resíduos de pirimidina ficam covalentemente ligados nesta situação Um dos mecanismos de reparo é: Os dímeros de pirimidina são o alvo universal da enzima fotoliase que se liga ao dímero e catalisa uma reação fotoquímica que na presença da luz visível desfaz o anel ciclobutânico formado pela luz U.V., refazendo as bases individuais. Esse processo é chamado de fotorreativação e envolve duas etapas: 1. A enzima fotoliase reconhece e liga-se ao dímero no escuro; 2. A absorção de luz fornece energia para converter o dímero em monômero de pirimidina e após terminado o processo, a enzima dissocia-se do DNA. OBS: Em E. coli o gene (phr), é quem codifica a fotoliase. Reparação por excisão: a fita de DNA complementar não é danificada e é utilizada como molde para a substituição do fragmento lesado. Excisão de base A citosina do DNA pode ser desaminada espontaneamente em uma freqüência perceptível para uracila. G – C desaminação G – U A desaminação da citosina é um evento mutagênico porque a uracila vai parear com a adenina e assim, uma das moléculas-filhas irá conter um par de bases A-U no lugar do original G-C.G – C G – C→ desaminação G – U → replicação A – U O sistema de reparo reconhece a uracila (base estranha ao DNA) e assim a enzima uracila-DNA-glicoliasehidrolisa a ligação glicosídica entre a uracila e as moléculas de desoxirribose (neste estágio, a cadeia de DNA está intacta, mas a base é perdida). Esta fenda chama-se sítio AP. A enzima AP endonuclease reconhece o defeito e cliva a cadeia em regiões vizinhas à da base perdida. Depois vem a DNA polimerase I que remove o nucleotídeo e insere a citosina. Quando a fita é corrigida, a DNA ligase une os nucleotídeos. Reparo por cisão de nucleotídeos (REN) Este processo consiste em 5 etapas: 1. Reconhecimento da lesão; 2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão; 3. Excisão do segmento (contendo a lesão); 4. Síntese de um novo segmento de DNA ® utilizando a fita não danificada como molde; 5. Ligação do fragmento recém sintetizado. 1 - Início UvrA dimeriza na presença de ATP com UvrB Este dímero liga-se fracamente ao DNA e sua atividade de helicase permite que se mova ao longo da fita do DNA a procura das mutações. Quando este encontra a lesão, os complexos UrvA-UrvB desnaturam parcialmente a cadeia, permitindo que a UvrC se ligue ao complexo e a UvrA se dissocie da molécula ® Complexo UvrB-C Complexo UvrB-C ® promove a incisão da fita danificada (± 8 nucleotídeos da extremidade 5’ da lesão e 4 a 5 nucleotídeos 3’ da lesão). Esta quebra também requer ATP na excisão ± 12 a 13 nucleotídeos. A DNA-polI e a UvrD - promovem a excisão ao segmento e a síntese da nova fita complementar seguindo como molde a fita complementar intacta. DNA ligase une as extremidades e a cadeia é reparada Reparação de bases mal pareadas Algumas bases incorretamente pareadas escapam da revisão da DNA polimerase durante a replicação. Em E. coli o sistema de correção de erro consiste em várias proteínas codificadas pelos genes mut. Esse sistema percorre o DNA recém sintetizado a procura de pares de bases mal pareados e remove os segmentos de fita simples contendo os nucleotídeos incorretos, permitindo que a DNA polimerase insira a base correta na lacuna formada. Etapas do processo em E. coli A MutS liga-se ao par de bases mal pareada ; A MutL liga-se a MutS para formar o complexo entre MutS e MutH; MutS - reconhece o erro e se desloca ao longo do DNA. A MutS liga-se tanto ao local da lesão quanto na região vizinha da lesão do DNA, formando uma alça de DNA nessa região. A endonuclease de MutH cliva então a fita e remove o segmento contendo a lesão e é ajudada pela UvrD (helicase) Exonuclease VII - cliva 5’→3’ Exonuclease I - cliva 3’ → 5’ A fita DNA nova é sintetizada pela DNA-pol III e a DNA ligase liga o fragmento Referências: - ZAHA, A., FERREIRA, H. B. e, PASSAGLIA L. M. P. Biologia Molecular Básica. 3.ed Ed. Mercado Aberto, Porto Alegre, 2003. - STRYER ,L. Bioquímica. Editora: GUANABARA
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