coliformes aula explicativa

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Profa Leila Larisa Medeiros Marques 
Contagem de coliformes totais e 
coliformes termotolerantes em alimentos 
Definição 
 COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias constituído por 
bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não 
formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na 
presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção 
de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os 
seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. 
 
 COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES 
TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se 
desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à 
temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal 
componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns 
coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam 
essa capacidade. 
 
Definição 
Coliformes- significado em alimentos 
 Totais: Utilizado para avaliar as condições higiênicas, 
sendo que altas contagens significam contaminação pós-
processamento, limpezas e sanificações deficientes, 
tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o 
processamento ou estocagem. 
 Termotolerantes: empregado como indicador de 
contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico-
sanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é 
constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu 
habitat no trato intestinal do homem e de outro animais. 
Além de indicar possibilidade de presença de outros 
patógenos entéricos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnicas 
 
» Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matérias-
primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite 
máximo tolerado ≥ 100 UFC/g ou mL. 
 
 »NMP (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matérias-
primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite 
máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL. 
 
 »NMP (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e 
de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O 
valor é obtido em NMP/100mL. 
 
 
Pesquisa de coliformes: método em placas. 
Amostra: açúcar cristal, morango, coxinha, hambúrguer , 
bolacha recheada e amendoim cru 
Técnica: Contagem em placas, Plaqueamento 
em profundidade, plaqueamento sobrecamada 
ou pour plate 
Ágar cristal violeta (VRBA) 
 sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+; 
 Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose. 
 
 
 Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+. 
 
 
 Sais biliares – inibem Gram+; 
 Mistura de fosfatos– impedem a acidificação do meio. 
 
 
 
 Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a 
fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes 
que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli. 
 
Caldo verde brilhante bile 2% lactose 
Caldo EC 
Ágar eosina azul de metileno (EMB) 
IN 62, 2003 
Ler capítulo VI 
45C°/24 a 48h 
Plaqueamento sobrecamada 
Prova confirmativa 
para coliformes totais 
Prova presuntiva 
para coliformes totais 
Prova confirmativa 
para coliformes 
termotolerantes 
Em posição invertida 
Cada colônia para um caldo verde brilhante 
Para cada tubo positivo no caldo 
verde brilhante passar para um 
tubo de caldo EC 
Selecionar 3 colônias típicas e 
3 atípicas para investigar 
15 mL 
Colônias em VRBA e Caldo EC 
 Colônias típicas e atípicas 
Caracterização da E. coli 
De cada tubo EC positivo 
Expressão dos resultados 
R =(C x c x d)/r 
 R = Resultado 
 C = número de colônias contadas 
 c = número de colônias confirmadas 
 r = número de colônias repicadas 
 d = diluição utilizada 
 
Resultado final= Rt (colônias típicas) + Ra (colônias atípicas) 
 
Atenção!!! 
Será um cálculo para coliformes 
totais, outro para coliformes 
termotolerantes e outro para E. coli!!!! 
Exemplo de resultado parcial 
Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. 
 
 Para confirmação de coliformes a 35°C, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. 
 Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. 
 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: 
 RT = ? 
 
 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: 
 RA = ? 
 
 O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas: 
 
 Resultado final = RT + RA = ????????????? UFC/g ou mL de coliformes a 35°C.. 
Exemplo de resultado parcial 
Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas. 
 
 Para confirmação de coliformes a 35°C, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. 
 Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. 
 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: 
 RT = 20 x 4 x 100/5 = 1.600 
 
 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: 
 RA = 10 x 2 x 100/5 = 400 
 
 O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas: 
 
 Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 10
3 UFC/g ou mL de coliformes a 
35°C. 
Exercício 
1. Na placa de VRBA e diluição 10-2 = 20 colônias contadas, das quais 15 eram típicas e 
5 atípicas; Para confirmação, foram repicadas 3 colônias de cada tipo para tubos 
verde brilhante e depois para tubos EC; 
2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a 
confirmação de coliformes totais; 
3. Para confirmação de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos 
repicados de colônias típicas, 2 positivos; e das 3 atípicas repicadas, 1 positiva. 
4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de típicas quanto atípicas), 1 
placa EMB típico deu positivo e 1 atípico positivo para E. coli. 
 
 Diante destes resultados, pergunta-se: 
 1. Qual o valor para coliformes a 35°C? 
 2. Qual o valor para coliformes a 45°C? 
3. Qual o valor de E. coli/mL? 
Pesquisa de coliformes: 
Número mais provável (NMP) 
Amostra: leite em pó, leite pasteurizado, água, açúcar refinado, 
leite fermentado, conserva de vegetais 
 
NMP 
 Técnica do número mais provável ou técnica dos tubos múltiplos- 
estimativa da quantidade de MO presentes na amostra; 
 Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições 
empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de 
produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três, 
cinco ou dez tubos; 
 Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população 
presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a 
população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre 
a população de coliformes de origem fecal (coliformes 
termotolerantes) 
NMP 
 a) Teste presuntivo para coliformes totais– visa detectar a 
presença de microrganismos fermentadores de lactose. Meio 
utilizado: caldo lauril sulfato triptose. Princípio: turvamento 
e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham. 
 b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo 
verde brilhante lactose Bile 2%. Princípio: turvamento e produção 
de gás por bactérias gram negativas, características do grupo 
coliforme. 
 c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantes- 
utilização do meio de cultura seletivo “Caldo EC” e incubação em 
44-45ºC. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado 
pelo tubo de Durham. 
 c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas 
bioquímicas. 
Poder tamponante 
Inibe 
Gram+ 
Inibem 
Gram+ 
InibeGram+ 
IN 62, 2003 
Ler capítulo X e 
grupo da água 
capítulo IX 
NMP – 
série 3 tubos 
(alimentos 
sólidos) 
Para cada EC+, um EMB 
2 colônias caract. de cada 
EMB em tubo de AN 
De cada tubo positivo: 
1 série em [ ] dupla do meio 
10-1 10-1 
00222
222 10
-2 
10 mL 1 mL 1 mL 
NMP – 
série 3 
tubos 
(produtos 
líquidos) 
Para cada EC+, um EMB 
2 colônias caract. de cada 
EMB em tubo de AN 
De cada tubo AN 
De cada tubo positivo: 
10-1 10-2 
100 
Exemplo 
 10-1 
 
 
 10-2 
 
 
 
 10-3 
Tubos positivos 
 
3 
 
 
3 
 
 
1 
Técnica de 
esgotamento 
– por estrias 
Técnica de esgotamento – por estrias 
Em todos os tubos e placas 
de TODAS as etapas, 
identificar o número da 
equipe, o nome da amostra e 
o mais importante a 
DILUIÇÃO que está ou a 
DILUIÇÃO precedente !!!!! 
Combinação tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com 
95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL 
 A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP 
para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL. 
 
 
 
 
 OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01 
g ou mL, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 
1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise. 
NMP- água e gelo 
 Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar série de 
5 tubos. 
 
 Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar série de 
10 tubos. 
De cada tubo positivo: 
De cada tubo positivo: 
Padrões microbiólógicos 
Produto Tolerância 
para amostra 
indicativa – 
Coliformes 
Totais ou a 
35°C 
Tolerância para 
amostra indicativa – 
Coliformes 
Termotolerantes ou 
a 45°C 
 
Legislação Técnica a ser 
utilizada 
Água para 
consumo humano 
Ausência em 
100mL 
Ausência em 100mL 
 
Portaria 518, 
2004 
NMP – série de 10 
tubos 
Leite 
pasteurizado 
4NMP/mL 2NMP/mL IN 62, 2011 NMP – série de 3 
tubos- amostra pura 
Leite em pó - 10NMP/g RDC 12, 2001 NMP – série 3 tubos- 
amostra diluída 
(10mL na primeira 
diluição) 
Açúcar cristal - 102UFC/g RDC 12, 2001 Plaqueamento 
Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004 
1. Prova do Indol; 
2. Vermelho de metila-VM; 
3. Voges-Proskauer-VP; 
4. Citrato. 
Testes bioquímicos para coliformes- 
identificação da E. coli 
Escherichia coli 
É um indicador de contaminação fecal. 
 
A presença de número considerável indica: 
 - Processamento térmico inadequado; 
 - Recontaminação após processamento; 
- Proliferação microbiana no alimentos que irá permitir a 
possível multiplicação de MO patogênicos. 
1. Prova do Indol 
Triptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico + amônia 
 desaminação 
 
 
 + p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs) 
 
 
 
 Composto quinoidal (vermelho) 
CH2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído 
em meio ácido= quinona 
 
 
 
 
2. Vermelho de metila-VM 
 
 
 ácido láctico 
 ácido acético 
Glicose fermentação ácido fórmico 
 ácido mista ácido succínico 
 ácido etílico 
INDICADOR: 
Vermelho de metila – escala de 4,4 a 6,0. 
pH 4,4 cor vermelha - prova positiva 
pH 6,0 cor amarela (acetoína) - prova negativa 
3. Voges-Proskauer-VP 
Glicose 
 
2 ác. pirúvico 
 
 descarboxilação 
 
Acetilmetilcarbinol + ∝-naftol +KOH 40% Diacetila 
(acetoína) 
 
 
Diacetila + núcleo guanidina do ∝-naftol condensação Composto 
 Vermelho 
 
OBS .: cor cobre é resultado negativo 
Agente 
oxidante 
Catalisador 
Fermentação 
butilenoglicol 
4. Citrato 
 
 ciclo de Krebs 
Citrato citratase 
 ciclo da fermentação do citrato 
 
 
Citrato piruvato + CO2 
 
 CO2 + sódio carbonato de sódio 
Amônia como 
fonte de N 
pH 
alto 
 
Indicador de pH: azul de bromotimol 
pH 8,4=coloração azul-da-prússia 
pH 6,9= coloração verde 
pH 6,0= coloração amarela 
; 
Resultado das provas bioquímicas da E. coli 
Resultado das 
provas 
bioquímicas 
demais 
bactérias