AULA 01

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EPI E ESTERILIZAÇÃO
Profa. Bibiana Paula Dambrós
Biossegurança
Conjunto de ações voltadas para a prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços, visando à saúde do homem, dos animais, à preservação do meio ambiente e à qualidade dos resultados.
o Brasil, existem duas vertentes da biossegurança: 
Legal: está voltada à manipulação de organismos geneticamente modificados (OGMs) e de células tronco, regulamentada pela Lei n° 11.105/05. 
Praticada: está relacionada aos riscos químicos, físicos, biológicos, ergonômicos e de acidentes encontrados nos ambientes laborais, amparada principalmente pelas normas regulamentadoras do Ministério do Trabalho e Emprego (MTE), Resoluções da Agência Nacional de Vigilância em Saúde (ANVISA) e do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA)
BIOSSEGURANÇA
Equipamentos de segurança: são considerados como barreiras primárias de contenção e, juntamente com as boas práticas em laboratório, visam à proteção dos indivíduos e dos próprios laboratórios, sendo classificados como equipamentos de proteção individual (EPI) e coletiva (EPC).
USO OBRIGATÓRIO!!
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo1/biosseguranca.htm
http://telelab.aids.gov.br/index.php/component/joomdle/course/5
Cabines
São considerados como barreiras primárias de segurança biológica, são equipamentos projetados para remover ou minimizar exposições aos materiais biológicos perigosos. 
A CSB é o dispositivo principal utilizado para proporcionar a contenção de borrifos ou aerossóis infecciosos provocados por inúmeros procedimentos microbiológicos.
Luvas de látex
óculos
mÁSCARA
jALECO
http://www.avental10.com.br/paginadeataque/Jaleco1.jpg
Gorro descartável
Proibido
jalecos
luvas
máscaras
RECEPÇÃO DE AMOSTRAS
Desinfecção e Esterilização
Esterilização
A esterilização consiste na morte de todas as formas de vida microbiana, inclusive esporos altamente resistentes.
ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO
A esterilização pelo calor pode ser alcançada utilizando equipamentos que trabalham balanceando tempo, temperatura e pressão atmosférica, como por exemplo, a autoclave que utiliza os mesmos procedimentos de uma panela de pressão.
121 graus – 15 min.
ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO
O calor seco é utilizado para esterilizar, principalmente material de vidro, materiais sólidos termoestáveis e alguns outros materiais utilizados no laboratório de biotecnologia. É um dos métodos de esterilização mais utilizados e de muito fácil aplicação. O material utilizado é apenas uma estufa de alta temperatura (160° - 200°C) por 2 horas.
Esterilização
PASTEURIZAÇÃO
Utilizada principalmente para o leite. Aquecimento do leite a 62º C por 30 minutos, seguido de rápido resfriamento. Este processo mata células vegetativas de patógenos transmitidos pelo leite mas não esteriliza o leite.
RADIAÇÃO
Luz ultravioleta (UV): formação de dímeros de timina, consequentemente inibição da replicação do DNA impedindo o crescimento do organismo.
 Raios-X: Maior energia e poder de penetração que a UV, causam a morte pela produção de radicais livres o que danifica o DNA do organismo.
FILTRAÇÃO
Filtro: Membrana de Nitrocelulose (poros de 0,22 m). Promove a retenção de bactérias e esporos.
desinfecção
A desinfecção consiste na morte de muitos micro-organismos mas não de todos.
Desinfetantes: compostos químicos.
AGENTES QUÍMICOS 
Ação dos agentes químicos:
Ruptura da membrana celular;
Modificação de proteínas;
Modificação do DNA.
Ruptura de membranas celulares
Álcool
Concentração – 70-85% 
Tempo de contato – 10-30 minutos 
Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, fungos, vírus hidrofílicos (germicida variável) e vírus lipofílicos 
 Atua na desorganização da estrutura lipídica das membranas e na desnaturação de proteínas.
Características Importantes – inativado por matéria orgânica, efeito irritante da pele e dos olhos, tóxico se absorvido ou ingerido. 
Aplicação – Superfícies de equipamentos e antissepsia de pele 
		
	
Na coleta de amostra biológica para a realização de Hemocultura ou para introdução de cateteres intravenosos utilizar compostos iodados.
Ruptura de membranas celulares
 Detergentes
Compostos por uma porção hidrofóbica de cadeia longa e lipossolúvel, apolar e um grupo hidrofílico polar (cátion, ânion, não-iônico). 
Fenóis
Concentração – 0,2-2% 
Tempo de contato – 10-30 minutos 
Atividade Contra – Bactérias, fungos, micobactérias, vírus hidrofílico (germicida variável) e vírus lipofílicos. 
Características Importantes – Efeito residual, corrosivo, efeito irritante da pele e olhos e tóxico se absorvido ou ingerido. 
Aplicação – Descontaminação ambiental, de bancadas, pisos e superfícies contaminados com material infectante. .
Hexaclorofeno (sabão germicida)/ Lysol (Metilfenol).
Surfactante
MODIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Cloro (Cl)
Concentração – 0,1-2% (1000 a 20000 ppm) 
Tempo de contato – 10-30 minutos 
Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, fungos, esporos (germicida variável) e vírus. 
Características Importantes – inativado por matéria orgânica; efeito residual; corrosivos; efeito irritante de pele, olhos e trato respiratório; tóxico se absorvido ou ingerido. 
Aplicação – Descontaminação ambiental de bancadas, pisos e superfícies contaminados com material infectante. 
Iodo
Antisséptico cutâneo mais efetivo.
Inativa enzimas que contem sulfidril e se liga a resíduos de tirosina em proteínas.
 Tintura de Iodo (iodo a 2%): utilizado antes de coleta de sangue;
 Iodóforos: complexos de iodo com detergentes. Utilizado no preparo da pele antes de cirurgias
MODIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
 Metais pesados
Mercúrio e a prata: atividade antibacteriana - Ligam-se aos grupos sulfidril, impedindo a 	atividade enzimática.
 Timerosal (merthiolate) e a merbromina (mercurocromo), contém mercúrio: são utilizados como antissépticos cutâneos;
Nitrato de prata: utilizado na prevenção de oftalmia gonocóccica neonatal;
Sulfadiazina de prata: utilizada na prevenção de infecções de ferimentos por queimadura.
Peróxido de hidrogênio
 Utilizado como antisséptico na limpeza de ferimentos e para desinfetar lentes de contato.
 Agente oxidante que se liga aos grupos sulfidril e inibe a atividade enzimática.
MODIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Formaldeído e Glutaraldeído
Formalina (formaldeído a 37%): promove a desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos;
Glutaraldeído: 10x mais eficaz que o formaldeído e menos tóxico. 
Óxido de Etileno
Gás Óxido de Etileno: Utilizado na esterilização de materiais termossensíveis (instrumentos cirúrgicos e plásticos).
Promove a morte dos micro-organismos por meio da alquilação (Grupo hidroxietil destroi átomos de hidrogênio reativos presentes em grupos amino e hidroxil essenciais) de proteínas e ácidos nucléicos.
Ácidos e álcalis:Ácidos fortes e álcalis desnaturam proteínas
Utilizado na esterilização de equipamentos de terapia respiratória.
MODIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Cristal violeta
Violeta de genciana: Utilizado como antisséptico cutâneo.
Ação: Ligação da molécula do corante de carga positiva aos grupos fosfato de carga negativa dos ácidos nucléicos.
- Verde malaquita (Componente do meio de Löwenstein-Jensen): Inibe o crescimento de micro-organismos no escarro. 
Introdução à Microbiologia Clínica
oBJETIVO
# Orientar os profissionais em relação aos cuidados necessários à obtenção de amostras para exames bacteriológicos;
# Padronizar as técnicas de coleta utilizadas para exames bacteriológicos;
# Favorecer a integração das equipes de servidores envolvidos no processo de atendimento aos pacientes;
# Melhorar a qualidade do serviço prestado pelo Laboratório de Bacteriologia aos médicos e pacientes do serviço;
Bacteriologia clínica
# se ocupa do diagnóstico laboratorial das doenças infecciosas humanascausadas por bactérias;
# O diagnóstico correto é feito através de técnicas de cultivo (cultura) do material biológico do paciente, identificação da bactéria (agente etiológico) e teste de sensibilidade a antibióticos (antibiograma);
# Condições essenciais para diagnóstico através da cultura:
 momento da solicitação médica;
 técnica de coleta;
 conhecimento profissional para execução do exame.
Microbiota humana
# microbiota: conjunto de microrganismos que naturalmente vive em diversas partes do organismo humano. Estas regiões são revestidas por pele e mucosas e mantém contato com o meio externo.
# não se verifica presença de microbiota em cavidades estéreis e órgãos fechados: cérebro, bexiga, sangue, coração, etc.
# locais como pele, uretra, mucosa ocular, genital, intestinos apresentam microbiota numerosa, que pode interferir nas culturas.
# Avaliar a microbiota local.
Fases do Ciclo Diagnóstico 
FONTES DE RESULTADOS INADEQUADOS
Fase Pré-analítica (60% -70%)
Coleta
Transporte 
Armazenamento
Fase analítica (20% - 30%)
Fase pós-analítica (10%)
JCS-RV01- MAIO2006
Cultivos apropriados
COLHEITA DE AMOSTRAS
Quando se suspeita de doença infecciosa
Técnicas dirigidas à detecção sorológica de antígenos e anticorpos
Anticorpos monoclonais
Sondas de DNA - PCR
Outros procedimentos sem cultivo
Coleta
Realizada do local real da infecção;
Obtenção de uma quantidade suficiente de amostra;
Utilização de dispositivos apropriados para a coleta do material;
Obtenção de cultura antes da administração de antibióticos;
Identificação do material.
Transporte
 Seringa:
Exsudatos frescos ou amostras líquidas: 
procedimento válido para amostras enviadas para análise logo após a coleta.
Frascos :
Frascos de boca larga com sistema de fechamento eficiente contra vazamento e contaminação de material;
Swab
Algodão estéril
Rayon ou Dracon
Alginato de cálcio
Solução salina, meio de cultura Amie (com ou sem carvão),Stuart e Clairy Blair. 
Técnica apropriada para embalar e rotular agentes etiológicos:
Recipiente primário com tampa à prova d’água
Recipiente secundário de preferência de metal
Embalagem para envio fabricada em cartão ondulado, cartão grosso ou gomaespuma
Transporte de Amostras
Quando há a necessidade de transporte de amostras entre unidades laboratoriais, deve-se ficar atentos à manutenção da integridade das amostras (tempo e temperatura de transporte) e às condições de biossegurança de quem realiza o transporte e daqueles que possam vir a ter contato eventual com o material transportado.
Amostras rejeitadas
Amostra recebida em formalina;
Coleta de escarro de 24 horas;
Único swab para vários fins;
Recipiente impróprio, contaminado ou com vazamento;
Placas de cultura com crescimento excessivo ou secas.
ABSCESSOS
Também material de fístula, gangrena, celulite, etc.
 Remover exsudato superficial limpando com salina estéril ou álcool 70%.
"Swab" (abscesso aberto): colher na profundidade, transporte em meio de Stuart ou similar; 2 amostras, uma para Gram e uma para cultura.
 Aspirado (abscesso fechado): com seringa e agulha, transferir assépticamente todo o material para meio de transporte anaeróbio, volume mínimo: 1 ml.
Transporte: < 2h, Tº ambiente
Armazenamento: < 48 h, Tº ambiente
 Desinfetar o frasco aplicando álcool 70% e deixando 1 minuto.
 Desinfetar o local da punção venosa;
 sepsis: 2-3 amostras de locais separadas em 10 minutos. 
 Endocardite aguda: 3 amostras de 3 locais diferentes em 1-2 horas.
 Endocardite subaguda: 3 amostras de 3 locais diferentes, de 15 em 15 minutos; se (-) em 24 hs, colher mais 3 amostras.
 Febre de origem indeterminada: 2-3 amostras com mais de 1 hora entre uma e outra; se (-) após 24 hs, colher mais 2-3 amostras.
Transporte: < 2 h, tº ambiente
armazenamento: < 48h, tº ambiente
SANGUE
 Limpar a pele ao redor da inserção do cateter com álcool;
 Remover o cateter assépticamente, 
 Cortar ± 5 cm da extremidade distal, colocando em tubo seco estéril.
Transporte: <15 min, tº ambiente
armazenamento: < 24 h, 4º C.
* Cultura semi-quantitativa (método de maki): cateter venoso central, periférico, hickman, broviac, swan-ganz, umbelical, arterial e NPP.
CATETER VASCULAR
Desinfetar o local da punção com iodo. (Médico)
Volumes mínimos para pesquisa de:
Bactérias 1 ml		fungos 2 ml
BAAR 2 ml			vírus 1 ml
Obs: processar primeiro a microbiologia - hemocultura paralela.
Transporte: para pesquisa de bactérias não deve ser refrigerado < 15 minutos, tº ambiente, para pesquisa de vírus, refrigerar imediatamente
 < 15 minutos, 4º C
Armazenamento: bact: < 24 hs, tº ambiente
 vírus: < 72 hs, 4º C
LÍQUIDO CÉFALO-RAQUIDIANO
 Limpar a superfície com salina estéril.
 Se possível, biopsiar (meio de transporte para anaeróbios);
 aspirar com seringa e agulha;
 último caso, colher com "swab“ e colocar em meio de transporte (stuart).
Transporte: < 2 h, tº ambiente
armazenamento: < 48 h, tº ambiente 
ÚLCERA DE DECÚBITO (ESCARAS)
Conjuntiva: colher de ambos os olhos com "swabs" umedecidos em salina ou caldo; 
 semear imediatamente em ágar sangue e agar chocolate, ou transportar em stuart;
 passar os "swabs" já semeados em lâminas.
Córnea: colher conjuntiva conforme o descrito acima; instilar 2 gotas de anestésico; colher com espátula material da lesão (úlcera), e processar como o anterior.
Transporte: placas <15 min, tº ambiente
 "swabs" <2 h, tº ambiente
armazenamento: < 48 h, tº ambiente (em stuart)
OLHOS
 Colher diretamente em recipiente limpo e seco.
Transporte: < 1 h, Tº ambiente
Armazenamento: < 48 h, 4º C
Se não for possível, caldo de transporte entérico.
Armazenamento: < 48 h, Tº ambiente
Clostridium difficile:
Idem ao anterior.
Transporte: < 1 h, Tº ambiente
 1-48 h, 4º C
 > 48 h, - 20º C
FEZES
	Abdominal, ascítico, bile, articular, pericárdico, peritoneal, pleural, sinovial.
 Desinfetar o local de punção com iodo; aspirar o material, colocar em meio de transporte para anaeróbios >1 ml.
Transporte: <15 min, tº ambiente
armazenamento: < 48 h, tº ambiente (líquido pericárdico e pesquisa de fungos a 4º C).
FLUIDOS
 ASPIRADO TRAQUEAL e LAVADO OU ESCOVADO BRONCOALVEOLAR:
Colher em recipiente seco, estéril.
Transporte: < 2 h, Tº ambiente
Armazenamento: < 48 h, 4º C
 ESCARRO:
=> Expectorado: tosse profunda, recipiente seco, estéril.
Transporte: < 2h, Tº ambiente
Armazenamento: < 24 h, 4º C
TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR
 ESCARRO:
=> induzido: após nebulização com ± 25 ml salina estéril, recipiente seco, estéril.
Transporte: < 2 h, tº ambiente
armazenamento: < 24 h, tº ambiente
obs: se após a avaliação no laboratório, a qualidade da amostra não for adequada (<10 células escamosas/ campo e >25 leucócitos/campo), repetir a coleta.
TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR
ORAL:
 limpar com "swab"; colher com outro.
 Se houver lesão, fragmento de biópsia ou aspirado.
Transporte: < 2 h, tº ambiente
armazenamento: < 48h, tº ambiente
NASAL: 
Anterior: pesquisa de portadores de Staphylococcus ou de Streptococcus. 
"Swab" umedecido com salina estéril.
Transporte: < 2 h, tº ambiente
armazenamento: < 48 h, tº ambiente
TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR
NASO e OROFARINGE:
	Semear imediatamente em AS/ACh.
Transporte: < 15 min, TA
Armazenamento: < 24 h, TAº
 
Transporte: < 48 h, TA- transporte Stuart
TRANSPORTE:
Sempre que possível, meio de transporte para anaeróbios; se não, acrescentar algumas gotas de salina estéril para evitar ressecamento.
FRAGMENTO DE TECIDO
JATO INTERMEDIÁRIO:
 lavar a região uretral com água e sabão.
 Enxaguar com gaze molhada.
 Desprezar o jato inicial, colhendo o jato médio.
Transporte: recipiente estéril, boca larga (< 2 h, taº) 						 laminocultivo transporte:< 24 h, TA).
Armazenamento: < 48 h, 4º C
PACIENTE COM SV DEMORA: desinfetar local da coleta com álcool 70%
 com seringa e agulha, colher 5-10 ml urina
*não colher por sondagem vesical a não ser quando absolutamente necessário (o procedimento pode PROVOCAR uma ITU).
URINA
=> Líquido amniótico: aspirar com seringa, inocular em meio de transporte para anaeróbios.
	
=> Glândula de bartholin: desinfetar a pele com iodo; aspirar o fluido. Inocular em meio de transporte para anaeróbios.
==> Fundo de saco, endométrio: aspirar o material e incluir em frasco de transporte para anaeróbios.
==> Cérvix: após limpeza do muco/secreção com um "swab", colher com outro material do canal cervica, e incluir em meio de transporte.
==> Secreção vaginal: limpar o excesso de secreção, colher com "swab", e colocar em meio de transporte (stuart). Um segundo "swab" passado em lâmina para pesquisa de gardnerella vaginalis
transporte: <2h, tº ambiente.
Armazenamento: <48h, tº ambiente.
GENITAL FEMININO
=> Próstata: tubo seco, estéril, após massagem prostática.
=> Uretra: "swab" urogenital no lumen uretral (2-4 cm profundidade), rotativamente, colocando em meio de transporte (stuart).
Transporte: <2h, tº ambiente.
Armazenamento: <48h, tº ambiente.
LESÃO ULCERADA MASCULINA OU FEMININA:
 colher com "swab", após limpeza e colocar em meio de transporte (stuart).
 Para pesquisa de treponema: lâmina que deve ser transportada em câmara úmida.
GENITAL MASCULINO
Técnica apropriada para embalar e rotular agentes etiológicos:
TEMPO CRÍTICO PARA ENTREGA DA AMOSTRA AO LABORATÓRIO E MEIOS DE TRANSPORTE
Fase Analítica
Seleção de meios de cultura primários
Transferência e cultura das amostras clinicas
Interpretação das culturas e análise dos resultados.
Meio de cultura
Compostos por
Hidrolisados de proteínas: fonte de C e N
Carboidratos: 
Tampões
Enriquecimento
Inibidores
Indicadores de pH
Ágar: agente solidificante
Substratos para ação enzimática
Destinados para a reprodução, isolamento e análise dos microrganismos de interesse médico.
Meios de cultura:
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO
Ágar Nutriente
Salina tamponada
Clary Blair
Meio Stuart
Água peptonada
MEIOS PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO
MEIOS PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO
Meio de cultura não seletivos
Crescimento:
Ágar chocolate
Ágar sangue
Ágar Cled
Ágar Mueller Hinton
Ágar chocolate: meio nutritivo maioria bactérias, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hematina. 
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. 
Ágar sangue: meio não seletivo, crescimento de bactérias gram – e +
Cled- Ágar cystine lactose eletrolyte deficient: meio que permite o crescimento de gram+ e gram- .
Ágar Mueller-Hinton é um meio de cultura microbiológico que é freqüentemente usado para testes de susceptibilidade antimicrobiana. 
Meio de cultura não seletivos
Meio de cultura seletivos
Ágar Manitol
Ágar Mac Conkey, EMB
Ágar Salmomella Shigella
Ágar Sabouraud 
Ágar Bili-Esculina
Ágar Dnase
Ágar TSI (metabolismo diferencial)
Ágar Lowestein Jensen
Ágar Manitol - Famílias Micrococcaceae - para isolamento de Staphylococcus spp através da fermentação do manitol, 
Ágar Mac Conkey, EMB - Crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose
Ágar Salmomella Shigella – identificação das Salmomella e Shigella 
Ágar Sabouraud - Identificação de fungos patogênicos e leveduras.
Ágar Bili-Esculina - Isolamento e identificação de estreptococos.
Ágar Dnase - Recomendado para a detecção da atividade desoxiribonuclease de bactérias e fungos. Staphylococcus aureus.
Ágar TSI - Diferenciação de patógenos entéricos (E. coli) pela capacidade de determinar a fermentação do carboidrato.
Ágar Lowestein Jensen - Mycobacterium tuberculosis 
Meio de cultura seletivos
Caldos 
Enriquecimento
Caldo tetrationato
Caldo selenito
Caldo nitrato
Caldo malonato
Caldo triptona e SIM
Caldo BHI
Caldo tetrationato Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp.- Cosposto por sais de bile impede o crescimento de bactérias Gram-positivas e o iodo proporciona o impedimento de crescimento de espécies fecais.
Caldo selenito. Diferenciar e identificar vários tipos de bactérias especialmente a família Enterobacteriaceae. Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos.
Caldo malonato usado para a diferenciação de bactérias gram-negativas com base na habilidade de utilizar malonato e produzir ácido pirúvico.
Caldo triptona e SIM Metabolizar o triptofano em indol. Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.
Caldo BHI. Caldo infusão de cerebro e coração e um meio altamente nutritivo empregado para a propagação de cocos.
Caldos Enriquecimento
Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população. 
Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão.
Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.
Declínio: A maioria das células está em processo de morte
OBRIGADO
Referências
TRABULSI, Luiz Rachid et al. Microbiologia. 5. ed. São Paulo: Atheneu, 2008.
OPLUSTIL,C.P et all. Procedimentos básicos em Microbiologia Clínica. 3 ed. São Paulo: Sarvier, 2010.
LEVINSON, W. e JAWETZ, E. Microbiologia Médica e Imunologia. 7ed. Porto alegre: Artmed, 2005. Reimpressão 2008. 632 p.
WINN JR., W. C et al. Koneman: Diagnostico microbiologico: texto e atlas colorido. 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.
 TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. xxviii, 934 p. ISBN 9788536326061.