CQM 018 W NORMAS PARA EXECUÇÃO DO TESTE DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (L A L ) atualizado em 30 10 17 Audilene

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PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO (POP)
 PROCEDIMENTO DE OPERAÇÃO PADRÃO (POP)
TÍTULO : 
NORMAS PARA EXECUÇÃO DO TESTE DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (L.A.L.)�PROCEDIMENTO Nº
CQM 018 W�GAR. QUALIDADE – GMP
___________ ___ /___ /___�PÁGINA:
� PAGE �13� DE 18��
	PROCEDIMENTO Nº
CQM 018 W
	SUBSTITUÍ PROCEDIMENTO Nº
CQM 018 V
	EM VIGOR:
___/___/___
	PÁGINA
1 DE 18
	DIGITADO POR
Audilene Santos, 30/10/17.
	CONFERIDO POR:
Valdênia Galvão, 31/10/17.
 
	DATA DA PRÓXIMA REVISÃO:
____ / ____ / ____
	APROVAÇÕES
	ELABORADO POR:
_______________, ___/___/___.
 Audilene Santos / CQM 
	REVISADO POR:
_________________, ___/___/___.
Wesley Dantas / CQM
	APROVADO POR:
__________________, ___/__/___.
Luciene Costa/ GQT
	DEPTO. / SETOR:	 INDUSTRIAL / CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
	Assunto: NORMAS PARA EXECUÇÃO DO TESTE DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (LAL)
OBJETIVO
Este procedimento tem como objetivo estabelecer normas para execução do teste de endotoxinas bacterianas (pirogênio “in vitro”) pelo método gel-clot utilizando o reagente L.A.L (Limulus Amebocyte Lysate) para análises de água, produto em processo (pré-esterilização) e produto acabado das soluções parenterais de grande e pequeno volumes, Concentrados Polieletrolíticos para Hemodiálise (produto acabado), matérias-primas e polietileno.
ALCANCE
Este procedimento aplica-se aos analistas do controle de qualidade microbiológico.
RESPONSABILIDADES
O cumprimento das normas aqui estabelecidas é de responsabilidade dos analistas, supervisão e gerência do controle de qualidade microbiológico.
CONSIDERAÇÕES GERAIS
A pesquisa de endotoxina bacteriana (LAL) é realizada através do método de coagulação em gel (Gel-clot), método semi-quantitativo.
É realizada diariamente para liberação de linhas de produção.
Para análises de água para uso farmacêutico, dos produtos em processo (pré-esterilização) e produto acabado dos setores de SPPV, SPSF e CPHD.
Monitoramento do processo de fabricação de produtos à base de glicose e Ringer com Lactato.
Análises em matérias-primas, polietileno de alta e baixa densidade. 
4.1	Materiais Necessários:
Ácido clorídrico diluído;
Água para Injeção estéril e apirogênica.
Balão volumétrico despirogenizado.
Banho seco regulado a 37°C ± 1°C.
Béquer despirogenizado.
Controle Padrão de Endotoxina (CSE).
Despertador minuteiro.
Espátula despirogenizada.
Estufa de despirogenização.
Fita crepe.
Geladeira.
Hidróxido de sódio diluído
Papel alumínio.
pHmetro.
Pipetador automático.
Pipetador de volume ajustável.
Pipeta repetidora.
Pipeta descartável apirogênica.
Pipeta graduada despirogenizada.
Ponteiras apirogênicas.
Reagente L.A.L (Limulus Amebocyte Lysate), sensibilidade 0,125 EU/mL e 0,03 EU/mL.
Saco plástico estéril.
Tubo de ensaio despirogenizado.
Tubo para L.A.L apirogênico (10 x 75 mm).
Vórtex.
Tampão glucano.
Tampão para pH 4,01, 7,01 e 10,01
KCL 3moL
Racks para tubos de ensaio.
ESPECIFICAÇÕES
As águas para injetáveis e águas de osmose reversa utilizadas no setor de CPHD provenientes dos tratamentos de água da Farmace possuem limite de 0,25 EU/mL, conforme especificados na Farmacopéia Brasileira 5ª Edição e RDC nº 08, 2001, respectivamente.
Para as amostras de soluções parenterais realizadas em processo (pré-esterilização) definiu-se utilizar os mesmos limites de endotoxina determinados para o produto acabado.
As especificações para as amostras de produto acabado das soluções parenterais e produtos para hemodiálises são definidas em compêndios oficiais ou calculados conforme descrito no subitem 6.4.2. e disponíveis na tabela abaixo.
 Tabela 1: Limites de endotoxinas para produto acabado (SPPV, SPSF e CPHD)
	PRODUTOS
	ESPECIFICAÇÃO
NO MÁXIMO
	REFERÊNCIA
	Água para injeção
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Aminofilina 24mg/mL
	1,0 EU/mg
	USP 40, 2017
	Atrofarma 0,25 mg/mL
	55,6 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Bicarbonato de Sódio 8,4%
	5,0 EU/mEq
	USP 40, 2017
	Bicarbonato de Sódio 10%
	5,0 EU/mEq
	USP 40, 2017
	Butilbrometo de Escopolamina + Dipirona monoidratada
	23,4 EU/mL
	CALCULADO
	Butilbrometo de Escopolamina
	555 EU/mg
	USP 40, 2017
	Cloreto de Potássio 10%
	8,80 EU/mEq
	USP 40, 2017
	Cloreto de Potássio 19,1%
	8,80 EU/mEq
	USP 40, 2017
	Cloreto de Sódio 0,9%
	0,5 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Cloreto de Sódio 0,9% + Glicose 5%
	10,0 EU/g
	USP 40, 2017
	Cloreto de Sódio 10%
	3,6 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Cloreto de Sódio 20%
	3,6 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Cloridrato de Ranitidina 25mg/mL
	7,00 EU/mg
	USP 40, 2017
	Diclofarma 25mg/mL
	2,33 EU/mg
	CALCULADO
	Dipifarma 500mg/mL
	35,01 EU/mL
	CALCULADO
	Fosfato Dissódico de Dexametasona 2mg/mL
	31,3 EU/mg
	USP 40, 2017
	Fosfato Dissódico de Dexametasona 4mg/mL
	31,3 EU/mg
	USP 40, 2017
	Fosfato de Potássio 2mEq/mL
	1,1 EU/mg
	USP 40, 2017
	Fração Ácida
	0,5 EU/mL
	RDC N° 08, 2001
	Fração Básica
	0,5 EU/mL
	RDC N° 08, 2001
	Fração Ácida - Cálcio 2,5 mEq/L
	0,5 EU/mL
	RDC N° 08, 2001
	Furosefarma 10mg/mL
	3,6 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Glicose 5%
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Glicose 10%
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Glicose 25%
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Glicose 50%
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Manitol 20%
	2,5 EU/g
	USP 40, 2017
	Metrofarma 5mg/mL
	2,5 EU/mg
	USP 40, 2017
	Nidazofarma 5mg/mL
	0,35 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Ringer Simples
	0,5 EU/mL
	USP 40, 2017
	Ringer Lactato
	0,5 EU/mL
	USP 40, 2017
	Vitamina C 100mg/mL
	1,2 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
As matérias-primas possuem especificações definidas em compêndios oficiais e em caso de não haver referências oficiais, ficam estabelecidos os mesmos limites apresentados para o produto acabado que a matéria-prima faz parte da composição.
Em caso da matéria-prima ser utilizada para mais de um produto acabado, o limite para ela deve ser igual ao produto considerado mais crítico (quantidade utilizada x limite produto acabado EU/mL). Valores apresentados na tabela abaixo.
 Tabela 2: Limites de endotoxinas para matérias primas 
	MATERIAIS
	ESPECIFICAÇÃO
NO MÁXIMO
	REFERÊNCIA
	Água para injeção
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Água de Osmose reversa
	0,25 EU/mL
	RDC nº 8, 2001
	Ácido acético glacial
	0,5 EU/mL
	RDC nº 8, 2001
	Ácido ascórbico
	1,2 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Ácido cítrico anidro
	0,5 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Ácido fênico
	7,00 EU/mg
	USP 40, 2017
	Ácido láctico
	23,4 EU/mL
	CALCULADO
	Álcool benzílico
	2,33 EU/mg
	CALCULADO
	Aminofilina
	1,0 EU/mg
	USP 40, 2017
	Atropina (Sulfato)
	55,6 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Bicarbonato de sódio (Para hemodiálise)
	0,5 EU/mL
	RDC nº 8, 2001
	Bicarbonato de sódio 
	5 EU/mEq
	USP 40, 2017
	Butilbrometo de escopolamina
	23,4 EU/mL
	CALCULADO
	Citrato de sódio
	31,3 EU/mg
	USP 40, 2017
	Cloreto de cálcio
	0,5 EU/mL
	USP 40, 2017
	Cloreto de cálcio a 50% p/v
	0,5 EU/mL
	RDC nº 8, 2001
	Cloreto de magnésio
	0,5 EU/mL
	RDC nº 8, 2001
	Cloreto de potássio
	0,5 EU/mL
	USP 40, 2017
	Cloreto de sódio 
	0,5 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Cloreto de sódio (Para hemodiálise)
	0,5 EU/mL
	RDC nº 8, 2001
	Cloridrato de ranitidina
	7,00 EU/mg
	USP 40, 2017
	Dexametasona Fosfato dissódico
	31,3 EU/mg
	USP 40, 2017
	Glicose (Dextrose)
	0,25 EU/mL
	FB 5ª ed., 2010
	Diclofenaco sódico
	2,33 EU/mg
	CALCULADO
	Dipirona monoidratada
	23,4 EU/mL
	CALCULADO
	EDTA dissódico 
	1,2 EU/mg
	FARMACE
	Fosfato de potássio dibásico
	1,1 EU/mg
	USP 40, 2017
	Fosfato de potássio monobásico
	1,1 EU/mg
	USP 40, 2017
	Fosfato de sódio dibásico
	7,00 EU/mg
	USP 40, 2017
	Fosfato de sódio dibásico heptahidratado
	0,35 EU/mg
	FB 5ª ed.,2010
	Furosemida
	3,6 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Lactato de Sódio 50%
	0,5 EU/mL
	USP 40, 2017
	Manitol
	2,5 EU/g
	USP 40, 2017
	Metoclopramida (Monocloridrato)
	2,5 EU/mg
	USP 40, 2017
	Metronidazol Base
	0,35 EU/mg
	FB 5ª ed., 2010
	Polietileno de Alta densidade
	0,5 EU/mL
	FARMACE
	Polietileno de Baixa densidade
	0,5 EU/mL
	FARMACE
	Propilenogligol
	2,33 EU/mg
	CALCULADO
PROCEDIMENTO
6.1	Preparo das vidrarias:
a) Prepare e despirogenize as vidrarias de acordo com o procedimento CQM 006.
6.2	Preparo do reagente L.A.L:
a) Retire o frasco com o liófilo do reagente L.A.L da geladeira e aguarde até que atinja temperatura ambiente.
b) Remova o lacre de alumínio.
c) Com cuidado e devagar retire a tampa do frasco puxando-a pelo lado da fenda existente na parte interna da tampa de borracha.
d) Com auxílio de pipeta descartável apirogênica e usando o pipetador automático, reconstitua o reagente L.A.L. com 5.2mL de água apirogênica. Dispense suavemente a água pelas paredes internas do frasco para evitar a formação de bolhas e/ou espuma. Feche o frasco.
e) Suavemente realize movimentos giratórios para desprender o liofilizado das paredes e fundo do frasco. Deixe o frasco em repouso até completa solubilização do reagente. O reagente poderá ser utilizado quando este estiver com aparência incolor. 
NOTA: Nunca realize movimentos bruscos com o reagente reconstituído e em caso de queda, o reagente deve ser descartado. Tais movimentos promovem a gelificação do reagente.
f) Abra novamente o frasco e com auxílio de pipetador de volume ajustável e pipeta repetidora apirogência ou ponteira retire todo o conteúdo do frasco e, distribua 100 µL do reagente L.A.L. em tubos de 10 x 75 mm apirogênicos. Feche os tubos com tampa plástica ou papel alumínio.
g) Armazene no congelador (-10 a -25°C) por até 30 dias o reagente que foi dispensado nos tubos. Se não for dispensado em tubos após reconstituição, o reagente só terá validade de até 24 horas se armazenado em geladeira (2 a 8°C).
h) Após descongelamento do reagente e se não for utilizado no mesmo instante, este não poderá ser congelado novamente. Descarte-o.
6.3	Preparo do controle padrão de endotoxina:
a) Use uma endotoxina com potência definida, obtida de E. coli, que tenha sido padronizada frente à RSE (Endotoxina Padrão de Referência), acompanhada de certificado de análise do fabricante. A endotoxina a ser reconstituída deve ser do mesmo lote usado no controle do LAL que está sendo feito, conforme descrito no certificado de análise emitido pelo fabricante.
b) Retire o controle padrão de endotoxina da geladeira e aguarde até que atinja temperatura ambiente.
c) Remova o lacre de alumínio.
d) Retire a tampa do frasco puxando-a do lado da fenda existente na parte interna da tampa de borracha.
e) Com auxílio de pipeta descartável apirogênica e usando o pipetador automático, reconstitua a endotoxina com a quantidade de água apirogênica descrita no certificado de análise emitido pelo fabricante.
f) Agite em vortex por pelo menos 5 minutos. Esta solução reconstituída pode ser conservada em geladeira por até 30 dias para fazer as diluições subseqüentes. Não congele.
g) Verifique, no certificado de análise, qual a potência da endotoxina após reconstituição.
6.3.1	Diluição da endotoxina padrão de uso:
a) Retire o controle de endotoxina padrão reconstituído da geladeira e aguarde até que atinja a temperatura ambiente, agite em vortex por no mínimo 5 minutos.
b) Prepare diluições com água apirogênica a partir do controle de endotoxina padrão reconstituindo até chegar à concentração de 2,5 EU/mL. Agitar cada diluição preparada por 1 minuto no vórtex.
c) Esta solução diluída pode ser conservada em geladeira por até 7 dias. Ela é usada no controle positivo dos produtos em análise.
6.4	Preparo das amostras para teste:
6.4.1	Água para injeção e de osmose reversa/ água purificada:
a) São realizados testes de endotoxinas bacterianas nas águas para injetáveis (API) que abastecem os setores de produção de soluções parenterais e água de osmose reversa/ água purificada (AP) que abastece o setor de CPHD. Além disso, é realizada análise da água de enxágüe após sanitização dos reatores e máquinas de envase destes setores produtivos antes da produção do primeiro lote. 
b) A amostragem é feita em sacos plásticos estéreis e a análise é realizada imediatamente após a coleta.
c) Se a amostra estiver com temperatura diferente da temperatura ambiente aguarde seu resfriamento ou aquecimento antes de analisá-la.
d) Esta análise não requer nenhuma diluição, apenas agite o saco com as amostras e retire a quantidade (100 µL) necessária para análise.
6.4.2	Amostras de soluções parenterais - pré-esterilização e produto acabado:
a) Retire o produto de sua embalagem e transfira para béquer apirogênico.
b) Verifique na tabela abaixo se o produto precisa ser diluído ou se será usado sem diluição.
c) Caso necessário, faça diluições do produto em água para injeção estéril e apirogênica, usando tubos de ensaio e pipetas despirogenizadas. Agite os tubos em vortex após cada diluição por um minuto.
d) Verifique o pH do produto (se usado sem diluições) ou da diluição a ser usada e faça ajustes com Ácido Clorídrico diluído (para baixar o pH) ou Hidróxido de Sódio diluído (para elevar o pH), se necessário. O pH da amostra deve estar entre 6,0 e 8,0.
NOTA: Em caso de produtos novos onde não se tenha determinada a diluição a ser usada, calcule a MDV (Máxima Diluição Válida), conforme fórmula a seguir e dilua a amostra até a MDV.
	- MDV = L.E x [P], 
 (
onde: L.E = limite de endotoxina (especificação do produto).
 [P] = concentração do produto, na mesma unidade do limite de endotoxina.
 ( = sensibilidade do LAL (0,125 EU/mL).
e) Se o limite de endotoxina for expresso em EU/mL, a concentração do produto ([P]) não é usada no cálculo da MDV. 
f) Se o limite de endotoxina não estiver especificado em nenhum compêndio oficial, este pode ser calculado pela fórmula:
	- LE = K ,
 M
onde: K = dose limite humana de endotoxina por kg de peso corpóreo = 5,0 EU/kg 
 M = dose máxima do produto por kg de peso em um período de uma hora 
 Tabela 3: Diluições para produto acabado e expressão de resultado.
	PRODUTOS
	DILUIÇÃO
	SENSIBILIDADE DO REAGENTE L.A.L
	RESULTADO
	Água para injeção
	Puro
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Aminofilina 24mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<0,521 EU/mg
	Atrofarma 0,25 mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<50,000 EU/mg
	Bicarbonato de Sódio 8,4%
	1:40
	0,125 EU/mL
	<5,000 EU/mEq
	Bicarbonato de Sódio 10%
	1:40
	0,125 EU/mL
	<4,202 EU/mEq
	Butilbrometo de Escopolamina + Dipirona monoidratada
	1:100
	0,125 EU/mL
	<12,500 EU/mL
	Butilbrometo de Escopolamina 20mg/mL
	1:200
	0,125 EU/mL
	<1,250 EU/mg
	Cloreto de Potássio 10%
	1:50
	0,125 EU/mL
	<4,664 EU/mEq
	Cloreto de Potássio 19,1%
	1:50
	0,125 EU/mL
	<2,441 EU/mEq
	Cloreto de Sódio 0,9%
	Puro
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Cloreto de Sódio 0,9% + Glicose 5%
	Puro
	0,125 EU/mL
	<2,500 EU/g
	Cloreto de Sódio 10%
	1:10
	0,125 EU/mL
	<1,250 EU/mL
	Cloreto de Sódio 20%
	1:10
	0,125 EU/mL
	<1,250 EU/mL
	Cloridrato de Ranitidina 25mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<0,500 EU/mg
	Diclofarma 25mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<0,500 EU/mg
	Dipifarma 500mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<12,500 EU/mL
	Fosfato Dissódico de Dexametasona 2mg/mL
	1:500
	0,125 EU/mL
	<31,250 EU/mg
	Fosfato Dissódico de Dexametasona 4mg/mL
	1:500
	0,125 EU/mL
	<15,625 EU/mg
	Fosfato de Potássio 2mEq/mL
	1:50
	0,125 EU/mL
	<1,100 EU/mg
	Fração Ácida
	2,86mL p/ BV 100mL
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Fração Básica
	3,52mL p/ BV 100mL
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Fração Ácida - Cálcio 2,5 mEq/L
	2,9mL p/ BV 100mL
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Furosefarma10mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<1,250 EU/mg
	Glicose 5%
	1:32
	0,03 EU/mL
	<0,240 EU/mL
	Glicose 10%
	1:32
	0,03 EU/mL
	<0,240 EU/mL
	Glicose 25%
	1:32
	0,03 EU/mL
	<0,240 EU/mL
	Glicose 50%
	1:32
	0,03 EU/mL
	<0,240 EU/mL
	Manitol 20%
	1:2
	0,125 EU/mL
	<1,250 EU/g
	Metrofarma 5mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<2,500 EU/mg
	Nidazofarma 5mg/mL
	1:5
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mg
	Ringer Simples
	Puro
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Ringer Lactato
	Puro
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Vitamina C 100mg/mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mg
	NOTA: Soluções de Glicose com concentrações acima de 5%, deve-se diluir em água para injetáveis, se necessário, até concentração de 5% (p/v) de glicose, em seguida, realizar a diluição decimal indicada para teste. 
6.4.3	Concentrado polieletrolítico para hemodiálise (CPHD) – produto acabado:
NOTA: Conforme RDC nº 08/2001, o produto deve ser diluído conforme uso antes de ser testado.
Para fração ácida meça 2,86 mL da amostra com pipeta graduada despirogenizada, transfira para balão volumétrico de 100 mL despirogenizado, adicione mais ou menos 50mL de água para injeção estéril e apirogênica, homogenize e complete com mais água até o volume do balão volumétrico. Agite.
Para fração ácida - cálcio 2,5 mEq/L meça 2,9 mL da amostra com pipeta graduada despirogenizada, transfira para balão volumétrico de 100 mL despirogenizado, adicione mais ou menos 50mL de água para injeção estéril e apirogênica, homogenize e complete com mais água até o volume do balão volumétrico. Agite.
Para fração básica, meça 3,5 mL da amostra com pipeta graduada despirogenizada, transfira para balão volumétrico de 100 mL despirogenizado, adicione mais ou menos 50mL de água para injeção estéril e apirogênica, homogenize e complete com mais água até o volume do balão volumétrico. Agite.
Transfira cerca de 50 mL da amostra diluída para béquer despirogenizado.
Verifique o pH da solução e ajuste o da fração básica com Ácido Clorídrico diluído e o da fração ácida com Hidróxido de Sódio diluído para se obter pH entre 6,0 e 8,0.
6.4.4	Matérias-primas:
a) Verifique na tabela abaixo a quantidade de matéria-prima a ser pesada ou medida, o volume no qual esta será diluída inicialmente (diluição inicial) e se há outras diluições (diluição para teste)
NOTA: Em caso de matérias-primas onde não se tenha determinado a diluição a ser usada, calcule a MDV, conforme fórmula descrita no sub-item 6.4.2 e dilua a amostra até a MDV calculada. Nos casos de matérias-primas utilizadas na preparação de soluções parenterais que não tenham referências de limite em compêndios oficiais, o limite deverá ser considerado o mesmo do medicamento no qual esta matéria-prima faça parte de sua formulação. Caso a matéria-prima seja usada em mais de uma formulação, deve-se escolher a que usa maior quantidade de matéria-prima.
b) Em béquer despirogenizado de tamanho suficiente para preparar a amostra pese ou meça a quantidade de matéria-prima.
c) Adicione a quantidade de água para injeção estéril e apirogênica definida e mexa bem até obter uma solução homogênea. Faça outras diluições, se necessário, em tubos de ensaio despirogenizados sempre utilizando como diluente água para injeção estéril e apirogênica. Agite os tubos em vortex por 1 minuto.
d) Verifique o pH da diluição a ser usada e faça ajustes com Ácido Clorídrico diluído (para baixar o pH) ou Hidróxido de Sódio diluído (para elevar o pH), se necessário. O pH deve estar entre 6,0 e 8,0.
 Tabela 4: Diluições para matérias primas e expressão de resultado.
	MATÉRIA-PRIMA
	DILUIÇÃO INICIAL
	DILUIÇÃO PARA TESTE
	SENSIBILIDADE DO REAGENTE L.A.L
	RESULTADO
	Água para injeção
	Não se aplica
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Água de Osmose reversa
	Não se aplica
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Ácido acético glacial
	0,3 mL / 50 mL
	2,9 mL p/ BV 100 mL (Puro)
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Ácido ascórbico
	5 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mg
	Ácido cítrico anidro
	0,1 g / 250 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,312 EU/mg
	Ácido fênico
	0,2 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 3,125 EU/mg
	Ácido láctico
	0,5 mL / 50mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 12,500 EU/mL
	Álcool benzílico
	2 mL/ 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,500 EU/mg
	Aminofilina
	1,2 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,521 EU/mg
	Atropina (Sulfato)
	0,1 g / 400 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 50,000 EU/mg
	Bicarbonato de sódio (Para hemodiálise)
	4,2 g / 50 mL
	3,5 mL p/ BV 100 mL (Puro)
	0,125 EU/mL
	<0,125 EU/mL
	Bicarbonato de sódio 
	5 g / 50 mL
	1:40
	0,125 EU/mL
	< 5,000 EU/mEq
	Butilbrometo de escopolamina
	0,2 g / 50mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 12,500 EU/mL
	Citrato de sódio
	0,6 g / 50 mL
	1:500
	0,125 EU/mL
	< 5,208 EU/mg
	Cloreto de cálcio
	0,1 g / 500 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Cloreto de cálcio a 50% p/v
	0,9 mL / 50 mL
	2,9 mL p/ BV 100 mL (Puro)
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Cloreto de magnésio
	0,2 g / 50 mL
	2,9 mL p/ BV 100 mL (Puro)
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Cloreto de potássio
	0,12 g / 400mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Cloreto de sódio 
	0,9 g / 100 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Cloreto de sódio (Para hemodiálise)
	10,5 g / 50 mL
	2,9 mL p/ BV 100 mL (Puro)
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Cloridrato de ranitidina
	1,3 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,500 EU/mg
	Dexametasona Fosfato dissódico
	0,1 g / 50 mL
	1:500
	0,125 EU/mL
	< 31,250 EU/mg
	Glicose (Dextrose)
	2,5 g / 50 mL
	1:32
	0,03 EU/mL
	< 0,240 EU/mL
	Diclofenaco sódico
	1,3 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,500 EU/mg
	Dipirona monoidratada
	5 g / 10 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 12,500 EU/mL
	EDTA dissódico
	0,1 g / 100 mL
	1:5
	0,125 EU/mL
	< 0,625 EU/mg
	Fosfato de potássio dibásico
	7,8 g / 50 mL
	1:600
	0,125 EU/mL
	< 0,479 EU/mg
	Fosfato de potássio monobásico
	0,5 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 1,250 EU/mg
	Fosfato de sódio dibásico
	1,5 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,417 EU/mg
	Fosfato de sódio dibásico heptahidratado
	0,8 g / 50 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,008 EU/mg
	Furosemida
	0,5 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 1,250 EU/mg
	Lactato de Sódio 50%
	0,31 mL / 50 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Manitol
	10 g / 50 mL
	1:2
	0,125 EU/mL
	< 1,250 EU/g
	Metoclopramida (Monocloridrato)
	0,3 g / 50 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 2,500 EU/mg
	Metronidazol Base
	0,3 g / 50 mL
	1:5
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mg
	Polietileno de Alta densidade
	25 g / 300 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Polietileno de Baixa densidade
	25 g / 300 mL
	Puro
	0,125 EU/mL
	< 0,125 EU/mL
	Propilenoglicol
	3,4 mL / 10 mL
	1:100
	0,125 EU/mL
	< 0,037 EU/mg
 
6.4.5	Polietileno (matéria-prima):
	a) Pese 25 g do polietileno em béquer despirogenizado com capacidade de 500mL.
b) Adicione 300 mL de água estéril e apirogênica no béquer contendo a amostra.
c) Envolva a boca do béquer com papel manteiga. Passe fita crepe para vedar o recipiente. Identifique-o com tipo de polietileno (alta ou baixa densidade) e número do lote.
d) Leve para autoclave e esterilize a 121°C por 15 minutos (ciclo de líquidos), conforme procedimento CQM 044.
e) Após esterilização, aguarde o resfriamento da solução até temperatura ambiente.
f) Transfira cerca de 50 mL do extrato para béquer despirogenizado. 
g) Verifique o pH da solução a ser usada (extrato) e faça ajustes com Ácido Clorídrico diluído (para baixar o pH) ou Hidróxido de Sódio diluído (para elevar o pH), se necessário. O pH deve estar entre 6,0 e 8,0.
6.5	Execução do ensaio:
6.5.1	Controle negativo da água:
a) Transfira, com auxílio de pipetador de volume ajustável e usando ponteira apirogênica, 100 (L da água para injeção estéril e apirogênica usada para fazer as diluições das amostras, para tubo contendo 100 (L do reagente L.A.L. Homogeneízelevemente, identifique e incube em banho seco a 37°C ± 1°C por 1 hora. Ajuste o tempo em relógio minuteiro.
6.5.2	Controle positivo da água:
a) Transfira, com auxílio de pipetador de volume ajustável e usando ponteira apirogênica, 10 (L da diluição de endotoxina com concentração 2,5 EU/mL e 100 (L da água apirogênica usada para fazer as diluições, para tubo de ensaio contendo 100 (L do reagente L.A.L. Homogeneíze levemente, identifique e incube em banho seco a 37°C ± 1°C por 1 hora. Ajuste o tempo em relógio minuteiro.
NOTA: Este controle deve ser realizado apenas uma vez para cada frasco de LAL reconstituído.
6.5.3	Controle positivo da amostra:
a) Transfira, com auxílio de pipetador de volume ajustável e usando ponteira apirogênica, 10 (L da diluição de endotoxina com concentração 2,5 EU/mL para tubo de ensaio contendo 100 (L do reagente L.A.L. e 100 µL da amostra em teste. Homogeneíze levemente os tubos de ensaio, identifique e incube em banho seco a 37°C ± 1°C por 1 hora. Ajuste o tempo em relógio minuteiro.
6.5.4	Teste (Rotina) da amostra:
a) Transfira, com auxílio de pipetador de volume ajustável e usando ponteira apirogênica, 100(L da diluição da amostra em teste com pH já ajustado para tubo de ensaio contendo 100 (L do reagente L.A.L. Homogeneíze levemente, identifique e incube os tubos em banho seco a 37°C ± 1°C por 1 hora. Ajuste o tempo em relógio minuteiro.
6.5.5	Leitura do teste:
a) Após o período de 1 hora, retire lentamente os tubos de ensaio do banho seco, observando sempre o aspecto da solução teste.
b) Inverta lentamente o tubo de ensaio até um ângulo de 180º, observando:
 - Se houve formação de gel.
 - Se houve quebra do gel durante a inversão.
 - Se não houve formação de gel.
6.6	Interpretação dos resultados:
a) Reação positiva: é caracterizada pela formação de gel firme que resiste a inversão completa do tubo a um ângulo de 180º. Registre este resultado como positivo (+). 
b) Reação negativa: é caracterizada pela ausência de gel ou pela formação de um gel parcial que se quebra quando o tubo é invertido. Registre este resultado como negativo ( - ). 
c) Teste inválido: o teste é inválido quando os controles positivos derem resultados negativos e/ou quando o controle negativo der resultado positivo. 
NOTA: Em casos de resultados positivos, o teste deve ser repetido utilizando o produto diluído até sua MDV (Máxima Diluição Válida) ou o mais próximo possível deste valor, sem ultrapassá-lo. Se o resultado permanecer positivo, a amostra está reprovada. 
6.7. Expressão dos resultados: 
O resultado deve ser calculado conforme fórmula abaixo:
 Resultado = Diluição utilizada x sensibilidade do L.A.L
 [P]
b) Quando a especificação do produto é expressa em EU/mL, não precisa usar a concentração [P] do produto no cálculo, portanto:
 Resultado = Diluição utilizada x sensibilidade do L.A.L
c) A expressão final deve ser < que o resultado encontrado, quando a reação for negativa ou > que o resultado encontrado, quando a reação for positiva.
d) Como são valores invariáveis, a expressão dos resultados obtidos nos ensaios, para produtos injetáveis e matérias-primas, estão também dispostos nas tabelas 3 e 4 nos subitens 6.4.2 e 6.4.4 respectivamente. Para águas, produtos CPHD e polietileno, por serem analisados sem diluição e com reagente sensibilidade 0,125 EU/mL, expressar o resultado como <0,125 EU/mL quando não houver formação de gel e >0,125 EU/mL quando houver formação de gel. 
 
7.	TESTE DE CONFIRMAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO LAL
a) Após recebimento de um novo lote de reagente L.A.L e antes de sua utilização, realize o teste descrito a seguir para avaliar se a sensibilidade do lote está conforme especificada pelo fabricante.
b) Reconstitua um reagente LAL e uma endotoxina padrão, conforme descritos nos subitens 6.2 e 6.3, respectivamente.
c) Transfira para um tubo de ensaio apirogênico, com auxílio de pipetador automático e usando ponteira apirogênica, 100 (L das concentrações 2(; (; (/2 e (/4 de endotoxina, em quadruplicata, contendo 100 (L do reagente L.A.L. Homogeneíze levemente, identifique e incube os tubos em banho seco a 37°C ± 1°C por 1 hora.
d) Registre os resultados e faça os cálculos necessários para determinação da sensibilidade do L.A.L no formulário, conforme anexo II.
e) O resultado deve estar entre (/2 e 2(, sendo que ( é a sensibilidade rotulada do reagente.
8.	REGISTROS:
a) Registre os resultados das análises no formulário “Registro do teste de endotoxina” (Anexo III) e nos formulários específicos para cada tipo de amostra:
- Soluções parenterais (produto acabado): Registro analítico, conforme procedimento CQM 055 e laudo de análise, conforme anexo I.
- Soluções parenterais (pré-filtração e pré-esterilização): laudo analítico, conforme procedimento CQM 011.
- CPHD (produto acabado): Registro analítico, conforme procedimento CQM 055 e laudo de análise, conforme procedimento CQM 028.
- Água para injetáveis (API) e Água de osmose reversa/ Água purificada (AP): laudo de análise, conforme procedimento CQM 007.
- Matérias-primas e polietileno: laudo de análise, conforme procedimento CQM 009.
9.	ANEXOS
Anexo I: Laudo de análise de Soluções Parenterais (Produto Acabado).
Anexo II: Ensaio de Confirmação da sensibilidade do LAL.
Anexo III: Registro do teste de endotoxina.
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Farmacopeia Brasileira, 5ª edição, 2010, volume I, item 5.5.2.2 e volume II.
POP CQM 007 – Análise microbiológica de água.
POP CQM 006 – Normas para lavagem e preparo das vidrarias e demais materiais do controle de qualidade microbiológico
POP CQM 009 – Avaliação da carga microbiana nas matérias-primas
POP CQM 011 – Avaliação microbiológica de produtos antes da esterilização – Biocarga.
POP CQM 028 – Análise microbiológica de produtos CPHD.
POP CQM 044 – Operação e limpeza da estufa de despirogenização do Controle de Qualidade Microbiológico.
POP CQM 055 – Fluxo do recebimento a liberação de produtos pelo controle de qualidade microbiológico.
USP 40, 2017.