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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA Y MEDICINA ORAL
PROTOCOLO DE ANTEPROYECTO DE INVESTIGACION
A.	IDENTIFICACION:
	1. Alumno(a):	 
	 Sebastián Martínez Badilla
 (sm.martinezb@gmail.com)
	2. Tutor(a) Principal:	
	 Prof. Ricardo Fernández-Ramires
 (ramiresfernandez@gmail.com)
	3. Tutores Asociados: 
	 Prof. Gina Pennacchiotti
	4. Asesores: 	
	 TM María José Flores
	5. Departamento:
	 Patología y Medicina Oral 
	6. Adscrito a Proyecto:
	 FONDECYT N° 11140281
	7. Título del Trabajo: “Caracterización inmunohistoquímica� de la expresión del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR) en biopsias de pacientes con displasia y carcinoma oral de células escamosas”. 
 
 
______________________ ________________________________
 Firma Tutor Principal Fecha
B. PROPUESTA DEL TRABAJO DE INVESTIGACION:
1. Antecedentes Bibliográficos Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
Introducción
Una neoplasia maligna se caracteriza por ser un tejido que tiende a invadir, infiltrar, destruir los tejidos adyacentes y diseminarse a tejidos distantes [metastizar] lo que dificulta su tratamiento (Kumar et al., 2010). La aparición de las neoplasias está aumentando debido al crecimiento y envejecimiento de la población, así como un aumento en la prevalencia de los factores de riesgo establecidos, como el tabaquismo, la inactividad física, sobrepeso y cambiantes patrones reproductivos asociados con la urbanización y desarrollo económico. Dentro de este grupo de patologías se encuentra el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el cual es el sexto cáncer más común en todo el mundo, con 600.000 nuevos casos reportados anualmente � ADDIN EN.CITE ��(Ferlay y cols., 2010; Torre y cols., 2015)�.
Hay casos en que el cáncer puede presentarse desde un primer momento como lesión neoplásica, pero hay otros en que puede derivar de una lesión previa en el epitelio, la cual evidencia cambios celulares que favorecen el desarrollo maligno (Ochsenius y cols., 2003). Estas lesiones suelen ser clínicamente asintomáticas y son conocidas como desórdenes potencialmente malignos [DPM] (Warnakulasuriya et al., 2007). Histológicamente estas lesiones puedes presentar distintos estados histopatológicos como hiperqueratosis epitelial, hiperplasia, atrofia, displasia, carcinoma in situ o un COCE superficial (Thompson, 2006).
La displasia de tejidos orales es una condición premaligna relativamente común que afecta aproximadamente a 5 por cada 1000 habitantes de la población (Mehanna y cols., 2009). Solo puede ser diagnosticada histológicamente, en la cual las células normales del epitelio son reemplazadas por células que se encuentran inmaduras o con una inapropiada diferenciación. La importancia de la displasia oral recae en que una proporción de aquellas lesiones pueden progresar a cáncer oral, donde reportes indican que el riesgo de progresión varía considerablemente entre un 6% al 36% (Reibel, 2003). En el presente, el tratamiento de elección es la extirpación quirúrgica, pero tiene un alto riesgo de recurrencia de las lesiones [35%], causando resecciones de tejido cada vez más extensos y que algunas veces requiere técnicas de reconstrucción complejas que le ocasionarían una significante morbilidad al paciente (Mehanna y cols., 2009). 
Estudios iniciales se encuentran examinando la estrategia de usar fármacos de manera preventiva para el tratamiento de desórdenes potencialmente malignos de la cavidad oral (khan y cols., 2016), estas estrategias se basan en estudios anteriores que comprobaron el uso retinoides para bajar la incidencia de pacientes con cáncer de cabeza y cuello (Hong. 1990). Actualmente el receptor del factor de crecimiento epidérmico [EGFR] es la única molécula que tiene un tratamiento farmacológico que se encuentra aprobado y regulado a nivel mundial para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello (kan y William�, 2014).
El receptor del factor de crecimiento epidérmico [EGFR] es una proteína citoplasmática transmembrana perteneciente a la familia de receptores tirosina kinasa HER [ErbB]. Cuando el ligando se une al receptor produce cambios en su conformación que desencadenan una cascada de transducción, que una vez activada contribuye con la formación de células de fenotipo maligno, incrementando la proliferación, metástasis y estimulando la angiogénesis (Normanno y cols., 2005).
Las terapias farmacológicas que tienen relación con EGFR y que han sido aprobadas para el tratamiento de cáncer incluyen el uso de anticuerpos y pequeñas moléculas que inhiben el receptor tirosina kinasa [TKIs], como es el anticuerpo monoclonal Cetuximab �que ha demostrado una mejoría en el tratamiento combinado con radioterapia en cáncer de cabeza y cuello (Bonner y cols., 2006). En el caso de los desórdenes potencialmente malignos de tejidos orales hay escasa literatura sobre la expresión de EGFR y del uso de bloqueadores para el tratamiento preventivo, estudios recientes evaluaron el tratamiento combinado de Cetuximab con radioterapia en pacientes con displasia del tracto aerodigestivo superior donde se demostró una disminución en la progresión a cáncer y recurrencia de lesiones premalignas (Khan y cols., 2016).
Este estudio busca evaluar la expresión de EGFR en muestras de pacientes con displasia oral de alto y bajo grado y de carcinoma oral de células escamosas, permitiendo traducirse en el posible uso de bloqueadores de EGFR, como el Cetuximab, para el tratamiento preventivo en la progresión de tejido displásico a neoplasias malignas y además reducir la recurrencia de nuevas lesiones potencialmente malignas.
Marco Teórico 
Carcinoma Oral de Células Escamosas [COCE]
El COCE es la neoplasia maligna más frecuente de la cavidad oral representando el 90% (Lambert y cols., 2011). Corresponde a una neoplasia epitelial maligna e invasiva del epitelio plano estratificado que puede producir proliferación destructiva local y metástasis a distancia (Sapp y cols., 2005).Se origina como un proceso secuencial, con una acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas, metabólicas, hormonales y otras consecutivas de la exposición a carcinógenos (Yokota y Sugimura, 1993). Los factores de riesgo asociados al cáncer oral y faríngeo son el uso de tabaco, abuso de alcohol, bajo consumo de frutas y verduras y un bajo nivel socioeconómico (Conway y cols., 2008; Scully y Bagan, 2009). Clínicamente se observa como úlceras induradas que no cicatrizan, lesiones exofíticas, leucoplásicas o eritroplásicas (Neville y cols., 2009), suele ser asintomático, pero en etapas posteriores puede producir invasión profunda provocando dolor o disfagia. El curso clínico es insidioso, evolucionando durante meses o años. Dentro de las ubicaciones más prevalentes en mucosa oral, el COCE de lengua representa entre el 25% y el 40%, siendo el borde postero-lateral de la lengua la localización más común, pero se puede manifestar en cualquier lugar de la mucosa oral.
La incidencia mundial de cáncer oral es aproximadamente de 263,000 casos por año, con una incidencia especialmente elevada reportada en India, Taiwan, Hungría, Francia, Brasil, y parte de Sudáfrica, cabe destacar la variación excepcional que existe en mortalidad e incidencia debido principalmente a las diferencias de hábitos, educación y exactitud en los reportes. Por ejemplo, India ha sido citada junto a Sri Lanka y Pakistán como los países con más alta incidencia en el mundo con aproximadamente 100,000 casos por año (Neville y cols., 2015). Si hablamos de nuestra región, en América del Sur el cáncer de boca y faringe marcha quinto en el ranking en hombres y sexto en mujeres con su mayor incidencia en el Sudeste de Brasil, Uruguay y Argentina con aproximadamente 14,000 casosnuevos por año en Brasil en el año 2008 (Warnakulasuriya, 2009).
 Desórdenes potencialmente malignos [DPM]
Según la clasificación de tumores publicada por la Organización Mundial de la Salud [OMS] del año 2005, los tumores de la cavidad oral pueden ser tumores epiteliales malignos, benignos o lesiones epiteliales precursoras, junto a las cuales también se describen las condiciones precancerosas (Barnes y cols., 2005).
Recientemente, en un taller coordinado por el centro de colaboradores de la OMS en Reino Unido se discutieron estas terminologías, donde se recomendó el término “desorden potencialmente maligno” en lugar de “precanceroso” o “premaligno”, de esta forma el concepto transmite la idea de que no todas las lesiones y condiciones descritas bajo este término puede transformar en cáncer (Warnakulasuriya y cols., 2007). Entendiéndose como desorden potencialmente maligno aquel tejido morfológicamente alterado en el que es más probable que el cáncer ocurra que en su contraparte aparentemente normal. (Warnakulasuriya y cols., 2007). 
Los desórdenes potencialmente malignos pueden presentar distintos estados histopatológicos. La biopsia sigue siendo el procedimiento estándar para evaluar el grado de alteración del tejido. Esta es sometida a un examen microscópico diagnosticando una hiperqueratosis epitelial, hiperplasia, atrofia, displasia, carcinoma in situ o COCE superficial (Thompson, 2006). La displasia es un término histológico que define el cambio premaligno del epitelio, caracterizado por una combinación de alteraciones celulares y arquitectónicas, donde estos cambios son observados en una transición gradual hacia la malignidad (Sapp y cols., 2005). Tabla 1.
	Cambios arquitectónicos 
	Cambios celulares
	Estratificación epitelial irregular
Perdida de polaridad de las células basales
Hiperplasia de células basales
Papilas epiteliales en forma de gota
Aumento del número de figuras mitóticas
Mitosis superficiales anormales
Queratinización prematura en células simples (disqueratosis)
Presencia de perlas de queratina en las papilas epiteliales
	Variación anormal del tamaño nuclear (anisonucleosis)
Variación anormal de la forma nuclear (pleomorfismo nuclear)
Variación anormal del tamaño celular (anisocitosis)
Variación anormal de la forma celular (pleomorfismo celular)
Aumento de la relación núcleo/citoplasma
Aumento del tamaño nuclear
Figuras mitóticas atípicas
Aumento del número y tamaño de nucléolos�
Hipercromasia.
Tabla 1: Criterios usados en el diagnóstico de displasia.(Warnakulasuriya et al., 2008)
La magnitud de estas alteraciones determina la magnitud de una displasia, lo que nos lleva a una clasificación que se utiliza tradicionalmente por los patólogos en displasia leve, moderada y severa. La displasia leve se define como la perturbación de arquitectura limitada al tercio inferior del epitelio con atipia citológica, en la displasia moderada las alteraciones se extienden en el tercio medio del epitelio y en la displasia severa a través de más de dos tercios del epitelio en profundidad y con atipia citológica asociada, mientras que en el carcinoma in situ es el estadío más grave de la displasia epitelial, afecta a todo el espesor del epitelio, permaneciendo intacta la membrana basal epitelial, aquí la transformación maligna ha ocurrido, pero aún no está presente la invasión. (Warnakulasuriya y cols., 2008). Cuando el tejido conjuntivo adyacente ya está invadido por epitelio displásico, se considerar un carcinoma de células escamosas (Sapp y cols., 2005; Speight, 2007).
El consumo de tabaco y de alcohol se sabe que contribuyen sinérgicamente para riesgo de COCE � ADDIN EN.CITE ��(Leemans y cols., 2011; Tanaka y Ishigamori, 2011)�. Los factores de riesgo asociados a DPM son similares a los factores de riesgo para el COCE. Entre los DPM se encuentra la Leucoplasia, Eritroplasia, Queilitis actínica, Liquen Plano, Queratosis del paladar asociada a fumar invertido, entre otras (Warnakulasuriya y cols., 2007). 
La leucoplasia es la más común de las lesiones potencialmente malignas representando 85% (Mashberg y cols., 1973). La definición de leucoplasia fue definida en 1978 por la OMS como “Mancha o placa blanca que no puede ser eliminada por el raspado ni caracterizada clínica o histológicamente como ninguna otra enfermedad”. El término es estrictamente clínico y no implica una alteración específica de tejido histopatológico. La localización más frecuente de la leucoplasia es la mucosa retrocomisural, seguido del paladar duro, rebordes alveolares y lengua.
La eritroplasia se define como ''un parche rojo fuego que no puede ser caracterizada clínicamente o patológicamente como cualquier otra enfermedad definible" � ADDIN EN.CITE ��( Pindborg y cols., 1997; Dionne y cols., 2015)�. La tasa de transformación maligna es muy alta [varía del 14% al 50%], por lo que necesita ser tratada con prontitud � ADDIN EN.CITE ��(Reichart y Philipsen, 2005; van der Waal, 2010)�.
La queilitis actínica es un desorden potencialmente maligno del labio causado por la exposición a la radiación solar. Además, el consumo de tabaco, irritación de los labios, la mala higiene oral, y las prótesis desajustadas pueden desempeñar un papel en el desarrollo de la queilitis actínica (Yardimci y cols., 2014). Comúnmente se ve en el área de la superficie del labio inferior. Se presenta con eritema y edema en las primeras etapas de la enfermedad mientras que en las etapas más avanzadas se le agrega las fisuras lineales (Yardimci y cols., 2014).
El liquen plano es un desorden inmunopatológicoque puede afectar a la piel, mucosa oral, mucosa genital, el cuero cabelludo, y las uñas (Ismail y cols., 2007). Clínicamente se manifiesta en forma de lesiones reticulares blancas, placas o lesiones erosivas, con gran respuesta de linfocitos T en el tejido conjuntivo subyacente e inmediato (Sapp y cols., 2005). Las zonas más comúnmente afectadas son dorso de la lengua, la mucosa bucal y la encía (Ismail y cols., 2007).
Receptor del Factor de crecimiento epidérmico [EGFR]
El receptor del factor de crecimiento epidérmico es una proteína citoplasmática transmembrana perteneciente a la familia de receptores tirosina-quinasa HER (ErbB) codificado por el gen egfr localizado en el cromosoma 7p12-13. La familia HER comprende cuatro receptores: HER1 (EGFR o ErbB-1), HER2 (ErbB-2, Neu), HER3 (ErbB-3) y HER4 (ErbB-4).
	Los ligandos que han sido identificados para los receptores ErbB son: 
	HER 1
HER 2
HER 3
HER 4
	Factor de crecimiento epidérmico (EGF), Factor de crecimiento tumoral alfa (TGFá),Anfiregulina (AR), Betacelulina (BTC), Epiregulina (EPR), Factor de crecimiento ligado a heparina (HB-EGF). 
No hay ligando conocido.
Neuregulinas 1 y 2 (NRG1, NRG2).
Betacelulina (BTC), Epiregulina (EPR), Factor de crecimiento ligado a heparina (HB-EGF),Neuregulinas 3 y 4 (NRG3 y NRG4)
Tabla 2. Ligandos para los receptores ErbB (Normanno y cols.,2006)
En ausencia de ligandos, los receptores HER residen en la membrana de la célula de forma inactiva, distribuidos uniformemente por su superficie. En condiciones normales, estos receptores tienen muy pocas probabilidades de encontrarse en la superficie celular de forma aleatoria. En cualquier caso, cuando se encuentran en la superficie celular por azar tienen la capacidad de transfosforilarse, actividad que se ve rápidamente inhibida por la actividad fosfatasa basal de la célula. Una vez que el ligando se une al dominio extracelular, el receptor sufre un cambio conformacional, lo que permite la homodimerización o heterodimerización con otro receptor activado de la familia HER. Luego de la formación del dímero, aumenta la actividad quinasa intracelular a través de un efecto de proximidad, lo que resulta en la fosforilación de los residuos de tirosina en el dominio citoplásmico, que luego desencadena la cascada de transducción de señales (Mak y william, 2014). La ruta de señalización más conocida y mejor caracterizadade las iniciadas por el EGFR activado es la vía Ras/MAPK, que parece ser imprescindible para la proliferación celular mediada por EGF. Otra vía importante tras la activación del EGFR es la del PI3K (fosfatidil inositol 3 quinasa), la cual genera señales de supervivencia celular y previene la apoptosis (Lahera y cols., 2010).
La actividad EFGR tiene una función fisiología en el desarrollo del embrión, al estar encargado de la organogénesis de muchos órganos derivados del mesodermo y el ectodermo, tales como cerebro, corazón y pulmón. en el organismo adulto pierde este papel, aunque los receptores de ErbB están involucrados en el desarrollo de los ductos mamarios en la pubertad, la proliferación del lóbulo alveolar en el embarazo y la producción de leche en el postparto (Normanno y cols., 2006).
Hay condiciones en que EGFR se activa de manera patológica, una de ellas es que se manifieste un aumento en la expresión del receptor debido a la amplificación de genes o alteraciones transcripcionales, lo que permite que se encuentren con mayor facilidad con su ligando. El EGFR se expresa en células normales en niveles que van desde 20 000 hasta 200 000 copias por célula. Sin embargo, en células de tumores de origen epitelial como el de pulmón, cabeza y cuello, páncreas, ovario, colon, riñón, vejiga y en los gliomas, el EGFR está sobreexpresado y puede llegar a niveles 20 veces mayores que lo normal. También se ha demostrado que la sobreexpresión de EGFR se correlaciona con un peor pronóstico, mayor índice de proliferación, mayor capacidad invasiva y reducción de sobrevida. Otra forma son alteraciones moleculares que pueden sufrir los receptores, como mutaciones, generando una actividad incontrolada descontrolada de EGFR que está implicado en muchos factores del crecimiento tumoral, incluyendo la promoción de proliferación celular, la angiogénesis, la invasión, la metástasis y la supervivencia (Lahera y cols.,2010).
Es bien sabido que una sobre expresión de EGFR y un número anormal de copias de genes para EGFR, están asociados con un mal pronóstico de los pacientes con COCE (chung, 2006; temam, 2007). Además, el EGFR se ha visto implicado en la progresión de DPM a COCE. En un estudio reciente, los datos concluyeron que un aumento en el número de copias del gen de EGFR se asociaría con el desarrollo de COCE en lesiones potencialmente malignas que sobreexpresan EGFR, también los autores sugieren que los inhibidores de EGFR pueden prevenir el cáncer oral en pacientes con DPM que tienen un aumento de EGFR, pero faltan estudios estadísticamente significativos (Taoudi y cols., 2010).
En la actualidad EGFR es la única proteína para la cual hay intervenciones terapéuticas farmacológicas aprobadas por los organismos reguladores en todo el mundo en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello avanzado (Mak y William, 2014).
Terapia molecular dirigida en COCE y displasia 
 	 A pesar del tratamiento multidisciplinario con la cirugía, quimioterapia y la radiación, las tasas de supervivencia no han mejorado significativamente en los pacientes con cáncer oral. 
Alternativas terapéuticas novedosas a la terapia estándar han sido establecidas necesariamente para mejorar el pronóstico de los pacientes con cáncer oral avanzado. La terapia molecular es una modalidad de tratamiento que se dirige a moléculas y proteínas que se expresan de forma selectiva en el COCE. Estos incluyen factores de crecimiento y sus receptores, moléculas de transducción de señales, oncogenes, hormonas, moléculas relacionadas con la apoptosis, factores relacionados con la angiogénesis, así como inhibidores de la motilidad celular, la invasión y la proteólisis. varios ejemplos de moléculas dianas prometedoras en tratamiento del COCE incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico [EGFR], la ciclooxigenasa-2 [COX-2], de peroxisomas del receptor activado por el proliferador g [PPARg] y el receptor de progesterona (PR).
Las estrategias farmacológicas dirigidas a EGFR que se han aprobado para el tratamiento del cáncer incluyen el uso de anticuerpos y pequeñas moléculas inhibidoras del receptor tirosina quinasa [TKIs]. Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal Cetuximab mejora la supervivencia global cuando se agrega a la radioterapia para el tratamiento de COCE. En un ensayo clínico ramdomizado se llegó a la conclusión que en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello avanzado con altas dosis de radioterapia más Cetuximab promueve el control regional y reduce la morbilidad sin incrementar los efectos tóxicos asociados a la radioterapia de cabeza y cuello (Bonner y cols., 2006). Hay estudios que indican que el tratamiento con Cetuximab es bien tolerado por los pacientes a excepciones de algunas irritaciones cutáneas (Acevedo-henao., 2012). En cuanto a las terapias moleculares para las displasias, un estudio recientes en que se utilizó solo Cetuximab para el tratamiento de displasias del tracto aerodigestivo se llegó a la conclusión que el uso de Cetuximab puede resultar en una resolución clínica e histológica significativa, duradera y completa de las displasias moderadas a severas en pacientes de alto riesgo a desarrollar neoplasias, pero que estos resultados merecen una investigación con mayor poder estadístico (Khan y cols., 2016).
2. HIPÓTESIS.
 Existe un incremento en la expresión de EGFR tanto en displasias como en COCE comparado a lo observado en mucosa normal��. 
3. OBJETIVO GENERAL.
	 Evaluar la expresión de EGFR en biopsias de pacientes con diagnósticos de displasia y carcinoma de células escamosas de la cavidad oral.��
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Seleccionar casos retrospectivos de biopsias de pacientes con diagnóstico tanto de displasia como de COCE en los últimos 40 años provenientes del servicio de anatomía patológica de la FOUCH.
Evaluar, a través de inmunohistoquímica, la expresión de EGFR en las muestras de los pacientes atendidos en Santiago de Chile.�
Asociar los niveles de expresión de EGFR según el grado de displasia.
Comparar los resultados obtenidos en la población de Chile con muestras originadas de Brasil y EEUU a �fin de determinar los porcentajes de pacientes positivos para este anticuerpo en cada etnia.�
 5. METODOLOGÍA.	
5.1 Selección de muestra
Muestras retrospectivas: Se seleccionarán muestras incluidas en parafina y fijadas con formalina, obtenidas del LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA DE LA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE CHILE, �con diagnóstico histopatológico de displasia y carcinoma de células escamosas de mucosa oral. La evaluación histopatológica se evaluará independientemente por dos especialistas en patología oral (Dr. Cristóbal Araya y Dr. Ricardo Fernández-Ramires)��, en las secciones previamente teñidas con hematoxilina-eosina. Las muestras con displasia de clasificaran en alto y bajo grado.
Muestras provenientes de Brasil: Se utilizarán un total de 20 muestras provenientes de la Facultad de odontología ��de la Universidad Federal de Pelotas, Brasil. 
Matriz de tejidos: es un tissue microarray (TMA) modelo OR601b obtenido desde Estados Unidos (http://www.biomax.us/tissue-arrays/Oral_Cavity/OR601b) y disponible comercialmente, el cual contiene tejido de cáncer oral escamoso con tejido adyacente normal de lengua, que incluye TNM, etapa clínica y grado patológico. Se incluyen 60 casos de los cuales hay 49 carcinomas orales escamosos de lengua en distintos estadíos, 1 muestra control de marcaje (feocromocitoma) y tejidos adyacentes normales (Fig. 1). Los datos obtenidos de esta matriz ayudarán a complementar los resultados obtenidos en las muestras de Chile y de Brasil, ya que solamente las muestras norteamericanas cuentan con información clínica completa (TNM).
Figura 1. Esquema de TMA 06 OR601b (http://www.biomax.us/tissue-arrays/Oral_Cavity/OR601b)
 Inmunohistoquímica.
Secciones de 4 micrómetros se cortarán y colocarán en un portaobjeto de vidrio. Se desparafinarán en xileno y rehidratarán en alcohol descendente, se lavarántres veces con agua destilada y dos veces en buffer fosfato salino [PBS]. Para la recuperación antigénica las secciones se colocarán en tampón citrato de sodio (pH 6) durante 44 minutos en una olla a presión y luego se lavarán tres veces en agua destilada y dos veces con PBS durante 5 minutos, en cámara húmeda. Se desbloqueará la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 10% en metanol por 15 minutos en cámara húmeda. Se realizará el bloqueo de las proteínas con Serum Horse RTU UNIVERSAL por 20 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. Se incubará el anticuerpo primario [Anticuerpo Novocastra EGFR clone 384] durante 30 minutos en cámara húmeda dentro de estufa a 37°C, se lavarán dos veces con PBS durante 5 minutos y se incubarán con el anticuerpo secundario. Se lavarán dos veces con PBS durante 5 minutos y se agregará ABC por 20 minutos en cámara húmeda en estufa a 37°C. Se revelarán en DAB por 5 minutos a temperatura ambiente. Se realizará una tinción nuclear con hematoxilina de harris por 30 segundos y lavado con agua corriente. Un deeping para azular en bórax y deshidratarán en alcoholes ascendentes, finalmente se montarán en un medio hidrófobo.
 Análisis de datos
Histológico: Se basará en el sistema de inmunoreactividad de Remmele y Stegner (IRS score) el cual es calculado por la combinación de cantidad de puntos (porcentaje de células teñidas) con la intensidad de la tinción. La cantidad de células teñidas va de 0 a 4 y la intensidad va de 0 a 3. El método de cálculo se describe en la tabla 3.
Tabla 3. Sistema de inmunoreactividad IRS modificado de Remmele W and Stegner HE. (1987) y Kaemmerer D et al. Int J Clin Exp Pathol 2012;5(3): 187-94.
Estadístico: El cruce de datos se realizará mediante el método del Chi-cuadrado y ANOVA.
 Limitaciones del estudio
El método semi cuantitativo de análisis de inmunoreatividad IRS es subjetivo en cuanto a la evaluación de la intensidad de la tinción. 
 Resultados esperados
Se espera encontrar indicios, a partir de las muestras norteamericanas, de que EGFR podría estar asociado a una mayor agresividad de algunos COCE y de que podría servir de cribado para que estos pacientes reciban terapias anti EGFR.
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7. Anexos 
Anexo 1: acta de aprobación de proyecto 
Anexo 2: Protocolo de Inmunohistoquímica
Desparafinar e hidratar de las muestras:
Xilol 10 minutos
Xilol 10 minutos
Alcohol de 100º 10 minutos
Alcohol de 100º 10 minutos
Alcohol de 95º 10 minutos
Alcohol de 95º 10 minutos
Alcohol de 70º 10 minutos
Tres lavados en agua destilada.
Dos lavados en PBS.
Recuperación antigénica en buffer citrato ph 6 en olla a presión eléctrica marca oster por 44 minutos.
Retirar de la olla rápidamente.
Tres lavados en agua destilada.
Dos lavados en PBS de 5 minutos cada uno.
Desbloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrogeno al 10% en metanol por 15 minutos en cámara húmeda.
Lavado en PBS 5 minutos.
Lavado en PBS 5 minutos.
Bloqueo proteínas con Serum Horse Vectastain RTU UNIVERSAL por 20 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda.
Anticuerpo primario por 30 minutos en cámara húmeda a 37ºC en estufa. (60uml por placa. Dilución 1:100)
Lavado en PBS 5 minutos.
Lavado en PBS 5 minutos.
Anticuerpo secundario por 20 minutos en cámara húmeda a 37ºC en estufa. (azul)
Lavado en PBS 5 minutos.
Lavado en PBS 5 minutos.
ABC por 20 minutos en cámara húmeda a 37ºC en estufa.
Lavado en PBS 5 minutos.
Lavado en PBS 5 minutos.
Revelado en DAB por 5 minutos a temperatura ambiente.
Lavado en agua corriente por 5 minutos.
Tinción nuclear con Hematoxilina de Harris por 30 segundos.
Lavado en agua corriente.
Azular en bórax un deeping.
Lavar en agua corriente.
Deshidratar en alcoholes ascendentes.
Alcohol de 70º 10 deeping.
Alcohol de 95º 10 deeping.
Alcohol de 95º 10 deeping.
Alcohol de 100º 10 deeping.
Alcohol de 100º 10 deeping.
Xilol.
Xilol
Medio de montaje hidrófobo.
�ok
�REVISAR BIBLIOGRAFIA, HAY VARIOS CON MINUSCULA
�ESCRIBIR CON CURSIVA Y LA PRIMERA CON MAYÚSCULA “Cetuximab”
� Ok cuadro, falta cerrar los paréntesis.
�Van a evaluar mucosa normal? La otra alternativa es que se compare en ellos y se apueste a que uno es mayor que el otro, aparentemente a eso apuntan los objetivos específicos
�Si, vamos a comprar con la mucosa normal que viene en el TMA.
� Comparados con mucosa normal??? 
Determinar asociación entre marcación y diagnóstico? O solo van a evaluar?
�Vamos evaluar y, según los resultados, permitirán asociar o no con otras variables
� no es de población chilena, son los de pacientes de la facultad, saben si solo son chilenos?
�Según el grado de displasia
�Cuando se seleccionaron estos casos? Que diagnosticos tiene estos casos, son displasias y COCE también?
Los casos de Brasil son del servicio de aquí. Los de EEUU, son comerciales, por lo que la referencia acompaña todos los datos extras.
�Sugiero eliminar etnia y comparar entre muestras de distintos países o algo así, o pueden asegurar que son grupos étnicos los de acá de Chile o de EEUU o de Brasil?
Nos permitimos mantener etinias porque son mayoría. Cuanto a las muestras de Brasil, son todos de aquí, por ejemplo.
�mayúscula
�si son especialistas en patología BMF faltaría uno pues Ricardo es doctorado pero tengo entendido que no es anátomo-patólogo que es distinto.
�No es relevante la observacion
�Especificar selección y si serán también revisados acá? Si no mencionar nombre de anatomo patólogo que revisará los casos en Brasil.
�Son casos ya revisados por Cristobal.
�Será analizada en conjunto con que? Se compararán los niveles de marcación y se extrapolan resultados???
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