Aula Coprocultura (1ª prova)

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COPROCULTURA
Profª Kêsia Xisto
O que é uma coprocultura?
Por que solicitar uma coprocultura?
 AS CULTURAS DE FEZES SERVEM PARA DIAGNOSTICAR GASTROENTERITES INESPECÍFICAS E OUTRAS INFECÇÕES DO TRATO INTESTINAL.
	 Nesta região 
 as bactérias causam doenças 
pela invasão de tecido e / ou produção de toxinas (entero e citotoxinas) 
 o isolamento e identificação de bactérias comprovadamente patogênicas
Características comuns das Enterobactérias
Bacilos Gram negativos
Não esporulados
Catalase positivos
Oxidase negativos (importante na sua detecção)
Fermentam a glicose
Reduzem os nitratos a nitrito
Podem:
Ser móveis ou imóveis (a maioria são móveis com exceção de Klebsiella, Shigella e Yersinia; as móveis são por flagelos peritríquios.
Ser maioria anaeróbios facultativos.
Algumas estirpes podem fermentar a lactose (p.ex. E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter e Serratia).
Os agentes comensais são inibidos pelos sais biliares, ao passo que os patogénicos oferecem resistência aos mesmos.
Ter cápsula (Escherichia, a maioria das Klebsiella, e algumas Enterobacter.
Diarréia
 Emissão exagerada freqüente de fezes líquidas ou pastosas, devido a uma deficiência na reabsorção de água pelo intestino, de natureza aguda ou crônica.
Disenteria
	Caracterizada por diarréia freqüente sanguinolenta acompanhada por dores abdominais e febre.
	COLETA
1	A amostra deve ser obtida no inicio da fase aguda da doença.
2	O recipiente deve ser estéril e as amostras devem ser levadas ao laboratório o mais rápido possível.
Caso não seja possível (demorar mais que 2 horas) a amostra deve ser refrigerada a 4 – 8°C ou colocada em meio de transporte (Stuart ou Cary-Blair).
	
Amostra 
Enriquecimento 
(tetrationato) 6 a 12horas
Isolamento 
(EMB, HE ou SS) 18 a 24 horas
Isolamento
(HE OU SS) 18 a 24 horas
Identificação
Série bioquímica
(TSI, uréia, citrato, fenilalanina, H2S, indol, motilidade, lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase)
Antibiograma 
Patógeno 
Sorologia Salmonella
 Shigella
 Escherichia coli
Protocolo
1. Inocular uma pequena porção de fezes com uma alça de platina,previamente flambada, no bico de Busen em um tubo contendo o caldo tetrationato;
2. Agitar e adicionar 3 ou 4 gotas de iodo e homogeneizar (o iodo inibe o crescimento da microbiota normal, favorecendo as bactérias patógenas);
Pegar outra porção de fezes com a alça de platina (previamente flambada) e semear em estrias os meios de agar E M B e agar SS ou HE;
4. Incubar na estufa por 6 a 12 horas a 37°C os tubo e 18 a 24 horas as placas;
5. Se houver crescimento de colônias bacterianas suspeitas, isolá-las com agulha de platina e semear no meio TSI (prova bioquímica) e colocar na estufa por 24 horas;
6. Fazer um reisolamento a partir do caldo tetrationato com o material fecal no meio agar SS ou HE;
7. Incubar a 37°C por 24 horas;
8. Depois do crescimento bacteriano nos meios TSI e SS ou HE, prosseguir o estudo das mesmas através de outras provas bioquímicas e sorológicas.
Os procedimentos de rotina diagnóstica são dirigidos para os seguintes componentes da família Enterobacteriacea
Salmonella
Shigella
Escherichia coli
Yersinia enterocolitica
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae
Salmonella
 Febres
 Tifóides Paratifóides
Outras febres entéricas e lesões fora do aparelho digestivo
 
 invasividade
Fator de virulência
Manipulação de alimentos por pessoas contaminadas 
Inóculo 10 6 – 8 células
Intoxicação alimentar
6 a 48 horas
Ingestão de alimentos ou água contaminados
Diarréia, náuseas, vômitos, e dores abdominais
A gravidade depende da resistência do paciente e da virulência da cepa
 Espécies melhor adaptada ao homem:
 Salmonella typhi e S. paratyphi
O seu aparecimento no homem é sempre patogênico
 Espécie própria do animal – quando infectam o homem pode causar doença severa
 S. choleraesuis
Shigella
Disenteria bacilar
S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei
Os mais efetivos entre as enterobactérias
Ingestão de 100-200 células - doença
Doença estritamente humana 
transmissão oral-fecal
Escherichia coli
 Enterites Crianças 
 epidemias em berçários
A MAIORIA DAS INFECÇÕES SÃO ENDOGENAS, COM CONTAMINAÇÃO A PARTIR DO INTESTINO ONDE OCORREM COMO MICROBIOTA NORMAL
E. coli causadoras de gastroenterites 
E.Coli enterotoxigênica (ETEC) DIARRÉIA DA CRIANÇA DESMAMADA
 DIARRÉIA DO VIAJANTE
 DIARREIA AQUOSA ( semelhante a causada pelo Vibrio cholerae)
E.Coli enteropatogenica (EPEC ) DIARRÉIA EM CRIANÇA 
 DIARRÉIA AQUOSA com muco e sem sangue
E.Coli enteroinvasiva (EIEC)
 DIARRÉIA AQUOSA com muco e sangue
E. coli causadoras de gastroenterites 
E. coli enterohemorragica (EHEC)
 DIARRÉIA SANGUINOLENTA
E. coli enteroagregativa (EAEC)  Principalmente em crianças
 DIARRÉIA AQUOSA E MUCOIDE
E. coli Difusamente Aderente (DAEC)
 DIARRÉIA AQUOSA SEM SANGUE 
Observação:
A E. coli enterohemorrágica (EHEC) pode evoluir para a Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU) e colite hemorrágica.
Identificação pela detecção do sorotipo 0157:H7.
A Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU) é uma doença grave, observada mais frequentemente em crianças de pouca idade, que se caracteriza por anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiência renal aguda. 
Yersinia enterocolitica
Diarréia e/ou vomito, febre e fortes dores abdominais 
24 a 48 horas
Alimentos contaminados
Relacionada a gastroenterite aguda, podendo causar uma forma crave que simula a apendicite
Encontradas em carnes (de porco, carneiro, de boi etc.), ostras, peixes e leite cru.
Yersinia enterocolitica
Cocobacilos Gram-negativos, imóvel a 37°C, facultativo.
Meio de cultura: Agar cefsulodina-irgasan-novobiocina (CIN).
Temperatura de incubação 22-29°C.
Colônias chatas com centro vermelho.
Nos meios SS e MacConkey as colônias são pequenas, pálidas ou incolores, devendo ser incubado por mais 24 horas.
Enriquecimento alcalino – KOH A 0,25% em solução salina
TSI ácido/ácido por fermentação de sacarose.
Campylobacter jejuni
Reconhecido após 1972
Diarréia dores abdominais Febre
2 a 5 dias
Alimentos contaminados ou água contaminados
 Ocasionalmente podem invadir a corrente sanguínea e causar endocardites, artrite sépticas ou meningites
400-500 bacterias podem causar doenças
Pesquisa de Campylobacter
Material: Fezes ou swab retal
Bastonetes Gram-negativos, curvo, móvel, microaerófilo.
Meio de cultura: base rica adicionado de 10% de sangue de carneiro, suplementado com anfotericina B, cefalotina, polimixina B, trimetoprim. Incubação a 42°C em atmosfera de 5-15% de O2 e 5-12% de CO2.
Colônias pequenas, não hemolíticas e mucóides, geralmente acinzentadas, com bordas irregulares.
Vibrio cholerae
Vibrionaceae
Características Gerais: 
Bastonetes Gram-negativos curvos com aparência de vírgula, altamente imóveis, anaeróbios facultativos. Possuem um único flagelo polar.
Dos vibriões que são clinicamente significantes para o homem, o Vibrio cholereae é o mais importante. 
Cólera
Período de incubação de 6 a 48h;
Início abrupto de diarréia aquosa (*diarréia em forma de água de arroz);
Quantidade de fezes pode exceder 1 litro;
Vômitos;
Grande perda de líquidos e eletrólitos podendo levar a um choque de hipovolemia;
Câimbrãs musculares;
Perda do turgor na pele, principalmente do abdome é um sinal característico;
Doença se estende por 2 a 7dias e a recuperação depende da quantidade de líquidos perdida e a rapidez da reposição destes;
A morte pode ocorrer devido aos choques hipovolêmicos, acidez metabólica e uremia resultante da necrose tubular aguda.
Meio TCBS 
(Tiosulfato-Citrato-Sais Biliares-Sacarose)
Seletivo e diferencial
Colônias amarelas, meio amarelo por produção de sacarose
Inibidores-sais biliares: citrato de sódio
Inibidores-azul de bromotimol: azul de timol
Outros testes de Identificação
CATALASE POSITIVO
INDOL POSITIVO
LISINA E ORNITINA DESCARBOXILASE POSITIVO
Meios de Cultura
Meios de Cultura
Ágar SS
HE
EMB
Meios de Enriquecimento
Tetrationato
Meios de Identificação
TSI
Ureia
Citrato
SIM
Indol
Fenilalanina
Lisina
Meio de Isolamento
Ágar SS
Carboidrato: lactose
Indicador para ácido: Vermelho neutro
Tiossulfato de sódio: fonte de enxofre
Indicador de H2S: Citrato férrico 
Elevada concentração de Sais biliares e Citrato de Sódio (8,5g): inibidores de todas as bactérias Gram-positivas e muitas Gram-negativas.
Meio de Isolamento
Ágar entérico de Hektoen (HE)
Carboidratos: lactose e sacarose
Indicadores para ácido: fucsina ácida e azul de bromotimol
Fonte de enxofre: tiossulfato de sódio
Indicador de H2S: Citrato férrico
Elevada concentração de sais biliares (9g): inibem todas as bactérias Gram-positivas e muitas Gram-negativas.
Meio de Isolamento
Ágar EMB
Açúcares: lactose
Indicadores e inibidores: eosina e Azul de metileno
Inibem bactérias Gram-positivas.
Meio de Enriquecimento
Tetrationato
Meio recomendado para o enriquecimento seletivo do gênero Salmonella. 
O tetrationato se forma a partir da reação do tiossulfato de sódio com o iodo. O tetrationato reprime o crescimento de coliformes e bactérias da microbiota normal. Salmonella e Proteus reduzem o tetrationato se multiplicando sem dificuldade.
Contém sais de bile que inibem os microorganismos Gram-positivos e a adição de solução de iodo (antes da amostra) inibe a microbiota intestinal normal
Meio de Identificação
Meio TSI
Detecta bactérias fermentadoras de carboidratos e produtoras de H2S.
Carboidratos: glicose, sacarose e lactose (distribuídos uniformemente, tanto no fundo quanto na superfície do meio).
Indicadores para ácido: vermelho de fenol.
Não-Fermentador de Lactose
No início, ocorre uma acidificação, tanto na superfície como no fundo do tubo. Em seguida o suplemento de glicose se esgota e a bactéria começa a efetuar a degradação oxidativa dos AA na superfície inclinada do tubo, resultando na liberação de aminas ficando a parte inclinada vermelha, no entanto, o fundo do tubo permanece amarelo, pois a degradação de AA não é suficiente para neutralizar o ácido formado.
Fermentador de Lactose
No início, ocorre uma acidificação, tanto na superfície quanto no fundo do tubo e mesmo com o esgotamento da glicose, a fermentação prossegue, porque a lactose vai ser utilizada, ficando tanto na superfície como o fundo do tubo, amarelos.
Meio de Identificação
UREIA
 Uréia + H20 Urease Amônia + C02
Carbonato de amônia
(alcalinização e aumento do pH do meio)
Indicador: vermelho de fenol
Ureia positiva: vermelho
Ureia negativa: amarelo (cor original do meio)
Meio de Identificação
CITRATO
	Baseia-se na capacidade de utilização do citrato como única fonte de carbono para metabolismo e crescimento. Na utilização do citrato ocorre alcalinização do meio.
Indicador: Azul de bromotimol
Citrato positivo: cor azul escuro
Citrato negativo: verde (cor original do meio).
*Esta capacidade depende da presença de CITRATO PERMEASE, que facilita o transporte do citrato para o microorganismo. Uma vez dentro da célula, o citrato é degradado pela enzima CITRASE, produzindo ÁCIDO OXALACÉTICO e ACETATO.
Meio de Identificação
SIM (Sulfeto, Indol e Motilidade)
É um meio recomendado para a determinação da produção de H2S, formação de indol e motilidade
A baixa concentração do ágar permite a dispersão dos microorganismos pelo meio (motilidade)
O indol é um dos produtos da degradação metabólica do TRIPTOFANO.
H2S + FERRO Sulfito Ferroso (ppt)
Triptofano Triptofanase INDOL + ÁCIDO PIRÚVICO + AMÔNIA
Indol + P-N-N-dimetilamino-belzaldeído Composto quinoidal (vermelho) + H20
Condensação ácida
INDOL
	Produto de degradação metabólica do aminoácido triptofano.
TRIPTOFANO
Hidrolisam 
Desaminam 
Indol 
Ácido pirúvico
Amônia 
Indol + Reativo de Kovac (para-dimetilamino-benzaldeído) = complexo vermelho
Indol positivo: vermelho
Indol negativo: não há reação
Triptofanase
OBSERVAÇÃO: O indol é importante para separar Escherichia coli (sempre positivo) de membros do grupo Klebsiella - Enterobacter – Hafnia – Serratia (a maioria negativo).
FENILALALINA
Fenilalanina ácido fenilpiruvico + amônia
	O ácido fenilpiruvico é detectado com uma solução de cloreto férrico a 10%.
- 	Positivo: mudança da coloração esbranquiçada do meio para cor verde escuro.
Negativo: sem alteração da cor esbranquiçada do meio.
A determinação da enzima FENILALALINA DESAMINASE é útil para a diferenciação de espécies Proteus, Morganella, e Providencia de outros bacilos Gram-negativos.
Fenilalalina
Desaminase
Meio de Identificação
LISINA
Muitas bactérias possuem enzimas capazes de descarboxilar AA específicos no meio de cultura.
A enzima DESCARBOXILASE remove uma molécula de CO2 de um AA para formar aminas de reação alcalina.
Lisina Cadaverina + CO2↑ 
Bromocresol purpura (amarelo, pH <5,2)
Bromocresol purpura (purpura , pH >5,2)
Lisina  Cadaverina
Ornitina  Putrescina
Arginina  Citrulina
Meio de Identificação
Lisina Descarboxilase
Microrganismo
EMB
SS
HE
Escherichia coli
Verde-negra com brilho metálico
Rosa a vermelho
Alaranjado a salmão
Klebsiella
Centro marrom ou acinzentado, usualmente sem brilho metálico
Maior que aE. coli, mucóides, opacas, de creme a rosa
Alaranjado a salmão
Salmonella
Incolor
Incolor com centro negro
Azul esverdeado com centro negro
Shigella
Incolor
Incolor
Esverdeado
Proteus
Incolor
Incolor com centro negro
Na maioria inibidas. Colônias esverdeada com centro negro
Identificação bioquímica
TSI
Indol
Mot
Uréia
Citrat
Glic
(gás)
H2S
Fenil
Lis
Orn
E. coli
Ac/ac
+
+/-
-
-
+
-
-
+
+/-
Klebsiella
Ac/ac
- (p)/+(o)
-
+
+
+
-
-
+
-
Salmonella
Al/ac
-
+
-
+/-
+
+
-
+
+
Shigella
Al/ac
-/+
-
-
-
-
-
-
-
-
Proteus
Ac/ac (v)
Al/ac
+(v)/-(m)
+
+
v
v/+
+
+
-
-/+(m)