Resumão genética

Prévia do material em texto

6
ISOLAMENTO DE DNA 28.07
DNA se altera só por existir, pois é uma molécula química, ambiente está forçando essas alterações, por isso 80% de câncer esporádicos é explicado
A PCR (reação em cadeia polimerase) é um método de diagnóstico de doenças, que procura numa amostra biológica o material genético
As amostras que contém DNA podem ficar na temperatura ambiente e o material genético permanecer íntegro por causa da força de suas ligações fosfodiéster (covalentes). Porém não irá encontrá-lo em dupla fita pois as ligações entre as fitas ( pontes de hidrogênio) não são tão fortes, a dupla fita não é necessária porque eles são complementares.
Criar sondas (primers) para a identificação do DNA que queremos encontrar já que os seres têm sequências próprias. Elas são complementares a sequência que você quer identificar. Se liga a essa fita complementar e brilha
PCR multiplex (estilizada) é colocado em um mesmo tubo mais de uma sonda para vários DNAs diferentes, sendo possível fazer de 4, 5 viroses ao mesmo tempo. Só não é feito de muitas, pois as vezes os primers podem se ligar entre eles.
Desafio da genética -> diagnóstico mas sem tratamento -> um dos métodos para corrigir ou impedir a expressão é RNA interferência silencia o gene bloqueando seus produtos, porque ele se expressa através de um RNA. Se a doença é causada por uma quantidade excessiva de proteína, pode-se fornecer um RNA complementar ao RNA mensageiro( se liga ao mensageiro e impede a tradução). Mas ele pode reagir com outros RNAS
Corrigir genes -> oferecendo-lhes a sequência defeituosa para que ela o identifique, faça a clivagem da parte defeituosa, reconstrua esse material (fornecer à célula grandes quantidades de fitas simples da sequência certa, possibilitando sua ligação pela dna pol) e evitar a apoptose (gasta muita energia). OBS.: Não precisa corrigir todas as células, pois as consertadas vão multiplicar e substituir as outras (em nº e função).
Como é que utilizando esse CAS9 você consegue reverter uma infecção por HIV? Retirar as partes do vírus do HIV que vão para o DNA por meio da CAS e juntar o espaço que fica no genoma, zerando o HIV
Etapas do processo de diagnóstico: Coletar a amostra do material -> Isolar o objeto de estudo – DNA (Pq ele é o material genético das células, mas pode ser o RNA. Cuidado com as nucleases q clivam ele e agem e ph7; Cuidado pra não quebrar pq as sondas não vão encontrar) -> Aplica SDS (detergente puro) pra romper as membranas fosfolipidicas anfipáticas e centrifuga -> Restos celulares precipitam em forma de micelas pq ficam mais densos q o DNA e são lavados, restando DNA impuro em solução com agua -> Lava com Etanol e Sal. O sal serve pra quebrar a afinidade com a agua, reagindo e tirando a carga do DNA (que já começa a aparecer). O etanol serve pra “encolher o dna” uma vez q esse não reage com o álcool. (SAL E ETANOL N REAGEM C DNA) -> Centrifuga e descarta o excesso, restando apenas DNA. OBS.: 0,5 uL já é suficiente p análise -> Quantifica o DNA no espectofotômetro ou gel de agarose
Gel de agarose: visualizar o DNA ->o DNA purificado - que ainda está em dupla fita, mas não em hélice, porque ele não está no ambiente celular (Para que hélice se mantenha, além da interações entre as bases, é fundamental um ambiente celular) - fica no gel porque ele é uma malha, então o DNA vai correr por dentro dele. Roda-se esse gel em um campo elétrico, dá uma carga, e, como o DNA é carregado negativamente, ele migra para o lado positivo. Quando o DNA migra para o lado positivo é possível vê-lo.
PCR 04.08
A quantidade de DNA depende da forma que a coleta da amostra foi feita.
A quantificação do DNA é importante pq se tiver muito DNA da amostra, as sondas não acham o DNA alvo. Se tiver muito concentrado dilui, padronizando a quantidade de nanogramas de DNA por microlitro (Espectrofotômetro)
Eletroforese: bota o DNA em um gel, aplica uma corrente entre dois polos e o DNA migra pro polo positivo. Se deixar muito tempo ele cai do gel. É preferível escolher bandas bem definidas, pq se tiver uma rasura significa DNA quebrado e pode dar falso negativo. É usada para separar e analisar biomoléculas conforme o peso molecular. 
O objetivo da PCR é reproduzir in vitro o que acontece in vivo. O grande desafio para realizar este processo é o controle das enzimas, pois são muito sensíveis a temperatura, ph, precisando ter todas as enzimas isoladas
Para replicar o DNA in vivo são precisos quais ingredientes?/ PCR
- DNA Polimerase; (é a principal enzima pq faz a polimerização - Não substitui)
- Helicase; (temperatura)
- Ligase; (fragmentos pequenos)
- Topoisomerase (desenrolar); (fragmento pequeno)
- DNA molde;
- Primer/primase; (o laboratório fornece os primers)
- DnTP (Desoxinucleotídeos trifosfatos – adenina, guanina, citosina, timina).
Dna pol -> temperatura ótima de 36,5 e 37°c; DNA -> abre a dupla fita a 90 a 92°c; Inicialmente eram usados banhos maria na temperatura da DNA pol (36°), abertura das fitas (90°) e dos primers (50°)
Pra resolver, isolaram a DNA pol da Thermus Aquaticus pq ela vive em altas temperaturas -> Taq DNA pol (pegaram o gene q produz a taq e botaram na e. coli pra multiplicar e facilitar o processo) -> Desenvolveram o termociclador (varia as temperaturas necessárias usando uma luz pra esquentar e ventilador pra resfriar, baixando a temperatura para 4°C no fim pra análise).
PCR: técnica que permite a amplificação de DNA in vitro, através de uma reação enzimática catalisada pela polimerase (Mg cofator da pol). Eficiente e com alta especificidade e reprodutibilidade, amplificando qualquer sequencia de DNA. Sendo uma sequência de ciclos (de 25 a 35), cada um compreendendo uma desnaturação da molécula de DNA, o emparelhamento dos primers e a síntese de mais DNA.
Fases da PCR:
 >1º fase-MELTING: Temperatura necessária para desnaturar o DNA, então você pega uma amostra coloca na maquina e a primeira temperatura é de 90°C por 1 minuto, que é tempo suficiente para desnaturar todo o DNA dupla fita que esteja la.
 >2º fase-ANNEALING: É a fase em que o primer encontra a região alvo. Altera-se a temperatura para o primer se ligar. (Varia com o primer, depende do tamanho 50°,55° de 60°C). Única fase com temperatura variável basicamente
 >3º fase-EXTENSION: Temperatura ideal para a Taq agir-> 72°C. 
OBS.: Na PCR so que muda de uma espécie para outra são os primers
Aquece o DNA dupla fita e ele desnatura -> Baixa a temperatura p primers agirem (fase de anelamento dos primers) e reconhecem uma região (Ele tem, em média, 20 bases e é sempre em par p aumentar as chances de encontrar aquela sequência.) -> Cada primer pega uma fita molde e se liga -> taq dna pol completa as fitas. Obs: Usa-se um primer com uma sequencia específica para o que se quer encontrar (ex só HPV). As cópias são idênticas.
As bandas brilham porque ali existe uma substância que é altamente mutagênica, o brometo de etídio, que penetra entre as bases e quando jogada luz UV vira fluorescente, se tiver mais forte + concentrado de DNA.
Se você deixar 2, 3 minutos taq dna pol continua e pode fazer o genoma inteiro do vírus, sendo consumida e sofrendo desgaste. O resultado vai dar negativo porque você não vai ter isolado nenhum fragmento. Usamos ciclos, fazemos repetições para aumentar o número de cópias, para você ter em média no final 1 milhão de cópias. Com o passar dos ciclos, dois primers ficam na mesma fita, delimitando o fragmento
O valor dos ciclos não pode ser muito alto por que os reagentes acabam ou se desgastam
Cinética da PCR: Fase de screening (inicial): os primers estão procurando a sequência alvo; Fase intermediária: tem um grande crescimento das sequências alvo; Fase final/tardia/platô: o numero de sequências alvo não aumentam, mas se mantém constante por causa da limitação dos reagentes.
Variações da PCR: PCR Real Time: A cinética é a mesma coisa mas os resultados são vistos em computador e não em gel de agarose, ele pode ver o resultadojá na fase intermediária, quando os fragmentos começam a subir, calcula a quantidade de DNA alvo (regra de 3)
Variações de PCR Real Time: SYBR Green: (menos confiável), usam corantes que se ligam a DNA dupla fita, no anelamento. A máquina detecta eles e conta quantos corantes tem, e consequentemente quantos fragmentos existem. A limitação dessa técnica é que o corante NÃO é específico, ele pode se ligar a qualquer fita dupla. TAQMAN: usa 3 primers aos invés de 2 (dois convencionais + sonda para o MEIO da região), um deles se liga ao meio e quando acontece a polimerizaçao, a TAQ então irá quebra-lo e joga-lo para fora, emitindo uma luz e dizendo que aquela sequência alvo foi encontrada. É específica, devido aos primers, facilmente quantificável (medindo as sondas com um cálculo para saber quantas cópias alvos havia).
Em toda PCR são usadas 2 controles: um positivo e outro negativo.
MUTAÇÕES 11.08
Pode-se estudar essas mutações do que utilizando a PCR
 Genes recessivos podem ficar silenciados em uma geração e aparecer depois por isso não confiar na pergunta do oncologista sobre se é hereditário ou esporádico
Alterações no DNA que criam variantes genéticas: aleatória (mutação), recombinação (intencional). Entra humanos a variabilidade genética é menos de 1%. Ambas são importantes para a evolução 
Recombinação (crossing-over) acontece apenas na gametogênese, é a troca dos segmentos (grupo de genes) de cromossomos homólogos. É programada
Mutação é a alteração da sequência de genes no DNA, que podem ser herdadas, sendo fonte primária do processo evolutivo e podendo causar atraso mental em crianças (3% é genético); Causas genéticas: Anomalias cromossômicas, anomalias monogenéticas, síndromes identificáveis; Causas ambientais: Teratógenos, lesões intraparto, infecções - encefalite e meningite, etiologia desconhecida. Podem ser espontâneas ou induzidas.
Podem ocorrer em dois tipos de células: somáticas (não hereditárias) e germinativas (hereditárias)
Podem ser divididas em: gênica¹ (o gene selvagem sofre uma mutação e gera uma variedade envolvendo eventos como substituição, adição e deleção) e cromossômica (estruturais, o cromossomo quebra, ou numéricas, aumenta ou diminui o nº de cromossomos). 
O ambiente é nocivo faz com que o DNA sofra alterações com grande facilidade
Multações aleatórias (espontâneas) estão sempre acontecendo a cada divisão celular, criando um DNA melhor mas podem acontecer erros tipo o câncer. Os mecanismos são erros de replicação e lesões espontâneas -> mutações de ponto (alteração em um único par de bases): substituição ou deleção. Outros mecanismos são estruturais depurinação, a desaminação e a oxidação. O DNA sofre lesões devido a atividade aeróbica
Depurinação: quebra da ligação hemiglicosídica entre o açúcar e a base (é uma ligação hemiglicosídica porque o carbono 1 do açúcar está ligado ao nitrogênio da base)-> sai a base e fica a ligação de um nucleosídeo com DNA. Os mecanismos colocam uma base para tentar reparar, as vezes não é a mesma base e isso pode ser um fator indutor de mutações.
 Desaminação: a base perde o grupo amino e fica com uma ligação dupla O, virando outra (citosina -> uracila) favorecendo ligação de pareamento errado.
Processos de oxidação: No processo de respiração aeróbica há a produção de superóxidos, de hidroxilas e de peróxido de hidrogênio, que são os famosos radicais livres. Essas moléculas são altamente reativas: podem levar a célula a apoptose, porque podem se ligar aos fosfolipídeos e causar o rompimento da membrana, ou lesões/mutações no DNA. Mecanismos celulares para combater esses radicais livres são os peroxissomos, mas esses têm limite.
O DNA possui regiões ‘lixo’ (que não tem uma função específica)para proteger as partes ativas, gerando estabilidade genética, importante para evolução. Essa região conserva características humanas, contém íntrons que participam da expressão gênica e protege, dentre outras funções não descobertas.
Erros de replicação: formação de um par errado durante a replicação do DNA uma das responsáveis para que o erro não aconteça é a polimerase. DNA pol sabe se deve colocar um T ou G testando pelas pontes de hidrogênio e simetria da fita simples, uma vez que ela carrega os 4 nucleotídeos, mas se aquela molécula estiver numa conformação que favoreça o pareamento errado, ela vai errar. Lembrando que ela tem atividade de polimerização (sentido 5’ – 3 ‘) e exonuclease (sentido 3’ – 5’ que corrige).Mesmo assim acontecem erros e em G1 existem proteínas especializadas em identificar pares de bases incomuns e corrigir (por exemplo A-G). Obs. se o par estiver certo mas na sequencia errada ela não corrige. A célula tumoral se divide em 10 horas pulando a fasenG1 (onde se verificam os erros) e a G2.
Mutações gênicas do tipo substituição ocorrem principalmente na fase S,: transversões (troca purina por pirimidina ou o contrário) e transições (troca purina por purina ou pirimidina por pirimidina). As transições são muito mais comuns. Pode-se unir duas purinas (A-G) mas isso não é sustentável por que não é simétrico e o DNA fica deformado na forma de “calo” reconhecido pelos mecanismos de reparo como mutação. No espaço constante de um filamento de DNA para o outro cabem 3 anéis aromáticos (purina tem dois e pirimidina tem 1 anel). Se colocarem 2 ou 4 anéis fica quimicamente insustentável. Transições são mais comuns pq só se trocam as bases, a simetria é a mesma. 
DNA dependendo das condições fisiológicas pode assumir forma tautomérica, que causa a substituição, (trocar a posição de alguns átomos da molécula mantendo o seu número). Forma IMINO e AMINO da adenina (alterando a posição de um átimo vc pode alterar a forma de se ligar e induzir um erro).
“A timina por exemplo quando sai da sua forma CETO e vai para ENÓLICA fica parecida com citosina (pontes de hidrogênio). DNA polimerase irá ser induzida ao erro e ligará uma guanina na timina, porque ela tá achando que aquilo é uma citosina.” Guanina na forma enólica parece com adenina e citosina parece com timina.
Os processos de reparo do DNA, agem após a replicação, esses mecanismos estão sempre atentos e entre eles estão as proteínas supressoras de tumor (BRCA1, BRCA2, P53, PRB)
Ele vai saber qual a base certa pra riscar porque o DNA tem um código para dizer o que é certo -> metilação do grupo CG: a fita mãe já está metilada, a fita filha vai ser metilada depois, logo ele se guia pela mãe para corrigir a filha identificando também qual a fita velha e qual a fita nova. Obs a metilação da fita filha é feita após 5 minutos para os mecanismos de reparo corrigirem
O RNA é instável pq faz interação intramolecular, seus nucleotídeos se ligam aos seus próprios nucleotídeos por causa da presença da hidroxila que se liga e forma água. O RNA no espaço encosta na água e se liga, logo o gene não fica acessível para a transcrição sendo silenciado
Pode-se alterar um par de base e não alterar a expressão de uma proteína não sendo quantificado como substituição. Por isso acredita-se que inserção e deleção ocorrem em maior quantidade por ser mais fácil de identificar já que a chance de se expressar na produção de proteínas é maior.
Mutações gênicas do tipo inserção ou deleção acontece pq é adicionado ou retirado um par de nucleotídeos, mudando a matriz de leitura. Podem ser induzidas por radiação ionizante (quebra as duas fitas, podendo ocorrer perda de algumas bases, mas a célula continua viva)
Uma proteção contra mutações por substituição é o código genético ser degenerado (existir mais de um códon pro mesmo aminoácido) garantindo que podemos alterar o códon, mas não necessariamente alterar o aminoácido. Obs. não funciona para a inserção, porque ao adicionar uma base, todas as outras assumem uma posição a mais e os códons são alterados. Todo o quadro de leitura é alterado.
Quanto maior o numero de repetições mais vai produzir aminoácidos a mais e isso vai alterar a estrutura da proteína que começa a ganhar e realizar outras funções
Repetições trinucleotídicas: O DNA moldepossui número de repetições das ilhas CAG definidos -> forquilha aberta na replicação -> interações entre as ilhas -> forma um laço no DNA -> Puxa a parte já sintetizada de CAG -> Produção de mais CAG-> Acúmulo de repetições. 
Mecanismos Induzidos: são compostos químicos, quimioterápicos, antivirais e as radiações. Muitos induzem mutações por bloquear a síntese numa célula porém ele não é específico para a célula mutante, atingindo também células saudáveis (por isso a quimio n é tão eficaz). Eles funcionam imitando um nucleotídeo (pq tem afinidade com as pontes de hidrogênio), substituindo-o no dna, silenciando podendo bloquear a síntese e interferir na expressão
OBS: PET Scan é usado em diagnóstico precoce de câncer é ingerido uma glicose marcada (cor devido a um metal associado), como as células cancerígenas têm alta atividade metabólica logo a maioria da glicose vai para o tumor, no escaneamento as células estão com uma mancha, que representa o local do tumor.
A radiação ultravioleta (sol) pode ser UVA, UVB ou UVC. Sendo as UVA e UVB mais perigosas. Na exposição ao sol a radiação causa torção no DNA incentivando duas pirimidinas adjacentes da mesma fita se ligarem, ao invés de interagirem com as bases de outra fita (pq é energia). A ligação entre as duas pirimidinas causa um calo no DNA, mas existe mecanismo que quebra e corrige esse erro. As radiações ionizantes tem mais energia que as ultravioletas causando quebra na dupla fita de DNA.
Mutação silenciosa: Troca um códon por outro códon para um mesmo aminoácido.
Mutação para o sentido trocado um códon de um aminoácido é trocado pra um códon de outro aminoácido (nem sempre altera a função da proteína pq o aminoácido pode ter a mesma função). Conservativa: substitui um aminoácido por outro quimicamente similar; não conservativa: o aminoácido é substituído por outro quimicamente diferente.
Mutações sem sentido: o códon é trocado por stop códon e não haverá produção de proteína.
Mutação reversa: um par de bases que sofreu mutação reestabelece a sequência original
Mutação de perda de função: ausência completa ou parcial do funcionamento de uma proteína
Mutação de ganho de função: produz uma nova característica (pode ser no tecido errado)
Mutações Letais: causam morte prematura
Mutações Cromossômicas: Numéricas (EUPLOIDIAS: multiplicação do cariótipo; raro em animais; vida curta geralmente ovócito fecundado por dois espermatozoides; falha meiótica no espermatozoide ou ovócito/ ANEUPLOIDIAS: alterações no numero de cromossomos; compatível com a vida); Estruturais (DEFICIENCIA OU DELEÇÃO: perda de um pedaço do cromossomo, terminal ou intersticial/DUPLICAÇÃO: cromossomo com porção duplicada, fator de variabilidade genética/ INVERSÃO: mudança na sequencia dos genes, causa esterilidade masculina/TRANSLOCAÇÃO: troca de pedaço entre dois cromossomos não homólogos sem perda de material/ROBERTSONIANA: translocação entre cromossomos acrocêntricos/ CROMOSSOMO EM ANEL: duas deleções terminais unindo as extremidades/ ISOCROMOSSOMO: erro durante a divisão celular.)