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ED Bioquímica

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Agnes Candido Teixeira – Nanotecnologia – Xerém
Durante as etapas de purificação de proteína, grande parte daquele tecido será eliminado até termos a proteína em si isolada do extrato celular bruto. Sendo assim, utilizamos uma grande quantidade de tecido para ter uma quantidade razoável da proteína que se deseja purificar. 
A refrigeração preserva o alimento inibindo total ou parcialmente as atividades metabólicas e reações enzimáticas, impedindo a degradação do tecido.
Quando homogeneizamos o tecido, quebramos suas membranas celulares para liberar conteúdos como proteínas, RNA e DNA. Depois do rompimento, essas macromoléculas liberadas passam a flutuar na solução, podendo ser extraídas.
A centrifugação é um processo de separação de misturas através de sua densidade. A rotação rápida faz com que os materiais mais densos desçam para o fundo do recipiente e os menos densos fiquem na superfície. Tendo uma noção da densidade da proteína alvo, seria possível determinar o espaço em que ela estaria.
O sulfato de amônio serve para a precipitação da citrato-sintase, já que a proteína tem sua solubilidade afetada pelo sal adicionado.
A diálise serve para reter substancias de peso maior por membranas semipermeáveis enquanto substancias de menor peso tem livre passagem. Sendo assim, o processo serve para separar a proteína alvo de outras pequenas substancias. A solução tampão permitirá essa passagem a troca de concentrações pela membrana semipermeável, mantendo as proteínas alvo de um lado só, pois elas não serão capazes de passar pela membrana graças ao seu tamanho. Ao contrário da solução tampão, a água não facilitaria esse processo além de correr o risco de uma mudança no pH da solução.
A cromatografia de exclusão funciona de acordo com o tamanho das moléculas contidas na solução. Moléculas maiores atravessam mais rapidamente o tubo da cromatografia. Coletar a primeira fração significa que a proteína será maior do que as outras substancias na solução, atravessando o tubo primeiro. 
A absorbância analisada na fração aluída da proteína mostra a capacidade da proteína absorver radiação em uma certa frequência especifica. Sendo assim, a absorbância é capaz de “dizer” a quantidade de proteínas ali presentes.
Quando se faz uma cromatografia trocadora de cátions, significa que minha carga da resina será negativa e a da molécula desejada será positiva. Quando alteramos o pH da solução tampão presente, alteramos também a carga elétrica da proteína de interesse, fazendo com que ela saia do tubo logo em seguida. 
A focalização isoelétrica permite a separação de moléculas através do seu ponto isoelétrico. Se o gel apresenta 3 bandas, significa que a proteína alvo pode ainda não estar isolada da forma desejada.
A eletroforese em gel irá separar as moléculas de acordo com sua diferença de potencial e seu tamanho. O gel me deu a confirmação de que havia apenas a proteína alvo ali, visto que só possuía uma massa molar e um ponto isoelétrico. 
É importante realizar os dois processos por uma questão de segurança, garantindo que a citrato-sintase está isolada de todas as formas.

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