Relação do ambiente dos adipócitos com o câncer de mama

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DISCENTE: FAbio Bonifácio, Hannah hamada, isabela chagas e Thiago Henrique do nascimento. 
DOCENTE: maria angélica Watanabe 
imunopatologia – Mestrado em patologia experimental 
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INTRODUÇÃO 
 O tecido adiposo é formado por uma variedade de células do tecido conjuntivo  adipócitos 
 Adipócitos são células que acumulam lipídeos (gordura) em seu interior  lipoblastos
 Localização: Hipoderme; ao redor de alguns órgãos como rins e coração.
 Corresponde ao peso corporal (dentro do peso normal):	
Mulheres 20-25%
Homens: 15-20% 
Fonte: GARTNER, L. P; HIATT, J. L. – Histologia Essencial, 2012
TECIDO CONJUNTIVO: é um dos 4 tecidos básicos do corpo, derivado principalmente do mesoderma. Existem vários tipos com diversas funções, como por exemplo o sangue, linfa, ossos, cartilagens, tendões entre outros. 
Pode ser dividido em MATRIZ EXTRECELULAR e CÉLULAS 
A matriz extracelular é a parte sem “vida” do tecido, aonde se encontram as fibras, glicoglicanos, proteoglicanos.
As células são os fibrioblastos, células sanguíneas, adipócitos. 
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Fonte: GARTNER, L. P; HIATT, J. L. – Histologia Essencial, 2012
FUNÇÃO DOS ADIPÓCITOS E SEUS TIPOS
 Tem a função de modelar a superfície do corpo, isolamento térmico do organismo (manutenção da temperatura corporal) e servir como reserva energética (reserva de triglicerídeos) e como um amortecedor, protegendo o organismo contra choques mecânicos. 
TIPOS DE ADIPÓCITOS:
Tecido adiposo unilocular
Tecido adiposo multilocular
Fonte: GARTNER, L. P; HIATT, J. L. – Histologia Essencial, 2012
Unilocular: as células apresentam uma gotícula de gordura predominante, que preenche quase todo o seu citoplasma. É bastante irrigado por vasos sanguíneos e também é conhecido como tecido adiposo comum ou amarelo. Ele forma o panículo adiposo, ou seja, uma camada de gordura disposto sob a pele que absorve impactos e atua como isolante térmico. 
Multilocular: tem a principal função de gerar calor e é formado por vários vacúolos (gotículas) de gordura e também de mitocôndrias. Tem cor castanha devido a abundante vascularização e ao grande número de mitocôndrias. 
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Relação do microambiente dos adipócitos com o câncer de mama tipo triplo negativo (TNBC);
Alterações no adipócito  predisposição ao câncer de mama 
Patologias associadas: 
Obesidade: 30-50% 
Diabetes Mellitus tipo 2: 20%
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Protoncogenes ;
Genes supressores tumorais;
Genes no reparo do DNA .
GENES ALVOS
Regulam e controlam o ciclo celular (proliferação e diferenciação).
Mutação
Desregulação do ciclo celular
NEOPLASIA
Esses genes são vulneráveis e alvos fáceis de mutações. Todos os indivíduos possuem esses genes atuando na função biológica normal
FONTE: GUEMBAROVSKI, R. L.; CÓLUS M. S. Câncer: uma doença genética. Genética na escola, vol. 3, n. 1, p. 4-7, 2008.
ETIOLOGIA X EPIDEMIOLOGIA 
O câncer de mama é o mais comum entre as mulheres. 
 Estimativa de 57.700 novos casos 
  Mortes: 14.388 – 181 homens e 14.206 mulheres 
A doença ocorre quando as células mamárias proliferam de forma descontrolada, deixando de responder aos mecanismos de controle do ciclo celular e morte celular.
 Adquirido (90%) x Hereditário (10%)
FONTE: INCA, 2017/2018
IMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ) NO CÂNCER DE MAMA
 Diagnóstico e diferenciação dos subtipos;
 Identifica antígenos nos tecidos utilizando a ligação específica de antígenos e anticorpos;
 Marcadores: Receptor de estrógeno (RE), Receptor de progesterona (PG), oncoproteína HER-2 e o antígeno Ki67.
 Subtipos: 
Luminal A
 Luminal B
Triplo Negativo
Basalóide
HER 2
FONTE: CIQUEIRA, M.B.; MOREIRA, M.A.R.; SOARES, L.R.; FREITAS – JÚNIOR, R. – Subtipos moleculares do câncer de mama. FEMINA, vol. 39 n.10, outubro de 2011. 
SUBTIPO
IMUNOFENÓTIPO
COMPORTAMENTO
Luminal A
RE(+); RP (+); HER2 (-) e
Ki-67 < 14%
60% dos casos, menos agressivo e bom prognóstico.
Luminal B
RE (+); RP (+); HER2 (+) e
Ki-67 >14%
RE (+); RP (+); HER (-)
Comum, pouco agressivo, bom prognóstico porém pior que o Luminal A.
Triplo negativo (TNBC)
RE (-); RP (-); HER2 (-)
CK5 (-) e EGFR (+)
10-20% dos casos, agressivo, maior frequência em afrodescendentes e mulheres jovens, prognóstico ruim.
HER 2
RE (-); RP (-); HER2 (+)
Menos comum e agressivo, segundo pior prognóstico.
Basalóide
RE (-); RP (-); HER2 (-); CK5 (+) e EGFR (+)
Tem um prognóstico mais reservado associado a menor sobrevida, alto grau histológico, necrose e infiltrado linfocitário.
FONTE: CIQUEIRA, M.B.; MOREIRA, M.A.R.; SOARES, L.R.; FREITAS – JÚNIOR, R. – Subtipos moleculares do câncer de mama. FEMINA, vol. 39 n.10, outubro de 2011. 
Classificação: fatores prognósticos tradicionais, estado linfonodal regional, tamanho do tumor, tipo e grau histológico, e estadiamento da doença. 
OBJETIVOS 
Relação do microambiente dos adipócitos com a predisposição ao câncer de mama subtipo triplo negativo (TNBC);
Relação da hiperfunção dos adipócitos;
Relação direta ou indireta da glicose nos adipócitos para liberarem substâncias; 
Função da CCL5 e IGF-1 no microambiente tumoral. 
CÉLULAS DO CÂNCER DE MAMA
 MDA-MB231 (Erα, PgR e HER2 negativo)
 MCF-7 (Erα, PgR positivo e HER2 negativo)
AMOSTRAS DE TECIDO ADIPOSO HUMANO
 Mulheres saudáveis entre 25- 63 anos; 
Sem qualquer tipo de doença metabólica ou endócrina
Mulheres submetidas á redução mamária cirúrgica.
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Penicilina e
 Estreptomicina
MDA-MB 231 
ou MCF-7
Células do Estroma 
CULTURA CELULAR
Colagenase
HPLC, Espectro
de massa, Cromatografia
10% (FBS) 
As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino aa 10%, e glutamina 
A CULTURA FOI MANTIDA EM 95% de AR E 5% DE CO2 e EXPLICA O MOTIVO.
Falar que o tecido adiposo foi digerido com colagenase 
Os meios foram isolados e incubados em DMEN
 
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MEIO CONDICIONADO (CM)
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MDA-MB 231
Câmara superior 
revestido com Matrigel
Câmara inferior com
Adipócitos Humanos Diferenciados
Membrana 
Semi-permeável
ENSAIO DE CO-CULTURA E INVASÃO 
Adipócitos diferenciados ou SVF indiferenciados
Figura 1: Efeito de adipócitos e adipócitos tratados com glicose na motilidade celular do câncer de mama
Glicose 25 mM (HG)
Glicose 5,5 mM de (LG)
Células MDA-MB231 privadas de soro
Adipócitos Diferenciados e SVF 
As células que migraram através do filtro revestido com matrigel foram determinadas por coloração com violeta de cristal
Em variância, a co-cultura com células de fracção vascular do estroma humano (SVF) aumentou apenas em 1,2 vezes a invasão de MDA-MB231
 a glicose pode alterar a ação promotora dos adipócitos humanos na invasividade do MDA-MB231
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Figura 1: Efeito de adipócitos tratados com glicose na motilidade celular do câncer de mama
Monocamadas de MDA-MB231 
Monocamadas confiantes de MDA-MB231 foram feridas longitudinalmente e incubadas com meio condicionado derivado de adipócitos incubados com HG (HG-CM) ou LG (LG-CM) na presença de mitomicina C, um inibidor de mitose.
As imagens foram tiradas às 0 e 24 horas após o ferimento.
HG-CM aumentou a motilidade das células do câncer de mama em cerca de 2 vezes 
O fechamento da ferida foi semelhante ao obtido com meio FBS a 10% e significativamente mais alto comparado ao observado com o LG-CM. 
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Figura 1: Efeito de adipócitos tratados com glicose na motilidade celular do câncer de mama
Aumento da capacidade invasiva de MDA-MB 231
 Glicose aumenta a invasividade das CCM
 Glicose aumenta a motilidade das CCM
 Liberação de ... ??
 Monocamadas de MDA-MB231
 Mitomicina C
 ADIPÓCITOS SECRETORES
CCL5
IGF-1
ATIVA A FOSFORILAÇÃO DO FATOR STAT3
Papel do câncer: promove a motilidade  metástase das células tumorais
PROTEINA REGULADORA 
FONTE: MARCELA, Reyes J. Características biológicas del tejido adiposo: el adipocito como célula endocrina. Revista Médica Clínica Las Condes, v. 23, n. 2, p. 136-144, 2012.
Citocinas produzidas pelo Adipócito foram inibidasCCL5 de 2 formas: 
 CCL5Ab (Anticorpo monoclonal) 
 CCR5-pep (Peptídeo que substitui o CCL5)
IGF-1: 
 AG1024 (Inibidor da tirosina-quinase do receptor de IGF-1) 
VERIFICAR A AÇÃO DAS CITOCINAS NA MOTILIDADE
 
 
AG1024
Já que os adipócitos produzem citocinas que influenciam na migração da células tumorais, será que ele também induz a expressão dessas citocinas pela própria célula tumoral? 
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Papel crucial da citocina CCL5 produzida por adipócitos, na motilidade das células cancerosas 
CCL5 primordial na motilidade 
VERIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS PELO MDA-MB231 É CONTROLADO PELOS ADIPÓCITOS
Verificar a expressão de RNAm de CCL5 e IGF-1
 Adipócito CM 
 MDA-MB231
RT-PCR (MDA)
Fonte: https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/rt-education/reverse-transcription-applications.html
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IGF-1 é induzido na célula tumoral, influenciado pelo adipócito
Expressão de IGF-1 não é influenciado pelo CLL5
Detecção de CCL5 e IGF-1 no tecido adiposo peritumoral em mulheres com câncer de mama triplo negativo
Imunohistoquímica
CCL5 e IGF-1
Marcadores de interesse
ER-α 
Marcador de receptor de estrógeno
PR
Marcador de receptor de progesterona
HER-2
Marcador de câncer de mama
KI-67
Avaliação da proliferação celular
Fig.4: Marcação de CCL5 no tecido peritumoral de amostrar de câncer de mama triplo negativo
Fig.5: Marcação de IGF-1 no tecido peritumoral de amostrar de câncer de mama triplo negativo
Curva de Kaplan-Meier
Fig.6: Relação entre a expressão de CCL5 e IGF-1 no tecido adiposo peritumoral de pacientes com câncer de mama triplo negativo e sobrevida geral
FONTE: Abbas 8ª edição. 
CONCLUSÃO
 Liberação de CCL5 pelos adipócitos contribui para o aumento da motilidade e da invasividade das células cancerosas do câncer de mama;
 CCL5 foi detectado no tecido adiposo peritumoral no câncer de mama triplo negativo;
 A CCL5 se correlaciona com metástase distantes e nos linfonodos, bem pouco na redução da sobrevida geral dos pacientes;
 IGF-1 não se correlaciona na malignidade do câncer de mama triplo negativo;
 Sugestão de terapias contra o CCL5 para câncer de mama.
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OBRIGADO (A) !