Capitulo-FISH

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CAPÍTULO 1
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS
Marcelo Guerra
Departamento de Botânica – UFPE
A técnica de hibridização in situ (HIS) consiste basicamente no pareamento de
determinado segmento de DNA ou RNA com uma seqüência de nucleotídeos
complementar situada dentro da célula, visando – verificar se a célula possui essa
seqüência e qual a sua exata localização. Para visualizar o segmento de DNA ou
RNA hibridizado é necessário que ele esteja marcado com alguma molécula de fácil
identificação, funcionando como uma sonda para detectar a seqüência com-
plementar de nucleotídeos – chamada seqüência-alvo. O híbrido sonda/alvo pode
ser DNA/DNA, RNA/RNA ou DNA/RNA.
A HIS tem sido utilizada para localizar as mais diversas seqüências de
nucleotídeos, como um gene de cópia única, moléculas de RNA mensageiro ou um
DNA viral inserido no cromossomo. Neste capítulo, serão revisados alguns aspectos
gerais da hibridização de sondas de DNA com o DNA cromossômico. Um maior
detalhamento da bioquímica de hibridização dos ácidos nucléicos pode ser
encontrado em Lara (2002).
O PRINCÍPIO GERAL DA TÉCNICA
A técnica baseia-se no fato de que o DNA é formado por duas fitas complementares,
as quais podem ser facilmente separadas em fitas simples, ou desnaturadas, e
posteriormente renaturadas, voltando ao estado de fita dupla. Se, durante a
renaturação do DNA cromossômico, houver sonda disponível no meio em torno do
cromossomo, as cópias da sonda competirão com as fitas do DNA cromossômico e
poderão ser hibridizadas in situ, isto é, no sítio exato onde aquela seqüência ocorre
naturalmente. A Figura 1.1 esquematiza as principais etapas da técnica de HIS.
Essa técnica foi utilizada pela primeira vez por Gall e Pardue (1969) para
análises cromossômicas e por Buongiorno-Nardeli e Amaldi (1969) em cortes
histológicos. Graças à sua alta especificidade e aos melhoramentos técnicos
introduzidos nos anos seguintes, a HIS se transformou em uma das técnicas mais
informativas e elegantes da citologia, sendo aplicada em áreas tão diversas quanto
2 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
a biologia do desenvolvimento, a citotaxonomia, a citogenética clínica e o
melhoramento genético.
Figura 1.1 Principais etapas da técnica de hibridização in situ. A marcação da sonda (a)
é feita independentemente da preparação da lâmina (b). Em seguida, a sonda e o DNA
cromossômico são desnaturados (c, d) e, quando colocados em contato, a sonda hibridiza
in situ (e) com o DNA-alvo. A marcação da sonda pode ser detectada por anticorpos ligados
a fluorocromos (f) e visualizada diferencialmente ao microscópio (g).
Muitos artigos, especialmente os iniciais, descrevem extensamente a meto-
dologia empregada (veja, por exemplo, Gall e Pardue, 1969; Ambros et al., 1986).
Dois textos gerais, muito didáticos e bastante informativos dos princípios da técnica
e dos protocolos mais freqüentemente utilizados, foram publicados por Leitch et
al. (1994) e Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000). Uma descrição das variantes
empregadas na HIS, incluindo seu uso na microscopia eletrônica e em cortes
histológicos, o uso de sondas de RNA e de marcação com radioisótopos, pode ser
encontrada em Polak e McGee (1990). As principais aplicações e alguns dos
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 3
resultados mais importantes obtidos em diversas áreas da citogenética serão
apresentados nos demais capítulos deste livro.
A PREPARAÇÃO DA LÂMINA
Embora permita alcançar os objetivos em poucos experimentos e apresente boa
repetibilidade de resultados, a HIS é um procedimento relativamente longo e
dispendioso, exigindo controle rigoroso da qualidade das lâminas. Lâminas com
muitas metáfases e com cromossomos bem espalhados são fundamentais para se
obterem resultados inequívocos e tornar a técnica economicamente viável. A
preparação das lâminas segue os mesmos procedimentos utilizados na preparação
de lâminas para a coloração com fluorocromos, apresentados detalhadamente por
vários autores (veja, por exemplo, Guerra e Souza, 2002).
Para controlar a qualidade das lâminas, antes de serem utilizadas na HIS, elas
podem ser analisadas na microscopia de contraste de fase, que permite visualizar os
cromossomos sem corantes, ou após coloração rápida, por exemplo, com DAPI
(abreviatura do corante fluorescente 4’-6-diamidino-2-phenilindole). As melhores
lâminas devem ser descoradas e estocadas secas em caixas hermeticamente fechadas
a –20 ou –80 oC. Nessas condições, as lâminas podem ser conservadas por alguns
meses antes de serem utilizadas para HIS. Em alguns organismos nos quais a técnica
de preparação de lâminas produz um grande número de boas metáfases, como em
humanos e mamíferos em geral, esse controle de qualidade é simplificado ou
dispensado.
TIPOS DE SONDAS
Sondas são seqüências de DNA isoladas que se encontram representadas no
cromossomo uma única vez ou que apresentam milhares de cópias em cada
cromossomo. Essas seqüências repetidas podem estar organizadas no cromossomo
em tandem, ou seja, uma em seguida à outra, formando blocos relativamente grandes
de DNA-alvo, ou podem se encontrar dispersas no complemento cromossômico,
intercaladas com diversos outros tipos de seqüências.
SONDAS DE SEQÜÊNCIAS REPETITIVAS ORGANIZADAS EM TANDEM
Os primeiros trabalhos com HIS utilizaram como sonda seqüências de DNA que
se encontravam repetidas em tandem. Entre essas, as mais fáceis de serem isoladas
e localizadas são os DNAs satélite, o gene que codifica o RNA ribossomal 5S e a
4 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
seqüência que codifica o precursor 45S dos RNAs ribossomais 28S, 18S e 5,8S,
geralmente referidos como DNAr 5S e 45S, respectivamente.
Uma característica importante dos DNAr 5S e 45S é que a seqüência de
nucleotídeos desses genes é muito conservada evolutivamente, o que significa que
elas são muito similares em todos os eucariotas. Por exemplo, uma sonda de DNAr
45S produzida a partir do genoma de trigo, denominada pTa71 (Gerlach e
Bedbrook, 1979), foi utilizada para localizar o DNAr em muitas outras plantas,
inclusive gimnospermas e pteridófitas (veja, por exemplo, Kawakami et al., 1999;
Murray et al., 2002), e até mesmo em organismos tão diferentes quanto peixes
(Pendas et al., 1993) e gafanhotos (Rocha, 2002).
O DNA ribossômico 45S, geralmente referido apenas como DNAr, é uma
seqüência moderadamente repetitiva, que forma blocos com muitas repetições, em
um ou mais pares cromossômicos. Cada unidade de repetição contém três genes
(DNAr 18S+5,8S+28S) e seus espaçadores, sempre transcritos juntos em um
único RNAm. Os sítios do DNAr 45S correspondem às constrições secundárias,
observadas por técnicas de coloração convencional. Entretanto, sítios muito
pequenos ou pouco ativos podem não ser visíveis com essas técnicas mas serem
detectados com HIS. No feijão caupi (Vigna unguiculata), por exemplo, apenas um
ou dois cromossomos são observados com constrições secundárias, enquanto com
HIS aparecem blocos de DNAr 45S em cinco dos seus 11 pares cromossômicos
(Guerra et al., 1996). No homem, os genes de DNAr 45S estão nas constrições
secundárias dos cromossomos acrocêntricos 13, 14, 15, 21 e 22, havendo cerca de
150 a 200 cópias no genoma.
A seqüência do DNAr 5S é um pouco mais variável que a do DNAr 45S.
Cada espécie possui, geralmente, uma só seqüência de DNAr 5S repetida muitas
vezes em tandem em um único par de sítios cromossômicos ou, menos freqüente-
mente, em dois ou mais pares. No homem, os genes do DNAr 5S estão localizados
no cromossomo 1 (200-300 cópias). Em algumas espécies podem ocorrer seqüên-
cias de DNAr 5S ligeiramente diferentes, formando blocos de repetições distintas,
localizadas por HIS em diferentes regiões do genoma (veja, por exemplo, Martins
e Galetti, 2001).
Afora o DNA ribossômico, duas outras seqüências repetitivas, organizadas em
tandem e de função conhecida, têm sidoamplamente estudadas. A primeira, e mais
conservada, é a seqüência do DNA telomérico (Richards et al., 1993). Esse DNA
ocorre caracteristicamente nas regiões terminais de cada cromossomo, embora
excepcionalmente seja encontrado em outras regiões cromossômicas, princi-
palmente próximo aos centrômeros de alguns animais (veja discussão no Capítulo
4) e plantas (Guerra e Kenton, 1996; Kondo e Tagashira, 1998). A segunda, menos
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 5
conservada evolutivamente, é a seqüência do DNA centromérico, que marca apenas
a região do centrômero. A região centromérica é particularmente complexa,
contendo geralmente grande diversidade de seqüências distintas (Tyler-Smith e
Floridia, 2000).
Diversos outros tipos de seqüências repetidas em tandem têm sido utilizados
como sondas, destacando-se os DNAs satélite e os microssatélite (Heslop-Harrison,
2000). O DNA satélite está composto por unidades formadas por poucas centenas
de pares de bases, repetidas um milhão de vezes ou mais em cada genoma.
Geralmente, o genoma eucariótico apresenta várias seqüências satélite diferentes,
podendo algumas seqüências ser exclusivas de uma única espécie ou de um grupo
de espécies relacionadas. Sua localização freqüentemente coincide com a dos blocos
de heterocromatina detectados pela técnica de bandeamento C. Entretanto,
diferentes bandas C, ou mesmo uma única banda C, podem ser formadas por
diferentes seqüências satélite. Os microssatélite são formados por unidades com
apenas 1 a 5 nucleotídeos, repetidas um número variado de vezes em muitas regiões
do genoma. Alguns desses sítios alcançam um número de repetições suficientes
para serem visualizados por HIS (veja, por exemplo, Vanzela et al., 2002).
SONDAS DE DNA REPETITIVO DISPERSO
Além das seqüências repetitivas organizadas em tandem, há um grande número de
seqüências moderadas a altamente repetitivas dispersas ao longo dos cromossomos.
Essas seqüências estão geralmente relacionadas aos elementos transponíveis. No
homem, e na maioria dos eucariotas, grande parte do genoma é derivada de
elementos transponíveis, principalmente as seqüências conhecidas como LINEs,
SINEs (predominantemente Alu), retrotransposons LTR e transposons de DNA.
A seqüência mais abundante no genoma humano, Alu, possui cerca de 280 pb
formando um dímero com subunidades ligeiramente diferentes. Essa seqüência está
representada por mais de um milhão de cópias espalhadas por todos os cro-
mossomos, ocorrendo, em média, uma cópia a cada 3 kb (Strachan e Read, 1999).
Em plantas, destacam-se os retrotransposons, que são seqüências longas de DNA
que podem ser transcritas para RNA pelo sistema de transcrição normal da célula
e novamente transcritas para DNA pelo gene da transcriptase reversa do
retrotransposon. Na forma de DNA livre, o retrotransposon pode se inserir noutro
lugar do cromossomo, aumentando assim o número de repetições no genoma. Essas
seqüências representam uma fração considerável do genoma das plantas, princi-
palmente aquelas com grandes cromossomos (Brandes et al., 1997).
6 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Algumas seqüências repetitivas dispersas são tão abundantes que, quando
hibridizadas in situ, marcam uniformemente todo o genoma. Essas seqüências
podem ser utilizadas para distinguir os cromossomos de uma espécie, em um híbrido
interespecífico, ou para distinguir o genoma de um ancestral diplóide em uma
espécie alopoliplóide. Por exemplo, em aveia, um hexaplóide com 2n = 42, foi
encontrada uma seqüência repetitiva que marca igualmente um terço (14) de seus
cromossomos e marca também os 14 cromossomos de uma espécie próxima
diplóide. Isso sugere que esse diplóide, ou uma espécie muito próxima dele, seja
um dos ancestrais da aveia hexaplóide (Linares et al., 1998).
SONDAS DE SEQÜÊNCIAS ÚNICAS OU DE POUCAS CÓPIAS
Com o aprimoramento dos métodos de isolamento, amplificação e detecção de
sondas, muitas seqüências únicas ou de poucas cópias têm sido localizadas in situ.
Essas seqüências podem ser a cópia complementar de um RNA mensageiro
(DNAc), um clone de uma biblioteca genômica, o DNA viral inserido no
cromossomo, fragmentos de restrição do tipo RFLP, etc. O pequeno tamanho é o
principal fator limitante na detecção de seqüências de cópia única, mas diferentes
estratégias foram desenvolvidas para detectar esse tipo de seqüência (veja, por
exemplo, Pedrosa et al., 2002, 2003).
SONDAS GENÔMICAS
Em plantas, principalmente, têm sido muito utilizadas as chamadas sondas genômicas,
formadas pelo DNA genômico total de uma espécie. A sonda genômica, constituída
por um grande número de seqüências únicas e repetitivas, funciona da mesma
maneira que uma seqüência repetitiva dispersa por todo o genoma, marcando todos
os cromossomos igualmente, com a vantagem de ser muito mais facilmente obtida.
Essa técnica, denominada de hibridização genômica in situ ou GISH (Genomic In Situ
Hybridization), tem sido aplicada com sucesso na análise de híbridos interespecíficos
e no estudo evolutivo de diversas espécies poliplóides (Stace e Bailey, 1999). Em
animais, as sondas genômicas também têm sido utilizadas (veja, por exemplo,
Svartman e Vianna-Morgante, 1999), embora esse tipo de sonda encontre aplicação
maior no estudo dos poliplóides – raros em animais.
Por exemplo, para distinguir os cromossomos das duas espécies que deram
origem a um tetraplóide natural, como o tabaco, o DNA total de um dos supostos
pais diplóides é extraído, marcado e hibridizado com os cromossomos do poliplóide
(Figura 1.2). Se a espécie da qual se extraiu o DNA for realmente um dos pais do
tabaco, metade do conjunto cromossômico tetraplóide deverá ser diferencialmente
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 7
marcada (no caso em que cada pai contribuiu com igual quantidade de cro-
mossomos – que é o mais freqüente). Caso não haja marcação, é uma indicação
de que aquela espécie não foi envolvida na formação do tetraplóide. Por outro lado,
se todos os cromossomos hibridizarem com a sonda genômica de um diplóide, é
provável que a espécie em questão seja um autopoliplóide ou descenda de duas
espécies muito próximas (Figuras 1.2 e 2.9).
Figura 1.2 Teste de GISH para identificar a origem de um tetraplóide. Primeiramente é
feito controle positivo, para verificar se o DNA de cada um dos supostos pais (diplóides AA
e BB), hibridija com seus próprios cromossomos (coluna à esquerda), e um controle
negativo, para verificar se não marcam cromossomos da outra espécie (centro). Em seguida,
tenta-se hibridizar o DNA de A e o DNA de B com os cromossomos do tetraplóide
(supostamente AABB). Se o tetraplóide contiver os genomas AABB, metade dos
cromossomos marcarão com o DNA de A e a outra metade, com o DNA de B (em cima e
embaixo à direita). Se o tetraplóide for formado por outros genomas, por exemplo, CCDD,
não será marcado por nenhuma das duas sondas.
Como os dois genomas que formam um híbrido interespecífico geralmente são
muito semelhantes, o DNA marcado de um deles poderá hibridizar indistintamente
com os dois genomas. Para evitar isso, geralmente se adiciona na hibridização o
8 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
DNA marcado de uma espécie junto com o DNA da outra espécie sem marcação
e em concentração mais alta. Este último DNA funcionará como bloqueador (ou
supressor) das seqüências exclusivas desta espécie e das seqüências comuns a ambas.
Dessa maneira, apenas o genoma oriundo do diplóide que está sendo testado
aparecerá marcado.
SONDAS CROMOSSÔMICAS
Um conjunto de seqüências gênicas ou nao-gênicas localizadas em determinado
cromossomo pode ser reunido para formar uma sonda capaz de “pintar” apenas
aquele cromossomo. Para isso é necessário reunir um bom número de seqüências
distintas e que estejam distribuídas aleatoriamente por todo o cromossomo. Dessa
maneira, foram construídas sondas que marcam, distintamente,cada um dos 23
pares de cromossomos humanos em toda a sua extensão. Essa técnica, chamada
de pintura cromossômica (chromosome painting), tem tido numerosas aplicações na
citogenética clínica e no estudo da evolução de aves e mamíferos.
As sondas cromossomo-específicas levaram ao desenvolvimento de técnicas
que permitem corar simultaneamente cada cromossomo humano em uma cor
diferente (ver Capítulos 6 e 7). Para isso foi necessário desenvolver também novos
equipamentos de microscopia, programas de análise de imagens apropriados e
diversas outras melhorias na técnica e nos reagentes utilizados (Schröck et al., 1996;
Eils et al., 1998). A hibridização de sondas cromossomo-específicas humanas em
outros mamíferos tornou possível identificar regiões cromossômicas homólogas em
espécies tão diferentes quanto o homem e o cavalo, separados há 70-80 milhões
de anos (Raudsepp et al., 1996). A análise comparada de cariótipos de espécies distintas,
utilizando-se sondas cromossômicas, é denominada Zoo-FISH (Capítulo 4).
Essas sondas permitem também visualizar os cromossomos no núcleo
interfásico, onde se encontram descondensados, formando territórios cromossômicos
individualizados. Nesses casos, a análise cromossômica geralmente é feita em
microscopia confocal, que permite observar o núcleo em numerosos planos focais
distintos e integrar essas imagens em uma reconstrução tridimensional (veja, por
exemplo, Habermann et al., 2001).
Sondas do tipo pintura são também conhecidas para alguns outros mamíferos,
aves e drosófila (Fuchs et al., 1998; Griffin et al., 1999). Em plantas não foi ainda
possível pintar cada um dos cromossomos de um cariótipo distintamente, mas já
são conhecidas pinturas para alguns poucos cromossomos (Schubert et al., 2001).
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 9
OBTENÇÃO DA SONDA
O tipo de sonda mais fácil de ser obtido é o utilizado na hibridização genômica in
situ, formada pelo DNA total, fragmentado e marcado. Se a sonda desejada for um
DNA satélite, ela poderá ser isolada do DNA total da espécie por intermédio de
um gradiente de densidade. Nesse caso, o DNA satélite é separado do DNA principal
pela diferença na proporção de AT:GC entre essas duas frações, que se reflete em
diferença de densidade entre elas.
Sondas de DNA satélite são mais facilmente obtidas por digestão do DNA
genômico com enzimas de restrição. Uma enzima de restrição que produza um corte
em uma unidade de repetição produzirá cortes idênticos em todas as demais
unidades desse DNA repetitivo organizado em tandem. Isso resultará na formação
de fragmentos de DNA de igual tamanho, os quais aparecerão em um gel de
eletroforese como uma banda característica. Eventualmente, alguns monômeros
poderão conter mutações no sítio de restrição, levando à formação de dímeros,
trímeros, etc., produzindo no gel de eletroforese um padrão de bandas em escada.
Esse padrão também pode ser obtido quando se realiza digestão enzimática por
tempo insuficiente para que ocorram todos os cortes (digestão parcial). Em ambos
os casos, o padrão de bandas em escada constitui indicação clara de que o DNA
repetitivo se encontra em tandem. A banda produzida pela digestão total contendo
os monômeros poderá ser recortada do gel e seu DNA poderá ser extraído, marcado
e utilizado como sonda.
No caso do DNA repetitivo disperso, o isolamento dessa seqüência deverá
ser feito a partir de uma biblioteca genômica (coleção de fragmentos de DNA
inseridos em vetores de clonagem que juntos cobrem todo o genoma de um
organismo), exigindo grande número de testes para encontrar a seqüência
repetitiva desejada.
Seqüências muito pequenas, como o DNA telomérico ou os microssatélite,
podem ser sintetizadas por encomenda a laboratórios especializados. Sondas para
genes específicos podem ser obtidas diretamente a partir do RNAm citoplasmático,
transcrito para DNA (DNAc) por meio da enzima transcriptase reversa e
amplificado em um sistema de clonagem bacteriano. Diversas sondas podem
também ser obtidas por PCR, desde que se conheçam as seqüências que flanqueiam
o DNA-alvo, de maneira a permitir escolher os iniciadores de síntese (primers)
corretos. Neste caso, a mistura de nucleotídeos que fornece a matéria-prima para
a síntese das novas cadeias pode conter uma fração de nucleotídeos marcados,
permitindo que se faça amplificação e marcação da sonda simultaneamente.
10 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Muitas dessas seqüências podem ser obtidas comercialmente ou como
amostras cedidas por outros laboratórios. Algumas, como as de DNAr 5S e 45S,
foram inicialmente isoladas e amplificadas em um laboratório e cordialmente
cedidas a pesquisadores de outros laboratórios, não existindo comercialmente.
OBTENÇÃO DE SONDAS PARA PINTURA CROMOSSÔMICA POR CITOMETRIA
OU MICRODISSECÇÃO
Para a obtenção de uma sonda cromossomo-específica é necessário primeiramente
isolar certa quantidade de cromossomos do tipo que se quer pintar. Para isso, as
técnicas mais utilizadas são a de separação por fluxo e a microdissecção.
A separação por fluxo (flow sorting) é uma variação de uma técnica mais
amplamente utilizada, denominada citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi
inicialmente utilizada para distinguir e quantificar tipos de células ou núcleos em
solução e, posteriormente, para identificar cromossomos (Melamed et al., 1990).
Neste caso, uma solução com cromossomos corados é impelida através de um canal
extremamente fino e liberada na forma de gotas minúsculas, cada uma contendo
no máximo um cromossomo. Os corantes utilizados são geralmente fluorocromos,
principalmente o Hoechst 33258 (geralmente referido simplesmente como Hoechst),
o DAPI ou o iodeto de propídeo. Quando uma gota contendo um cromossomo
atravessa um feixe de raios laser, o cromossomo corado fluoresce e a quantidade
de luz emitida é medida por um detector de fluorescência (Figura 1.3). Como a
quantidade de fluorocromos ligados ao cromossomo é proporcional à sua quan-
tidade de DNA, cromossomos com diferentes quantidades de DNA podem ser
distinguidos por sua fluorescência.
Se o cariótipo contiver cromossomos muito semelhantes na quantidade de
DNA, a distinção entre eles poderá ser feita pela proporção de AT:GC que
apresentem. Para isso é necessário fazer uma dupla coloração, utilizando-se
simultaneamente um fluorocromo que se liga preferencialmente a regiões ricas em
AT (o DAPI ou o Hoechst) e outro com maior afinidade por GC (geralmente a
cromomicina A3). Esses fluorocromos emitem luz com comprimentos de onda
diferentes, permitindo que a quantidade de cada um seja medida separadamente.
Dessa maneira, a proporção de AT:GC daquele cromossomo é estimada, permitindo
sua identificação.
Uma vez que cada cromossomo possa ser reconhecido, o citômetro pode ser
programado para deslocar determinado cromossomo do fluxo de microgotas e
coletá-lo em um recipiente à parte (nesse caso, a técnica é então denominada
separação por fluxo). Para isso, a microgota com o cromossomo especificado
receberá uma carga elétrica, permitindo posteriormente deslocá-la do fluxo por
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 11
placas defletoras (Figura 1.3). Cromossomos humanos e de várias espécies animais
e vegetais têm sido isolados por essa técnica (Monard e Young, 1995; Dolezel et
al., 1999).
Figura 1.3 Esquema da separação cromossômica por fluxo. Gotas contendo determinado
cromossomo podem ser reconhecidas pela fluorescência do cromossomo, marcadas com uma
carga elétrica e desviadas do fluxo normal para um coletor à parte.
Os cromossomos podem também ser isolados por meio de microdissecção.
Nesse caso, determinado cromossomo é isolado de algumas metáfases espalhadas
em uma lamínula, utilizando-se um aparelho de micromanipulação. A
micromanipulação permite também isolar apenas um braço cromossômico ou
mesmo determinada banda C ou G (Senger et al., 1990; Cannizzaro,1996). Dessa
maneira, é possível produzir sondas específicas para regiões cromossômicas bem
pequenas.
Uma vez isolado um pequeno número de cromossomos iguais, suas diversas
seqüências de DNA devem ser amplificadas para produzir uma quantidade
adequada para hibridização e para estoque. Essas seqüências amplificadas devem
12 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
ser separadas por eletroforese, isoladas e testadas como sondas para HIS. Aquelas
que hibridizarem unicamente, ou predominantemente, em um cromossomo serão
utilizadas para compor a sonda cromossômica.
AMPLIFICAÇÃO DA SONDA
Da mesma maneira que as sondas cromossomo-específicas, os demais tipos de
sonda precisam também ser amplificados, para se dispor de um estoque da sonda.
A amplificação geralmente é feita pelos métodos usuais de clonagem. Para isso a
seqüência a ser amplificada deve ser inserida em um vetor, por exemplo um
plasmídio bacteriano, que é introduzido na Escherichia coli. A multiplicação da
bactéria resulta na multiplicação do plasmídio e, conseqüentemente, na ampli-
ficação do número de cópias da seqüência de DNA inserida, ou inserto. Quando
a colônia bacteriana é suficientemente grande, as bactérias são lisadas e os
plasmídios (em número de milhões) são isolados. A sonda pode ser preparada com
o plasmídio inteiro (o DNA estritamente plasmidial não deve ter correspondência
no DNA cromossômico e por isso não interfere na hibridização) ou o inserto pode
ser retirado do plasmídio, por meio de enzimas de restrição, e separado por
eletroforese.
Os plasmídeos bacterianos aceitam geralmente insertos de até 10 kb de
tamanho. Para amplificar seqüências maiores poderá ser necessário utilizar outro
tipo de vetor, como os cosmídios (insertos de 30 a 44 kb), bacteriófago P1 (70-100
kb), PACs (130-150 kb), BACs (até 300 kb) ou YACs (0,2 a 2 Mb).
A técnica de PCR pode ser utilizada na amplificação de fragmentos de DNA
cuja seqüência de nucleotídeos é conhecida, como o DNAr 5S ou 18S. No caso de
cromossomos isolados para obtenção de sondas cromossomo-específicas, todo o DNA
precisa ser amplificado. Nesse caso, a amplificação é feita por um tipo particular de
PCR, denominado DOP-PCR (degenerate oligonucleotide-primed PCR). Esta PCR
utiliza iniciadores de síntese com seqüências muito variadas, que irão se ligar em um
grande número de sítios, amplificando qualquer DNA fornecido como molde.
TAMANHO DA SONDA
O tamanho dos segmentos a serem hibridizados é crítico nos experimentos de HIS,
sendo o tamanho ideal entre 50 e 500 nucleotídeos. Seqüências maiores ou
menores podem ser utilizadas, mas apresentam problemas adicionais. Se a
seqüência a ser hibridizada contiver 20 kb, por exemplo, ela deverá ser quebrada
em fragmentos menores, em torno de 400-500 pb. Seqüências muito pequenas,
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 13
como os oligonucleotídeos, têm baixa estabilidade em razão do pequeno número
de pontes de hidrogênio. Além disso, têm maior chance de hibridizar com
seqüências não-alvo casualmente complementares (hibridização cruzada). No caso
dos microssatélite, por exemplo, a sonda deve ser formada por algumas unidades
repetidas, como (GATA)7, (GAA)10 ou (AG)12.
Seqüências muito longas, além de apresentarem menor acesso ao
cromossomo, em razão da maior dificuldade de penetrar na célula e alcançar o alvo,
têm freqüentemente pequenas seqüências de DNA repetitivo disperso, respon-
sáveis por pareamentos fora do DNA-alvo. Essas sondas devem ser fragmentadas,
desnaturadas e pré-hibridizadas em uma solução contendo um excesso de cópias
do DNA repetitivo disperso (bloqueador ou supressor). Dessa maneira, os
fragmentos da sonda que apresentam DNA repetitivo vão formar fitas duplas com
o DNA repetitivo em excesso e serão bloqueados, enquanto os demais perma-
necerão como fita simples e poderão hibridizar com o DNA-alvo (Lichter e Cremer,
1992).
MARCAÇÃO DA SONDA
MARCAÇÃO COM ISÓTOPOS RADIOATIVOS
Inicialmente, as sondas de DNA ou RNA eram marcadas exclusivamente com
isótopos radioativos, produzindo as chamadas sondas quentes. O isótopo mais
comumente empregado é o trítio (3H), por emitir radiação de baixa energia,
garantindo melhor resolução da sonda. Por outro lado, o trítio tem a desvantagem
de exigir exposição demorada, usualmente acima de duas semanas (compare esses
dados na Tabela 1.1). Em alguns experimentos é preferível utilizar um radioisótopo
de mais alta emissão de energia, como o 32P, embora a resolução da sonda seja
sensivelmente reduzida em decorrência de maior dispersão da radiação.
Tabela 1.1 Características principais dos radioisótopos mais utilizados na HIS (baseada em
Leitch et al., 1994).
Isótopo 
Energia de emissão 
máxima (MeV) 
Resolução (µm) 
Tempo de exposição 
aproximado (dias) 
Meia-vida 
3H 0,018 0,5-1 15-100 12,4 anos 
125I 0,004 1-10 12-20 60 dias 
35S 0,167 10-15 12-20 87,4 dias 
32P 1,710 20-30 2-5 14,3 dias 
14 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Na marcação com radioisótopos, geralmente usa-se a dUTP ou a dATP
tritiada. Depois de hibridizada, a sonda é localizada por autorradiografia. Para isso,
a lâmina é coberta com uma fina camada de uma emulsão fotossensível que
funciona como um filme fotográfico. A radiação emitida pela sonda sensibiliza os
sais de prata da emulsão, que depois de convenientemente revelados e fixados
aparecem como pequenas manchas pretas em cima do local onde a sonda se
encontra. Ao final os cromossomos são levemente corados, geralmente com
Giemsa, para permitir reconhecer a localização das sondas.
Esse método tem a vantagem de ser extremamente sensível, permitindo
revelar a posição de seqüências-alvo muito pequenas. Por outro lado, o uso de
isótopos radioativos apresenta uma série de incovenientes. Os mais evidentes são
o perigo que representam para a saúde do pesquisador, a maior instabilidade e baixa
meia-vida, a produção de lixo radioativo, menor resolução e o fato de que exigem
tempo de exposição muito longo para a sensibilização adequada do filme. Cionini
et al. (1982), por exemplo, utilizaram 100 a 150 dias de exposição para obter uma
localização clara de uma marcação com trítio em cromossomos politênicos de
Phaseolus.
MARCAÇÃO NÃO-ISOTÓPICA
Atualmente, para HIS, usa-se apenas a marcação não-isotópica. Nesse caso, uma
molécula marcadora é acoplada a um dos quatro tipos de nucleotídeos presentes
na sonda, a qual posteriormente é reconhecida por métodos imunológicos ou
similares. Observe que as sondas radioativas possuem apenas substituições de
isótopos, enquanto as não-isotópicas possuem acréscimos de moléculas à sonda.
Há duas maneiras distintas de marcar uma sonda não-radioativa: a marcação
direta, que utiliza fluorocromos acoplados diretamente aos nucleotídeos, e a
marcação indireta, na qual os nucleotídeos são acoplados a uma molécula marcadora,
a qual é posteriormente ligada a um fluorocromo ou a um outro sistema de
coloração. A marcacão indireta tem sido mais utilizada em razão de sua maior
sensibilidade e por permitir mais facilmente amplificar o sinal emitido pela sonda.
Entretanto, as sondas que podem ser compradas prontas no comércio são marcadas
diretamente com fluorocromos e são muio eficientes.
As moléculas marcadoras mais utilizadas na marcação indireta são a biotina
e a digoxigenina. A biotina é um tipo de vitamina H, obtida da clara do ovo, que
pode ser ligada ao nucleotídeo pelo carbono 5 do anel pirimidínico. A digoxigenina
é um alcalóide extraído de plantas conhecidas como “dedaleira” (Digitalis purpurea
e D. lanata) e liga-se ao anel pirimidínico da mesma maneira que a biotina. Essa
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 15
ligação normalmente é feita por meio de uma molécula espaçadora longa, de forma
a evitar interferência estereoquímica que afete o pareamento da sonda com o
DNA-alvo ou reduza a eficiência do reconhecimento posteriorda molécula
marcadora (Figura 1.4). O tamanho da molécula espaçadora depende basicamente
do número de átomos de carbono que ela possui, e isso geralmente vem indicado
junto com o nucleotídeo marcado. Por exemplo, a biotina 16-dUTP possui uma
molécula espaçadora com 16 átomos de carbono separando a biotina do
nucleotídeo (Figura 1.4a).
Figura 1.4 Configuração bidimensional de algumas moléculas marcadoras. (a) Biotina
ligada ao trifosfato de desoxiuracila (16-dUTP) por uma molécula espaçadora (linha
sanfonada no centro da molécula). (b) Digoxigenina 11-dUTP. (c) Fotobiotina, mostrando
a biotina (à direita) ligada a um grupo azil arida por uma molécula espaçadora. Na molécula
espaçadora das três figuras os átomos de carbono estão localizados nas dobras da cadeia.
A seguir, será discutida apenas a marcação não-isotópica, em razão de sua
maior importância na HIS, embora os princípios básicos da técnica sejam os
mesmos para ambos os tipos de marcadores. Serão enfatizados também os
procedimentos relacionados à marcação indireta, por ser a mais utilizada.
16 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
MÉTODOS DE MARCAÇÃO DA SONDA
A marcação da sonda pode ser feita por métodos químicos ou enzimáticos. Em ambos
os casos, geralmente apenas um dos quatro tipos de nucleotídeos é marcado, de forma
a evitar alterações na estereoquímica da sonda que possam afetar sua capacidade de
ligação com o DNA-alvo. Na marcação por métodos químicos, a molécula marcadora
é adicionada diretamente à sonda. A fotobiotina, apresentada na Figura 1.4c, é um
dos marcadores não-radioativos mais utilizados em métodos químicos. Essa molécula
se caracteriza pela presença de um grupo aril, situado numa extremidade de um braço
longo que a separa da biotina. Em presença de luz intensa, o grupo aril se torna
reativo, podendo se ligar à citosina da sonda (Coulton, 1990).
Nos métodos enzimáticos, um dos tipos de nucleotídeos normais é substituído
por nucleotídeos previamente marcados. Essa marcação é feita quase sempre pela
técnica de nick-translation (deslocamento de corte) ou por PCR (discutida noutro
tópico) e, menos freqüentemente, por random primers (iniciadores de síntese
aleatórios). Embora mais baratos, os métodos químicos são geralmente mais tóxicos
e menos específicos que os enzimáticos e por isso só raramente são utilizados.
MARCAÇÃO POR NICK-TRANSLATION
Na marcação por nick-translation, a sonda é misturada com os quatro nucleotídeos
não-marcados (dNTP) e mais um deles marcado (dUTP ou dATP), além de DNase
I e DNA-polimerase I. A DNase I é uma endonuclease que corta cada uma das duas
cadeias do DNA em pontos aleatórios (Figura 1.5a, b). Se a reação for excessivamente
prolongada, a DNase I degrada inteiramente o DNA. Utilizando tempo e concentra-
ção adequados, e na presença de íons Mg2+, ela gera uma série de cortes em ambas
as fitas, a partir dos quais a DNA-polimerase I inicia a síntese das novas cadeias. A
DNA-polimerase I tem duas funções distintas: polimerizar o DNA no sentido 5'→3'
e despolimerizar a cadeia no sentido 5'→3' ou 3'→5'. Entretanto, se houver um corte
em só uma das fitas, ela despolimerizará no sentido 5'→3' e simultâneamente realizará
nova polimerização no mesmo sentido. Portanto, a DNA-polimerase I reconhece os
cortes simples deixados pela DNase I e atua no sentido 5'→3', despolimerizando os
nucleotídeos à sua frente e repolimerizando atrás de si (Figura 1.5c, d, e). O resultado
é que o corte inicial vai sendo deslocado para o final 3' da fita. Esse processo ocorre
igualmente nas duas fitas e, ao final, ambas as fitas terão seus nucleotídeos
substituídos por novos, conservando a mesma seqüência original.
Observe que nesse processo a quantidade de sonda disponível no final é a
mesma do início da reação. Durante a etapa da polimerização, a enzima utiliza os
nucleotídeos existentes no meio, inclusive os nucleotídeos marcados. A concentração
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 17
do nucleotídeo marcado deve ser mais alta que a desse mesmo nucleotídeo não-
marcado, para compensar sua menor receptividade pela DNA-polimerase.
Figura 1.5 Marcação da sonda por nick-translation. A sonda em fita dupla (a) é inicialmente
atacada pela DNase, produzindo cortes aleatórios (setas) nas duas fitas (b). Moléculas de
DNA polimerase se ligam aos sítios cortados (c) e retiram os nucleotídeos à sua frente no
sentido 5'-3' (d). Um novo nucleotídeo é acrescentado à extremidade 3' em cada um dos
espaços vazios criados pela DNA polimerase (e), ficando o corte um nucleotídeo adiante
no sentido 5'-3' (setas). Ao final, todos os nucleotídeos serão substituídos por novos e, em
ambas as fitas, alguns deles estarão marcados.
MARCAÇÃO POR RANDOM PRIMERS
Na técnica de marcação por random primers, a sonda marcada é produzida através
da síntese de uma nova cadeia de DNA. Para isso, a dupla hélice é desnaturada e
uma DNA polimerase produz uma fita marcada complementar a cada uma das fitas
originais. Nesse caso, utiliza-se unicamente uma parte da DNA-polimerase I
(conhecida como fragmento Klenow), contendo apenas o sítio responsável pela
atividade polimerásica 5'→3'. Para ocorrer a síntese da cadeia complementar, é
necessário, além do fragmento Klenow, os nucleotídeos normais e marcados e os
18 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
iniciadores de síntese, que parearão com a fita desnaturada e permitirão à enzima
iniciar a síntese a partir do terminal 3’ livre. Neste caso, usa-se um conjunto de
iniciadores, cada um formado por seis nucleotídeos, contendo praticamente todas
as combinações de A, T, G e C possíveis, de maneira que a síntese poderá iniciar
em qualquer ponto do DNA. Durante a síntese da nova fita, haverá a incorporação
de nucleotídeos marcados, ficando cada dupla-hélice com uma fita marcada e outra
não-marcada (Figura 1.6).
Figura 1.6 Marcação da sonda por random primers. Para iniciar a reação é necessário reunir
a sonda, os nucleotídeos marcados e não-marcados e os iniciadores de síntese (a), além da
polimerase (não representada). Os iniciadores paream com regiões complementares da
sonda desnaturada (b). A partir dos terminais 3' dos iniciadores, novas fitas complementares
às originais são sintetizadas contendo nucleotídeos marcados (c).
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 19
Esse método é recomendado para marcar pequenas quantidades de DNA e
seqüências muito curtas, como as utilizadas para DNA telomérico e microssatélite.
Sua principal desvantagem na HIS é que a cadeia não-marcada compete pelo alvo
com a marcada, diminuindo sua eficiência.
A HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
A etapa de hibridização in situ propriamente dita é aquela em que a sonda e os
cromossomos são desnaturados e hibridizados sob condições controladas. A
desnaturação geralmente é feita por aquecimento da sonda e das lâminas a
temperaturas próximas de 70-80 °C. A lâmina com os cromossomos desnaturados
é coberta com a solução de hibridização contendo a sonda, recoberta com uma
lamínula e deixada geralmente à temperatura de 37 °C, por 18 horas ou mais,
durante as quais ocorrerá a hibridização propriamente dita.
Em seguida, retira-se a lamínula e a lâmina passa pelos chamados banhos ou
lavagens pós-hibridização, em que é eliminado o excesso de sonda, incluindo aquelas
parcialmente pareadas e mais instáveis. Para isso, as lâminas são mergulhadas em
uma cubeta com uma mistura de solução salina-citrato (SSC) e formamida, as quais
possuem efeito antagônico: a solução salina contribui para estabilizar a dupla-hélice
e a formamida, para romper as pontes de hidrogênio. Nesse momento, é
estabelecido o nível de estringência do experimento, ou seja, o nível de exigência para
que sondas parcialmente hibridizadas permaneçam ligadas ao DNA cromossômico.
NÍVEL DE ESTRINGÊNCIA
Tecnicamente, o nível de estringência indica a percentagem mínima de nucleo-
tídeos corretamente pareados, entrea sonda e o DNA-alvo, necessária para manter
a estabilidade da molécula híbrida. Em uma HIS com nível de estringência de 80%,
por exemplo, apenas as cópias da sonda com pelo menos 80% de sua seqüência de
nucleotídeos corretamente pareada com o DNA cromossômico permanecerão
hibridizadas após as lavagens pós-hibridização.
Hibridizações realizadas com nível de estringência alto produzem resultados
mais confiáveis, mas se o DNA-alvo não for abundante e de fácil acesso, poderá
não ocorrer hibridização em muitas células. Por outro lado, reduzindo-se o nível
de estringência, facilita-se o pareamento da sonda com o DNA-alvo, mas aumenta-
se também a chance de pareamento com seqüências não-alvo. Portanto, o nível
de estringência deve ser ajustado para o tipo de DNA-alvo visado.
20 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Os protocolos mais utilizados têm nível de estringência entre 70% e 90%. A
determinação do nível de estringência de uma hibridização depende do tamanho
da sonda, da proporção de AT:GC da sonda e das condições de hibridização e
lavagens pós-hibridização (concentração de formamida e SSC e temperatura,
geralmente de 37 a 42 °C). Como na prática o tamanho e a seqüência da sonda
nem sempre são bem conhecidos, trabalha-se em geral com valores médios para
esses parâmetros, resultando em variação do nível de estringência em torno de 5%
(Leitch et al., 1994). Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) apresentam uma
tabela simplificada na qual é possível estabelecer o nível de estringência desejado
variando-se a temperatura e a composição dos banhos pós-hibridização.
DETECÇÃO DOS SÍTIOS DE HIBRIDIZAÇÃO
Na marcação indireta, após a hibridização, a sonda precisa ser detectada, o que é
feito por meio de moléculas conjugadas, constituídas por uma unidade capaz de
reconhecer e se ligar fortemente à molécula marcadora da sonda e outra que
permite sua visualização ao microscópio (sinalização).
A unidade que reconhece a marcação da sonda é geralmente um anticorpo
ou outra molécula com alta capacidade de associação com a molécula marcadora.
Se a sonda for marcada com biotina, poderá ser localizada com um anticorpo
antibiotina ou com avidina ou estreptavidina. Se for marcada com digoxigenina usa-
se antidigoxigenina.
A avidina é uma glicoproteína extraída do ovo de galinha (como a biotina),
com uma constante de associação pela biotina 1.000.000 vezes mais alta que a
afinidade típica de antígenos-anticorpos. A avidina pode ser substituída pela
estreptavidina, uma glicoproteína secretada pelo fungo Streptomyces avidini
composta por quatro subunidades, cada uma com um sítio de ligação com uma
biotina. A estreptavidina tem a vantagem de ser mais específica que a avidina,
embora apresente menor estabilidade e constante de associação mais baixa.
O anticorpo, ou a avidina/estreptavidina, precisa estar previamente ligado a uma
molécula sinalizadora, que é a unidade do conjugado que permite sua visualização ao
microscópio. A molécula sinalizadora pode ser uma enzima ou um fluorocromo. A
Tabela 1.2 apresenta um resumo das moléculas mais freqüentemente acrescentadas
à sonda no processo de HIS não-isotópica. A hibridização in situ utilizando
fluorocromos é comumente denominada FISH (Fluorescent In Situ Hybridization).
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 21
Tabela 1.2 Principais moléculas adicionadas às sondas no processo de HIS.
Marcadoras Reconhecedoras Sinalizadoras 
Biotina ou 
digoxigenina 
Antibiotina, avidina, 
estreptavidina ou 
antidigoxigenina 
Enzimas (ex.: fosfatase alcalina) ou fluorocromos 
(ex.: rodamina, FITC) 
ENZIMAS UTILIZADAS NA DETECÇÃO DOS SÍTIOS DE HIS
As enzimas mais comumentes utilizadas nesse processo são a fosfatase alcalina e uma
peroxidase obtida da planta Armoracia rusticana (em inglês, horseradish). Essas
enzimas são geralmente biotiniladas, permitindo que se liguem à sonda por uma
ponte biotina-avidina-biotina. Na presença de um substrato adequado, a enzima
quebra esse substrato produzindo uma substância que pode ser corada, resultando
em um sinal de cor escura junto à sonda. No caso da fosfatase alcalina, o substrato
é o BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) e o produto da reação é corado pelo
NBT (nitroblue tetrazolium), enquanto com a peroxidase o substrato é o peróxido
de hidrogênio e a coloração do produto enzimático é feita pelo DAB (diamino-
benzidine tetrahydrochloride). A Figura 1.7 esquematiza o processo de reconhe-
cimento da sonda pela fosfatase alcalina e sua reação de coloração. A reação
apresentada nessa figura pode ser simplificada utilizando-se antibiotina ou avidina
já acoplada à fosfatase alcalina. Em ambos os casos, após a coloração da sonda, o
restante dos cromossomos é corado fracamente com algum outro corante, como
o Giemsa ou a orceína acética.
Figura 1.7 Visualização da sonda marcada com fosfatase alcalina biotinilada. A avidina
reage com a biotina da sonda e, posteriormente, com a biotina da fosfatase. A enzima quebra
o substrato, a molécula de BCIP, que reage com o NBT produzindo uma substância escura
onde se encontra a sonda.
22 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
FLUOROCROMOS UTILIZADOS NA DETECÇÃO
Os corantes fluorescentes, quando excitados com radiação ultravioleta de
comprimentos de onda específicos, emitem forte brilho de cor característica. A
análise dessa coloração é feita ao microscópio de fluorescência, equipado com
lâmpada ultravioleta e um conjunto de filtros que permitem selecionar o compri-
mento de onda de máxima excitação do corante e de máxima emissão de luz. O
fluorocromo excitado pela energia da luz ultravioleta desloca alguns elétrons para
orbitais mais externos. Esses elétrons ficam instáveis e logo retornam a seus orbitais
originais, liberando energia na forma de luz na faixa do visível, portanto, com um
comprimento de onda distinto da utilizada em sua excitação (Tabela 1.3). A Figura
1.8 apresenta um esquema do curso seguido pela luz que sai da fonte de ultravioleta
até o cromossomo e da luz emitida pelo cromossomo até o observador.
Tabela 1.3 Principais fluorocromos utilizados na HIS, com seus comprimentos de onda de
máxima excitação e máxima emissão e a cor da fluorescência emitida (baseada em
Schwarzacher e Heslop-Harrison, 2000).
Fluorocromos Máxima excitação (nm) 
Máxima 
emissão (nm) 
Cor da 
fluorescência 
Ligados à sonda FITC 495 523 verde 
 Cy3 550 570 vermelho 
 Rodamina 560 580 vermelho 
 Vermelho-Texas 595 610 vermelho 
Ligados ao DNA 
cromossômico DAPI 358 461 azul 
 Iodeto de propídeo 535 617 vermelho 
Os fluorocromos mais utilizados na coloração da sonda são o Cy3, o FITC
(fluorescein isothiocyanate), o vermelho-Texas e a rodamina. O Cy3 é o mais utilizado
de um grupo de fluorocromos denominado de cianinas, que inclui também o Cy2,
Cy3.5, Cy5, Cy7 e alguns outros. Para corar o DNA cromossômico total, usa-se
mais comumente o DAPI ou o iodeto de propídeo. Uma combinação de fluro-
cromos muito usada é o FITC para sonda e o iodeto de propídeo para o restante
do cromossomo, ou o DAPI para o cromossomo e o FITC e a rodamina para duas
sondas diferentes. As características principais desses fluorocromos estão resumidas
na Tabela 1.3. O DAPI e o iodeto de propídeo apresentam a vantagem de serem
mais estáveis, enquanto os fluorocromos usados nas sondas têm maior instabilidade,
isto é, quando expostos à luz por um tempo mais longo perdem o brilho, podendo
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 23
desaparecer completamente em pouco tempo. Esse problema pode ser minimizado
montando-se a lâmina em meios que reduzem o esmaecimento dos fluorocromos,
como o Vectashield.
Figura 1.8 Trajetória da luz na microscopia de fluorescência. A luz ultravioleta é projetada
para fora da caixa protetora por um espelho. O filtro de excitação seleciona um
comprimento de onda que excita apenas determinado fluorocromo.A luz selecionada
(verde) atinge o cromossomo e o fluorocromo excitado emite outra fluorescência (vermelho-
escuro). Um filtro de emissão deixa passar luz na faixa do visível (vermelho-claro) para o
observador.
AMPLIFICAÇÃO DO SINAL
Quando o sinal emitido pela sonda for muito fraco, não permitindo observação ou
documentação fotográfica segura, torna-se necessário amplificar o sinal, aumen-
tando o número de moléculas marcadoras e sinalizadoras. A amplificação , nesse
caso, é feita adicionando um anticorpo contra a molécula marcadora, contendo esse
anticorpo outras moléculas marcadoras. Por exemplo, se a sonda for marcada com
biotina e reconhecida com avidina usa-se um anticorpo antiavidina biotinilado. Esse
anticorpo possui quatro radicais de biotina, podendo ligar-se à avidina por um
desses radicais e deixar os outros três livres para reagirem com novas moléculas de
avidina (Figura 1.9). Expondo-se novamente a célula à avidina-FITC, duas ou três
dessas moléculas conjugadas se ligarão às biotinas do anticorpo, amplificando
portanto o sinal.
24 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Figura 1.9 Amplificação do sinal da sonda marcada com biotina. A biotina é inicialmente
reconhecida pelo conjugado avidina-fluorocromo. Acrescentando um anticorpo anti-
avidina biotinilado, cada sítio com uma biotina fica agora com três biotinas livres. A reação
com o conjugado avidina-fluorocromo é repetida, resultando na amplificação do sinal.
Teoricamente, o sinal pode ser amplificado repetidas vezes. Na prática, no
entanto, usa-se apenas uma ou, raramente, duas amplificações em razão da
tendência ao aumento da marcação de fundo durante as sucessivas recolorações.
SENSIBILIDADE E RESOLUÇÃO DA FISH
A ampliação do sinal pode ajudar a localizar uma marca muito pequena, mas,
mesmo assim, a sensibilidade da técnica é limitada pelo tamanho do DNA-alvo. A
sensibilidade pode ser aumentada se o acesso ao DNA-alvo for melhorado.
Cromossomos livres de resíduos citoplasmáticos facilitam muito a detecção de sinais
pequenos. Em vertebrados e humanos, a técnica de preparação de lâminas permite
eliminar mais o citoplasma que a utilizada geralmente em vegetais, resultando em
melhor detecção de sinais.
Uma alternativa para localizar seqüências únicas e curtas é utilizar como
sonda não apenas a seqüência do DNA-alvo mas também as seqüências vizinhas
a ele. Por exemplo, se vários genes ou marcadores moleculares aparecem no mapa
genético localizados muito próximos uns dos outros, uma sonda formada pelo
conjunto dessas seqüências poderá ser suficiente para emitir um sinal de fácil
detecção no cromossomo metafásico. Pedrosa et al. (2003) utilizaram um conjunto
de RFLPs, situados muito proximamente no mapa genético de cromossomos de
feijão, para visualizar em qual cromossomo aqueles marcadores se localizavam.
Outra alternativa é procurar primeiramente localizar a seqüência de DNA
desejada em uma biblioteca genômica de BACs ou YACs (cromossomos artificiais
bacterianos ou de leveduras, utilizados para clonagem de seqüências de DNA com
centenas de kb em extensão) e utilizar o fragmento inteiro para hibridização. Essa
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 25
técnica é muito empregada para localizar genes e outras seqüências curtas de DNA
no cromossomo (veja, por exemplo, Pedrosa et al., 2002).
A detecção do sinal pode também ser melhorada trabalhando-se com
cromossomos mais descondensados, como os paquitênicos da meiose, os politênicos
ou os cromossomos interfásicos. Um sítio bem pequeno, com 10 kb, aparecerá no
cromossomo metafásico como um pequeno ponto, enquanto em cromossomos
paquitênicos aparecerá como uma região mais longa e mais facilmente visível.
Em cromossomos mais distendidos, não apenas a sensibilidade mas também
a resolução da HIS aumenta, ou seja, melhora a capacidade de visualizar duas
sondas muito próximas como sinais distintos, sem superposição. Em humanos, duas
sondas precisam estar separadas por pelo menos um milhão de pares de bases (1
Mb) para serem visualizadas como sítios distintos em cromossomos metafásicos,
enquanto em cromossomos paquitênicos essa distância pode ser reduzida para perto
de 60 kb. Em fibras de DNA completamente distendidas a resolução da HIS é ainda
maior, passando para cerca de 0,7 kb (De Jong et al., 1999).
MARCAÇÃO E DETECÇÃO SIMULTÂNEA DE DUAS OU MAIS SONDAS
Nos trabalhos de mapeamento físico de genes ou seqüências de DNA, geralmente
é necessário trabalhar simultaneamente com duas ou mais sondas. No caso de duas
sondas é simples, porque uma das sondas pode ser corada em verde (FITC), a outra,
em vermelho (rodamina ou outro) e o restante do cromossomo, em azul (DAPI).
Quando é necessário hibridizar muitas sondas diferentes simultaneamente,
como no caso da pintura simultânea dos 23 pares cromossômicos humanos, a
solução é utilizar para cada sonda duas ou mais moléculas marcadoras distintas. Isso
pode ser feito marcando algumas sonda com fluorocromos diferentes e outras com
uma combinação de dois ou mais fluorocromos em proporções iguais. No microscópio
de fluorescência, utilizando diferentes filtros, cada cromossomo será identificado
por uma cor ou uma combinação de cores distintas. Eils et al. (1998), por exemplo,
marcaram os 23 tipos de sondas com diferentes combinações de biotina, digoxige-
nina e outros nucleotídeos ligados diretamente a fluorocromos. As imagens obtidas
com diferentes filtros foram superpostas para identificar todos os cromossomos. As
cores resultantes da superposição não são muito distintas, mas o programa de
análise de imagens reconhece bem cada combinação e substitui essas cores por
cores mais contrastadas, denominadas pseudocores (para uma explicação detalhada
dessa abordagem veja Eils et al., 1998). Essa técnica foi denominada de FISH
Multicor ou M-FISH.
26 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
Uma estratégia alternativa para ‘pintar’ todos os cromossomos humanos
simultaneamente foi desenvolvida por Schröck et al. (1996). Esses autores
marcaram cada sonda com diferentes proporções de moléculas marcadoras. A Figura
1.10 ilustra essa alternativa mostrando quatro sondas marcadas com diferentes
proporções de biotina e digoxigenina. As moléculas marcadoras foram reconhecidas
pela avidina conjugada à rodamina e pela antidigoxigenina com FITC, resultando
em sinais com diferentes proporções de vermelho e verde, o que poderá ser
transformado em pseudocores diferentes. O número de marcações diferentes pode
ser aumentado utilizando mais moléculas marcadoras diferentes e também
nucleotídeos marcados diretamente com outros fluorocromos. Embora vários
flurocromos sejam vermelhos, o sistema de análise de imagem é capaz de distingui-
los pela diferença no comprimento de onda.
Figura 1.10 Marcação e detecção simultânea de quatro sondas. (a) Sondas distintas,
marcadas com diferentes proporções de biotina e digoxigenina foram hibridizadas em um
mesmo cromossomo. (b) A biotina é reconhecida por um conjugado (avidina + FITC) e
a digoxigenina, por outro (antidigoxigenina + rodamina), nas mesmas proporções da
marcação, resultando em sinal diferente para cada sonda.
Uma alternativa mais simples para localizar várias sondas em uma mesma
célula é fotografar as células com duas sondas e, em seguida, descorar a lâmina e
utilizar as mesmas células para outra HIS com outras sondas. Cheng et al. (2001),
por exemplo, mapearam dez seqüências diferentes de DNA em um braço cro-
mossômico de arroz, utilizando cinco re-hibridizações seguidas, cada uma com duas
sondas, sempre detectadas com FITC e rodamina. Müller et al. (2002) realizaram
quatro re-hibridizações em células humanas, utilizando em cada re-hibridização um
conjunto complexo de sondas cromossômicas, como as sondas para pinturas
cromossômicas múltiplas ou para Zoo-FISH.
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 27
VARIAÇÕES TÉCNICAS DA FISHEntre as variações técnicas da FISH, a mais importante foi denominada de PRINS
(PRimed IN Situ labeling – Koch et al., 1989). A principal diferença é que na PRINS
a sonda é hibridizada in situ antes de ser marcada (veja descrição detalhada do
procedimento em Gosden e Lawson, 1994). A sonda hibridizada funciona como
um iniciador de síntese que tem seu terminal 3' expandido pela ação de uma DNA-
polimerase Taq em presença de nucleotídeos marcados. O resultado é que a sonda
adquire expansão marcada que denuncia sua localização no cromossomo. Uma das
vantagens dessa técnica é que a intensidade do sinal não depende do tamanho da
sonda e, sim, do tamanho da expansão produzida pela polimerase. Isso torna a
técnica especialmente útil para hibridizações com oligonucleotídeos ou outras
sondas pequenas de DNA de cópia única. Além disso, a PRINS apresenta a
vantagem de ser um procedimento mais simples e rápido.
A técnica de PRINS deu origem a outra variante denominada C-PRINS
(cycling-PRINS), que consiste na amplificação, por PCR, do DNA-alvo in situ. Nesse
caso, utilizam-se dois iniciadores flanqueando o DNA-alvo, como numa reação de
PCR (e não apenas um, como na PRINS). Todos os reagentes necessários para a
reação de PCR, incluindo os iniciadores, os nucleotídeos marcados e os não-marcados
e a Taq-polimerase, são aplicados na lâmina e cobertos com uma lamínula. A
preparação é lutada e introduzida num termociclador que aceita lâminas em vez de
tubos de Eppendorf. Os iniciadores amplificam o DNA-alvo e os nucleotídeos
marcados permitem a visualização do sítio. Essa técnica tem a vantagem de ser mais
rápida e, aparentemente, apresentar maior sensibilidade e poder de resolução, embora
ainda seja relativamente pouco utilizada (Kubaláková et al., 2001).
Outras variantes técnicas têm sido desenvolvidas para visualizar a intercalação
de seqüências repetitivas muito próximas, ou a distância entre duas sondas no fio
de DNA. Nesses casos, a visão do cromossomo como uma macroestrutura dá lugar
à análise de segmentos de DNA, com um nível de resolução várias vezes maior que
o que poderia ser obtido na análise cromossômica. Uma dessas técnicas mais
utilizadas é a de fibras estendidas, em que núcleos interfásicos inteiros e sem
citoplasma, não-fixados, são espalhados em um dos lados de uma lâmina e, em
seguida, são lisados, deixando a cromatina parcialmente livre. Mantendo-se a
lâmina inclinada, com os núcleos na parte mais alta, adicionam-se algumas gotas
de tampão na parte de cima da lâmina, criando-se uma suave corrente que
impulsiona as fibras da cromatina para fora, deixando-as estendidas (Figura 1.11).
A lâmina é então fixada e utilizada para FISH (Fransz et al. 1998). Gläser et al.
(1997), por exemplo, utilizaram fibras estendidas de cromatina de núcleos
interfásicos humanos para visualizar a distribuição intercalada de três seqüências
28 FISH – Conceitos e Aplicações na Citogenética
repetitivas e dois genes na região diferencial do cromossomo Y. O limite máximo
de resolução nessas fibras é próximo a 1 kb (De Jong et al., 1999).
Figura 1.11 FISH em fibras estendidas. Núcleos interfásicos sem citoplasma (a) são lisados
(b) e as fibras de DNA são impulsionadas para fora do núcleo por uma corrente líquida (c).
Em seguida, é feita a fixação e o DNA-alvo é localizado por FISH nas fibras estendidas (d).
Michalet et al. (1997) desenvolveram outra técnica para obter fios de DNA
estendidos em uma lâmina, denominada DNA combing, referindo-se ao fato de que
as fibras de DNA aparecem alinhadas ou penteadas (do inglês, to comb = pentear).
Nesse caso, uma lamínula siliconizada é mergulhada em uma solução contendo
moléculas de DNA. Essas moléculas tendem a aderir por uma das extremidades
(eventualmente pelas duas) na superfície siliconizada. A lamínula é então retirada
lentamente da solução. Ao atravessar o menisco, as moléculas são tensionadas no
sentido contrário ao da retirada da lamínula, o que as torna ao mesmo tempo
estiradas e aderidas à superfície da lamínula (Figura 1.12). A lamínula pode ser
utilizada para FISH, com uma resolução semelhante à das fibras estendidas, que é
provavelmente o limite inferior que pode ser obtido com FISH.
Diversas outras variações da técnica de HIS procuram, por um lado, aprimorar
os métodos de marcação e detecção da sonda e, por outro, ampliar o nível de
resolução de sondas contíguas. Nesse ponto, as técnicas citomoleculares
confundem-se com as estritamente moleculares, formando um elo importante entre
a análise citogenética e a análise genômica. O seqüenciamento dos genomas
eucariotas revelou o padrão de organização de várias seqüências do DNA
cromossômico. A citogenética atual tem procurado entender o significado dessas
seqüências em vários organismos, verificando sua distribuição espacial em
diferentes tipos de núcleos (interfásicos, politênicos, meióticos) e em situações
especiais, como nos núcleos de híbridos artificiais e de patologias celulares.
CAPÍTULO 1 – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU : PRINCÍPIOS BÁSICOS 29
Figura 1.12 Fibras de DNA alinhadas por DNA combing. Uma lâmina siliconizada é
mergulhada em uma solução contendo moléculas de DNA (a). Algumas moléculas de DNA
aderem à lâmina e quando esta é retirada da solução as moléculas de DNA são estendidas
pela tensão superficial do menisco, aparecendo alinhadas (b).
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