AulaFlavonoides2014-2(Paula)

Prévia do material em texto

FLAVONOIDES 
Paula Mendonça Leite 
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas 
UFMG 
O QUE SÃO 
• Metabólitos secundários; 
• Importante classe de polifenóis; 
• Abundantes e amplamente distribuídos no 
reino vegetal. 
 
 
 
C6C3C6 
A C 
B 
BLOCOS DE CONSTRUÇÃO 
Via do acetato 
Via do chiquimato 
Via mista 
POLARIDADE/SOLUBILIDADE 
Aglicona/genina 
(cristais amarelos) 
Heterosídeo 
Aquecimento e pH extremos podem 
levar à hidrólise dos heterosídeos 
ATIVIDADES BIOLÓGICAS 
• Proteção contra radiação UV e visível; 
• Defesa contra herbivoria; 
• Pigmentação (principalmente laranja e amarela); 
• Atração de polinizadores; 
• Controle da ação hormonal; 
• Antioxidantes (conjugação das duplas). 
LOCALIZAÇÃO NAS PLANTAS 
Flores, raízes, caules, sementes e frutos: 
– Constituintes vacuolares; 
– Ceras das folhas; 
– Ligados a parede celular; 
– Células epidermais ou subepidermais. 
 
IMPORTÂNCIA ECONÔMICA 
• Manufatura do cacau, da uva; 
• Fermentação do chá verde; 
• Cores fornecidas pelos pigmentos; 
• Nutrição e sabor dos alimentos; 
• Propriedade terapêuticas. 
 
FLAVONOIDES COMO MARCADORES 
• Abundância no reino vegetal; 
• Especificidade em algumas espécies; 
• Facilidade de identificação; 
• Estabilidade. 
Calêndula 
CLASSES FLAVONOÍDICAS 
Aurona Isoflavonoides Antocianidina cátion flavílico 
Diidrochalcona Chalcona Flavanona 
Diidroflavonol Flavonol Flavona 
BIOSSÍNTESE - PRECURSORES 
BIOSSÍNTESE - PRECURSORES 
BIOSSÍNTESE - PRECURSORES 
BIOSSÍNTESE - PRECURSORES 
BIOSSÍNTESE - PRECURSORES 
BIOSSÍNTESE - PRECURSORES 
BIOSSÍNTESE 
BIOSSÍNTESE 
E2 – estilbenosintase 
E1 – chalcona sintase 
ESTILBENOS CHALCONAS 
BIOSSÍNTESE 
Nesses compostos e em seus derivados 
observam-se dois tipos de padrão de 
oxidação 
BIOSSÍNTESE 
O2 
2-oxoglutarato 
 
E4 
O2 
2-oxoglutarato E4 
Posteriormente podem 
ocorrer glicosilações, 
metilações, dimetilalilações. 
ANTOCIANOS 
Cores laranja, rosa, escarlate, vermelho, violeta 
e azul nas flores e frutos 
– Antocianidinasforma livre 
– Antocianosídeosheterosídeos (forma mais 
estável) 
AURONAS 
• Cor de ouro 
• Semelhança estrutural com as flavonas 
• Anel C possui 5 membros 
BIFLAVONOIDES 
• Flavonoides diméricos (flavonas e flavanonas) 
 
• Substituintes em C5, C7 e C4’ (geralmente) 
 
• Combinações: flavona-flavona, flavona-
flavanona e flavanona-flavanona 
 
• Hidroxilas podem estar metoxiladas 
 
• Heterosídeos pouco frequentes 
 
• A ligação das unidades pode ser C-C ou C-O-C. 
CHALCONAS 
Precursora dos flavonoides: 
– Desprovidas do anel C 
– Presença de uma cadeia tricarbonada cetônica, 
α,β-insaturada 
– Substituições no anel A: C2’, C4’ e C6’ 
– Anel B normalmente não está substituído 
DIIDROFLAVONOIS E FLAVANONAS 
Ausência da ligação dupla entre C2 e C3. 
FLAVONAS E FLAVONÓIS 
Substituídos por hidroxilas em C5, C7, C3’ e C4’ 
 
Originários da mesma via biossintética 
ISOFLAVONOIDES 
Distribuição taxonômica restrita (Fabaceae) 
– Anel B ligado a C3 
– Existem de vários tipos (isoflavonas, 
isoflavanonas, etc) 
Fitoalexinas com propriedades 
biológicas: 
• Atividade estrogênica-isoflavonas e 
cumestanos; 
• Antifúngica e antibacteriana-
isoflavonoides; 
• Inseticidas-rotenoides. 
ISOFLAVONAS 
NEOFLAVONOIDES 
Compostos de origem natural contendo 15 carbonos, 
associados estruturalmente e biogeneticamente aos 
flavonoides. 
4-arilcumarina 3-arilbenzofurano 
EXTRAÇÃO 
Com solvente de polaridades crescentes 
– Primeira: solvente apolar (óleos, gorduras, esteróis e 
pigmentos) 
 
– Segunda: solvente de polaridade média – acetato de etila, 
clorofórmio, diclorometano (agliconas livres pouco polares) 
 
– Terceira: solvente polar – acetona, metanol (agliconas mais 
polares) 
 
– Quarta: solvente mais polar - água quente (heterosídeos) 
 
Em meio ácido pode-se extrair antocianinas e antocianidinas! 
 
EXTRAÇÃO Material vegetal 
pulverizado 
Torta 
Óleos 
Gorduras 
Esteróis 
Pigmentos Solvente um pouco mais polar 
(clorofórmio, diclorometano, acetato de 
etila, éter etílico) 
Agliconas livres pouco 
polares (flavonas, flavo-
nois, flavanonas, di-hidro-
flavonois, isoflavonas) 
Extrato Torta 
Solvente de polaridade maior 
(acetona, metanol, água) 
Torta 
Extrato 
Agliconas poli-hidroxiladas, 
flavonas e flavonois mais po- 
lares, auronas, chalconas 
Água aquecida 
Extrato 
Heterosídeos mais polares 
(poliglicosídeos, flavanodiois, 
catequinas e procianidinas) 
Solvente apolar (hexano) 
Extrato apolar 
CARACTERIZAÇÃO 
• Diretamente no farmacógeno (histoquímica) 
 
 
 
• Em extratos vegetais (cromáticos, cromato- 
gráficos, espectroscópicos ou fotométricos) 
Hidrolisar 
heterosídeos 
HISTOQUÍMICA 
• Para fenólicos localizados na parede celular 
• Quando se tem alta produção dessa classe 
– Antocianinas (já são coradas) 
– Flavonoides incolores (UV) 
– Proantocianidinas (ácido nitroso) 
– Cloreto férrico (diferencia alguns tipos 
flavonoídicos) 
Desvantagem: interferências; 
perda de material quando os 
flavonoides estão localizados 
em vacúolos. 
ENSAIOS CROMÁTICOS 
• Análise preliminar; 
• Podem ser empregados em doseamentos; 
• Algumas vezes podem diferenciar os tipos 
flavonoídicos; 
 
Cores variam de acordo com o núcleo, número e 
localização dos substituintes hidroxilados 
 
REAÇÃO DA CIANIDINA 
• Adição de magnésio 
– Derivados flavônicos (flavonol, flavona, etc) de cor amarela 
reduzem-se adquirindo coloração avermelhada 
– Derivados antociânicos tornam-se azuis 
– Reação negativa para chalconas e isoflavonas 
 
REAÇÃO CITRO-BÓRICA 
• Adição de ácidos cítrico e bórico 
 
– Flavonas, flavonóis e chalconas adquirem tons 
amarelados e fluorescência amarelo-esverdeada 
– Reação negativa para flavanonas e isoflavonas 
REAÇÃO COM H2SO4 
• Adição de ácido sulfúrico concentrado 
 
– Compostos flavônicos formam sais de oxônio com 
o H2SO4 concentrado e precipitam com adição de 
H2O 
• Flavonas e flavonóis: amarelo 
• Flavanonas: laranja a vermelho 
• Chalconas e auronas: vermelho a carmim 
REAÇÃO DE MARINI-BETTOLO 
• Adição de pentacloreto de antimônio em 
tetracloreto de carbono (análogo ao H2SO4) 
 
– Chalconas: precipitado vermelho escuro ou 
violáceo 
– Flavonas: precipitado amarelo ou laranja 
REAÇÃO DE FOLIN-CIOCALTEAU 
• Solução comercial: flavonoides tornam-se 
azulados ou acinzentados na presença de 
vapores de amônia (oxidorredução - em meio 
alcalino os fenóis reduzem a mistura dos 
ácidos fosfotúngstico e fosfomolíbdico). 
REAÇÃO COM DIFENILBORATO 
5-Difenilborato 1% em metanol 
 
Positivo para flavonoides 
ENSAIOS CROMATOGRÁFICOS 
• CCD (mais empregada) – sílica, celulose ou 
poliamida 
• Fase móvel 
– n-butanol:ácido acético:água (agliconas) 
– Ácido acéticos (heterosídeos) 
• Revelação luz UV (254 nm; 365 nm) 
– Reveladores diversos como AlCl3, FeCl3, vanilina 
sulfúrica, difenilborato de aminoetanol, folin-
ciocalteau, etc 
REVELADOR: AlCl3 
Com AlCl3 
Banda II Banda I 
A 
240-285 300-400 
λ (nm) 
Efeito 
batocrômico 
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO 
• Separação preliminar (facultativa): reagentes 
de precipitação, Soxhlet 
• Técnicas clássicas (excelentes resultados) 
– Cromatografia em coluna 
– Cromatografia em papel 
– Cromatografia em camada delgada preparativa 
– Cromatografia de alta eficiência– Cromatografia gasosa 
– Recristalização 
– Eletroforese 
CCD PREPARATIVA, CROMATOGRAFIA EM 
COLUNA, CROMATOGRAFIA EM PAPEL 
• CCD preparativa e cromatografia em papel: 
eluídas, raspadas/cortadas, deadsorvidas, 
concentradas e purificadas 
– Heterosídeos (cromatografia em papel) 
– Agliconas e compostos menos hidrofílicos (CCD e 
cromatografia em coluna) 
CLAE 
• Mais utilizadas para separação de misturas 
complexas 
• Separa flavonoides (classes e compostos das 
mesma classe estrutural) 
• Permite associar ao espectro UV quando 
acopladas a detectores de diodo 
CG, RECRISTALIZAÇÃO E ELETROFORESE 
• CG: restrita a agliconas termoestáveis 
• Recristalização: com metanol, etanol e 
clorofórmio 
• Eletroforese: para flavonoides com carga 
DOSEAMENTO 
• A dosagem conjunta é dificultada pela 
complexidade da matriz de compostos 
fenólicos 
– CLAE – método rápido e preciso que permite separação e 
doseamento 
– Ensaios cromáticos – construção de curva de calibração 
– Método espectrofotométrico – substâncias purificadas 
DOSEAMENTO 
– Precipitação com AlCl3 em meio alcalino 
• Formação de um gel que adsorve os flavonoides 
• Lavagem e centrifugação para purificação 
• Tratamento com ácido acético para dissolução do gel 
• Dosagem colorimétrica 
 
DOSEAMENTO 
– Precipitação com AlCl3 em meio alcalino 
O complexo ceto-
hidroxila é mais 
estável 
IDENTIFICAÇÃO 
• Métodos espectrofotométricos: UV com 
reagentes de deslocamento 
Banda II Banda I 
A 
240-285 300-400 
λ (nm) 
Banda II – 
benzoíla 
Banda I – 
cinamoíla 
Flavonoides 
possuem espectro 
característico 
IDENTIFICAÇÃO 
• CromóforoÉ um grupo não saturado covalente, responsável pela 
absorção eletrônica; 
• Auxócromo É um grupo saturado que, quando ligado a um cromóforo, 
altera tanto o comprimento de onda como a intensidade da absorção, Ex.: 
OH, NH2 e Cl; 
• Deslocamento Batocrômico É o deslocamento de uma absorção para 
um comprimento de onda maior devido a efeitos de substituição ou de 
solvente; 
• Deslocamento HipsocrômicoÉ o deslocamento de uma absorção para 
um comprimento de onda menor devido a efeitos de substituição ou de 
solvente; 
• Efeito HipercrômicoÉ um aumento da intensidade da absorção; 
• Efeito HipocrômicoÉ uma diminuição da intensidade de absorção. 
IDENTIFICAÇÃO 
Banda II Banda I 
IDENTIFICAÇÃO 
É possível diferenciar os tipos flavonoídicos de 
acordo com a banda de absorção (auxílio de 
agente de deslocamento): 
Banda II (nm) Banda I (nm) Flavonoide 
250-280 310-350 Flavona 
250-280 330-360 Flavonol (3-OH substituído) 
250-280 350-385 Flavonol (3-OH livre) 
230-270 340-390 Chalconas 
270-280 465-560 Antocianidinas 
Flavonas: banda I em 304-350 nm 
 
Flavonois: banda I em 352-385 nm 
 
Dihidroflavonois, flavanonas e 
isoflavonas: banda I de baixa 
intensidade 
 
Chalconas e auronas: banda I 
dominante em relação a II 
 
Antocianidinas: banda I em 465-
550 nm e banda II de baixa 
intensidade 
IDENTIFICAÇÃO 
• Métodos espectroscópicos (para compostos 
puros) 
– IV 
– RMN 
– EM 
PROPRIEDADES FARMOCOLÓGICAS 
• Poucos efeitos adversos 
• Hidrólise dos glicosídeos no TGI, o que facilita 
a absorção 
• Alguns têm alta taxa de ligação a proteína 
plasmática 
• Há alguns medicamentos elaborados a partir 
de flavonoides 
• Doenças circulatórias 
• Hipertensão 
• Cofator da vitamina C 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 
• Atuam na captura e neutralização de radicais 
• A sua estrutura influencia diretamente na 
propriedade antioxidante 
– Hidroxila livre 
– Hidroxila sem impedimento estérico 
 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 
• Sequestrador de radicais 
• Grupo catecólico 
• Conjugação doas anéis B e C 
• Combinação das hidroxilas 3 e 5 com a carbonila em 4 
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 
• Propriedades quelantes 
ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA 
• Ação antioxidante e sequestradora da radicais 
• Modulação na função de células inflamatórias 
• Modulação da atividade de enzimas 
proinflamatórias 
• Modulação da produção de outras moléculas 
proinflamatórias 
• Modulação da expressão de 
 genes proinflamatórios 
ATIVIDADE ANTITROMBÓTICA 
• Inibidores potentes da atividade plaquetária 
(quercetina, kaempferol e miricetina) 
– Inibição do tromboxano A2 (ativação e 
agregação plaquetárias) 
 
ATIVIDADE HORMONAL 
As isoflavonas previnem a fragilidade óssea 
– Muito utilizadas contra a osteoporose 
– Reposição hormonal (semelhança com estrogênio) 
• menopausa 
– Previnem doenças cardiovasculares e câncer de 
mama e útero nas mulheres 
– Encontradas em grande quantidade na soja 
 
OUTRAS ATIVIDADES 
• Atividades: 
– Antiviral (heterosídeos são considerados menos ativos) 
• HIV, herpes, poliomelite 
– Antitumoral 
• Principalmente terapia preventiva 
– Sobre a permeabilidade capilar 
• Proteção capilar (fatores P) 
• Aumento da permeabilidade e diminuição da 
fragilidade capilar 
• Estimulam microcirculação 
 
Diminui o risco de doenças 
coronarianas, melhora a 
memória... 
OUTRAS ATIVIDADES 
• Atividade anti-espasmodica (atuação na 
musculatura lisa) 
• Atividade anti-bacteriana 
• Atividade anti-fúngica 
• Atividade ansiolítica 
DROGAS VEGETAIS 
• Camomila 
• Erva de São João 
• Ginkgo 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Sinônimos: Matricaria chamomilla L., M. recutita L., M. 
suaveolens L. 
 
• Família: Asteraceae 
 
• Parte utilizada: flores 
 
• Origem: Europa Central 
 
 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Uma das plantas mais antigas utilizadas pela 
humanidade 
 
• Egípcios utilizavam para tratamento da malária 
 
• Também era utilizada para a aromatização de vinhos 
 
• Simboliza prosperidade 
 
• Usos: medicinal, cosmético e alimentar 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Componentes químicos 
– Óleo essencial (0,4 – 1,5%) 
• Chamazuleno 
• Alfa-bisabolol e sesquiterpenos relacionados 
– Apigenina e glicosídeos flavonoídicos relacionados 
(> 8%) 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Droga vegetal: flores secas 
 
• Extrato padronizado: (1:1) água:etanol 45% 
 
• Forma comercial: Camomilina C 
Auxiliar para alívio dos 
sintomas associados com a 
primeira dentição. 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Uso interno 
– Distúrbios do trato gastrointestinal 
– Ansiedade e nervosismo 
• Uso externo 
– Inflamações e irritações na pela 
• Inalação 
– Alívio de irritações no trato respiratório 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Farmacologia 
– Em ratos com dermatite induzida a fração 
flavonoídica foi eficaz em reduzir a inflamação, 
sendo que apigenina e luteolina foram mais ativas 
que indometacina 
 
– Em estudo clínico multicêntrico a aplicação tópica 
de extrato de camomila foi mais eficaz na redução 
da inflamação que a hidrocortisona 0,25% 
CAMOMILA - Chamomilla recutita 
• Contraindicação: a pacientes com hiper-
sensibilidade às plantas da família Asteraceae 
• Efeitos mutagênicos e teratogênicos: não 
observados 
• Reações adversas: a presença de lactonas 
pode causar alergia 
• Posologia: 2-8 g da droga vegetal 3x ao dia; 1-
4 mL extrato fluido 3x ao dia 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• Nome científico: Hypericum perforatum 
 
• Família: Clusiaceae 
 
• Distribuição: África, Ásia, 
Austrália, Europa, Nova Zelândia 
e naturalizada nas Américas 
 
 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• Inicialmente usada pela sua capacidade de 
cicatrizar feridas, úlceras de pele e queimaduras 
 
• Foi utilizada no tratamentode inúmeras doenças 
mentais – suposta capacidade de afastar maus 
espíritos 
 
• Hoje tem aplicação em estados depressivos 
suaves a moderados, ansiedade, insónia, dores 
nevrálgicas e, ainda, atividades antiviral, 
antibacteriana e fotossensibilizadora. 
 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• Compostos químicos 
– Naftodiantronas (0,5 – 30%) 
• Hipericina 
• Hiperforina 
– Flavonoides (2 – 4%) 
• Hiperosídeo 
• Quercitrina 
• Rutina 
– Taninos (7 – 15%) 
 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• Droga vegetal: flores e partes aéreas secas 
 
• Extrato padronizado: (1:1) água:etanol 45% 
 
• Forma comercial: 
Tratamento da depressão. 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• Atividade antidepressiva (decorrente da 
interação das várias classes de substâncias 
presentes) 
– in vitro: flavonoides inibem a MAO 
– Amentoflavona se liga a receptores benzodiazepí-
nicos como o diazepam 
– Em teste com ratos essa atividade foi demonstrada 
Na Alemanha é mais prescrita 
que a fluoxetina para esses casos. 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• Outras atividades 
– Diminuição da contração do músculo liso 
– Atividade antibacteriana e antiviral 
– Inibição da proteína quinase C (atividade anti-
inflamatória) 
– Acelera cicatrização (uso tópico) 
ERVA DE SÃO JOÃO 
• 2-4 semanas para o início do efeito 
• Precauções: 
– Pode causar fotossensibilização 
– Potencial para muitas interações medicamentosas 
• Não-mutagênico 
• Dose diária: 900mg de extrato 
GINKGO - Ginkgo biloba 
• Família: Ginkgoaceae 
 
• Distribuição: China, Japão, Coréias do Norte e 
do Sul; plantações na Europa e América do 
Norte; no Brasil há exemplares 
 produzidos de sementes 
 
• Parte utilizada: folha 
GINKGO - Ginkgo biloba 
• Fóssil vivo (mais de 300 milhões de anos) 
• Árvores caducas (perdem folhas no inverno) 
• Símbolo de longevidade e paz 
• Era utilizado para feridas e asma brônquica 
• Também é utilizada como ornamento 
GINKGO - Ginkgo biloba 
• Compostos químicos 
– Glicosídeos flavonoídicos (22-27%) 
• Quercetina 
• Canferol 
• Isoramnetina 
– Ginkolídeos (3-4%) 
– Outros fenólicos 
GINKGO - Ginkgo biloba 
• Droga vegetal: folhas secas 
 
• Extrato padronizado: (50:1) acetona 
 
• Forma comercial: 
Circulex: ginkgo, berries 
e extrato de semente de 
uva (flavonoides) 
GINKGO – Ginkgo biloba 
• Estudos clínicos revelam sua utilidade no 
tratamento de: 
– Disfunções cognitivas 
– Demência 
 
Causadas por mecanismos degenerativos ou 
insuficiência cerebral 
Também é utilizado para 
vertigem e zumbido 
GINKGO – Ginkgo biloba 
• O extrato de folha de ginkgo pode melhorar a 
oxigenação do cérebro pelo melhoramento do 
fluxo sanguíneo (microcirculação) 
– Relaxamento das paredes dos vasos sanguíneos 
– Reforço da utilização de oxigênio e glicose 
– Diminui inflamação e exerce efeito neuroprotetor (inibe 
PAF) 
– Sequestra radicais livres 
– Melhora propriedade reológicas do sangue (viscosidade) 
 
Há relatos do seu 
benefício no Alzheimer 
GINKGO – Ginkgo biloba 
• Baixa toxicidade 
• Não há evidências de efeitos mutagênico e 
carcinogênico 
• Efeitos adversos raros: dores de cabeça, 
problemas no estômago, diarreia, alergia 
• 40 a 80 mg 3x ao dia (extrato padronizado 
com 24% de glicosídeos flavonoídicos) 
 Não utilizar com 
anticoagulantes! 
SUPLEMENTOS 
Antioxidantes 
 
Melhoram circulação 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 BUTERWECK, V. St. John’s Wort: Quality Issues and Active Compounds. Botanical Medicine: From Bench to 
 Bedside. Mary Ann Liebert, Inc. 
 
 DEWICK, P. M. Medicinal natural product – a biosynthetic approach. 3. ed. Suiça: Department of Ecology - 
Swedish University of Agricultural Science, 2009. 520p. 
 
 Essential Medicines and Health Products Information Portal. Disponível em: 
http://apps.who.int/medicinedocs/en/d/Js4927e/16.html. 
 
 GARCIA, A.; GUILLAMON, E.; VILLARES, A.; ROSTAGNO, M.; MARTINEZ, J. Flavonoids as anti-inflamatory agents: 
implications in cancer and cardiovascular diseases. Inflammation Research. v. 58, p. 537-552, 2009. 
 
 GOMES, A.; FERNANDES, E.; LIMA, J.; MIRA, L.; CORVO, L. Molecular mechanisms of anti-inflamatory activity 
mediated by flavonoids. Current Medicinal Chemistry. v. 15, p. 1586-1605, 2008. 
 
 HEIM, K.; TAGLIAFERRO, A.; BOBILYA, D. Flavonoids antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity 
relationships. Journal of Nutritional Biochemistry. v. 13, p. 572-584, 2002. 
 
 HYLA CASS, M. D. Herbs for the nervous system: Ginkgo, Kava, Valerian, Passionflower. Seminars in Integrative 
Medicine. v. 2, p. 82-88. 
 
 NIJVELDT, R.; NOOD, E.; HOORN, D.; BOELENS, P. NORREN, K.; LEEUWEN, P. Flavonoids: a review of probable 
mechanisms of action and potential applications. American Journal of Clinical Nutrition. v. 74, p. 418-425, 2001. 
 
 SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMAN, G.; MELLO, J.C.P.DE; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia 
– Da planta ao medicamento. 5ed. Santa Catarina/ Rio Grande do Sul: Editora UFSC/UFRS, 2005.