Protocolo+IHQ RJA

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Fundación Favaloro 
Lic. Rafael Argüello 
 
Protocolo Inmunohistoquímica 
 
1) Incubar los slides con los cortes del tejido en parafina durante 90 min en la estufa a 60°C. 
“Genexbrand” super + charged. Cat nro C-5558 72u ($70 11-11-2010). 
2) Sumergir los Slides en el siguiente tren Hidratante: (Siempre con el rótulo hacia mí) 
Xilol Xilol Alcohol 
100% 
Alcohol 
100% 
Alcohol 
96% 
Alcohol 
96% 
Alcohol 
70% 
Alcohol 
50% 
Alcohol 
25% 
Agua Agua 
5 min 5 min 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min 5 min 5 min 
 
3) Antigen Retrieval. Sumergir los slides en un Koplin con buffer “Citra plus 10X” Genex BIO-I-
HK080-5K. Diluir con Agua destilada. Agregar otros 3 Koplins llenos de agua y agregar agua 
a la olla a presión aprox 200 ml. Poner en el microondas durante 15 min a máxima 
potencia. 
4) Sacar la olla a presión con mucho cuidado, con una regla liberar presión del vapor de agua 
y esperar hasta que la válvula amarilla de presión esté abajo. Dejar enfriar en el buffer 
citrato. 
5) Lavar con Agua destilada 2X durante 5 min. 
6) Opcional A) si pocos slides (bloqueante no sumergido): Delimitar la zona del corte del 
tejido con el marcador siliconado, evitar pasar muy cerca del tejido. A) Entonces, sumergir 
en Wash buffer antes de agregar con Gotero la solución bloqueante. 
7) Bloqueo de la endo-peroxidasa. (Metanol 3% de H2O2). Elegir A o B. A)Agregar 100ul de la 
solución bloqueante hasta cubrir. Incubar 10 min a temperatura ambiente con cámara 
húmeda. B) Si son muchos slides, se pueden sumergir en un Koplin con la solución 
bloqueante. (vol del recipiente del tren=200ml, si son más de 10 slides conviene poner 6ml 
de H2O2 en 194 de MetOH y sumergir ahí. 
8) Lavar con H2O destilada durante 5 min en un Koplin. No dejar secar en ningún momento. 
9) Opcional B) si muchos slides: Recién ahora delimitar con el PAP pen. 
10) Lavar con Wash buffer durante 5 min en un Koplin. (“Optimax Rinse buffer” Cat Bio-I-
HK583-5K). 
Fundación Favaloro 
Lic. Rafael Argüello 
 
11) Agregar aprox 100 ul de Solución de tapa azul (heladera) para bloquear los Fc Receptors 
con la suspensión de Goat IgG. Incubar 20 min a temperatura ambiente. 
12) Sin Lavar. Agregar 100 ul del anticuerpo primario diluído en Common antibody diluent. 
(Genex HK156 5Ke). 
13) Incubar a Temperatura ambiente durante 60 min en cámara húmeda. 
14) Lavar 2 veces el anticuerpo 1rio usando wash buffer. 
15) Si usa el ENvision+ para revelar pasar al paso 19) 
16) Agregar 100ul del link tapa amarilla (ab 2rio anti mouse biotinilado). Incubar a 
temperatura ambiente (o 37°C 15 min) durante 20 minutos. 
17) Lavar 2 veces con Wash buffer. Durante 5 min a T ambiente. 
18) Incubar a T ambiente durante 20 min (o 15 min a 37°C) con el Label (tapa roja) 
Streptavidina-Peroxidasa. 
19) Lavar 2X 5 min con Wash buffer. 
20) Agregar aprox 100ul de Envision Goat anti mouse polimer, incubar 30 min. 
21) Lavar 2X con Wash buffer. 
22) Revelado: Transladarse al microscopio con, dos Koplins (uno con los portas y Wash buffer 
y otro con Agua destilada) y el falcon con la solución reveladora. Volcar el wash buffer 
sobrante sacudiendo con cuidado y con una servilleta secar la superficie inferior del slide. 
Agregar la solución de AEC (tóxico) y vigilar bajo el microscopio óptico la reacción 
enzimática. Si se sabe cúal es el antígeno que se revela que más rápido empezar por ese. 
Esperar máximo 20 min. Frenar la reacción con Agua destilada. 
23) Contratinción con Hematoxilina: Poner a correr agua de la canilla a flujo bajo y constante 
sobre un Koplin. Agregar 1 ml de hematoxilina al porta y 3 segundos después sumergir en 
el Koplin que contiene agua corriendo. 
AEC: 4ml de H2O destilada + 1ml de H2O2 5x Sustrate buffer (citrato) + 2 gotas de AEC. 
HLA-G: 1/100 Hacer antigen retrieval. 
FOXP3: 1/100 Hacer Antigen retrieval. Bibliografía 10ug/ml, EDTA pH 8 o 9. 
Control positivo es tejido adenoide normal. 
CTLA-4: 1/50 Hacer Antigen retrieval. 
Fundación Favaloro 
Lic. Rafael Argüello 
 
INOS: 1/50 Ag retrieval Citra Plus. 
Tbet: 1/50. 
anti-Mouse Alexa 594 (Donkey): 1/1000 
CD27 FITC: Ag Retrieval (Citra?) 1/50. 
CD3: Ag Retrieval, Citra Plus. Opción 2 (no me funcionó) “Zymed Digest all 2” diluir una gota en 3 
gotas del diluytente. Dejar 10 minutos a 37 °C. y agregar Ready to use Zymed anti CD3. 
CD45RO: Sin Ag retrieval. Ready to use. 
CD68: 1/50 Antigen Retrieval Citra Plus.