REPLICAÇÃO AULA

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REPLICAÇÃO DO DNA
A REPLICAÇÃO DO DNA É 
SEMICONSERVATIVA
n A replicação do DNA é semiconservativa: Watson e Crick
propuseram que uma fita é complementar à outra. As
regras do pareamento de bases indicam que uma fita
serve de molde para que a fita “filha” seja sintetizada.
Modelos propostos para a replicação do DNA
EXPERIMENTO DE MESELSON-STAHL (1957)
-Células de E.coli crescidas por várias
gerações em meio cuja única
fonte de nitrogênio = NH4Cl,
contendo 15N.
-As céls crescidas em 15N foram
transferidas para um novo meio
contendo apenas 14N e
cresceram até que a população
dobrasse.
-Novamente as céls se duplicaram em
meio contendo 14N.
.
A replicação começa em uma origem e 
usualmente é bidirecional
John Cairns
Cresceu E. coli em meio 
contendo timidina marcada com 
trítio (3H) ® DNA radioativo.
DNA foi isolado e espalhado 
sobre um emulsão fotográfica 
para produzir uma imagem da 
molécula de DNA. 
O DNA radioativo isolado de 
céls durante a replicação 
mostraram um “loop” extra ®
Formação de 2 fitas filhas, cada 
uma complementar a fita 
parental.
As 2 fitas são replicadas ao mesmo tempo (novas fitas em 
vermelho).
A replicação começa em uma origem e 
usualmente é bidirecional
REPLICON
4 É a unidade de DNA onde um evento de replicação ocorre. Inclui 
elementos reguladores: 
Origem de replicação (ori) + Região terminadora (ter)
4 Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
4 O genoma de uma célula procariótica constitui um único replicon
4 Cada cromossomo eucariótico constitui vários replicons e todos são 
ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
Replicação em Procariotos
Replicação em Eucariotos
Síntese do DNA ocorre na direção 5’ →3’
Fragmentos de Okazaki
DNA POLIMERASES
n Arthur Kornberg e cols (1956) – DNA pol I de E. coli (1 subunidade polipepitídica)
n A DNA polimerase necessita de:
a) MOLDE
b) INICIADOR (3’ OH livre na extremidade do iniciador)
n Processividade = número de nucleotídeos adicionados antes da DNA pol se dissociar da fita
molde.
n E. coli possui 5 DNA polimerases (I, II , III, IV e V)
n I e II (1970) - envolvidas no reparo e atividade polimerásica, respectivamente
n IV e V (1999) - reparo não usual
Arthur Kornberg
DNA POLIMERASE I
n Primeira enzima DIRIGIDA POR MOLDE a ser descoberta
n Não é a enzima que replica a maior parte do DNA em procariotos.
Entretanto, ela tem um papel crítico na REPLICAÇÃO, e também no
REPARO DO DNA.
n Monômero de 103 kDa e catalisa a adição passo a passo de unidades de nts
na EXTREMIDADE 3‘-OH de uma cadeia de DNA.
n A DNA polimerase I requer os quatro nts (dATP, dGTP, dTTP e dCTP) e
magnésio para a síntese do DNA.
n Apresenta domínios de POLIMERIZAÇÃO e REVISÃO separados
Reação catalizada pela DNA polimerase
Comparação das DNA POLIMERASEs de E. coli
DNA Polimerases
BACTÉRIAS
Enzima Função principal
DNA Pol I (PolA) Replicação do DNA e reparo
DNA Pol II Reparo de DNA
DNA Pol III Principal enzima da replicação do DNA
DNA Pol IV Reparo do DNA
DNA Pol V Reparo do DNA
MAMÍFEROS
Enzima Função principal Localização
DNA Pol a Replicação da fita complemetar Núcleo
DNA Pol e Reparo de DNA Núcleo
DNA Pol d Replicação da fita molde Núcleo
DNA Pol b Reparo de DNA Núcleo
DNA Pol g Síntese de novo de DNA Mitocôndria
DNA Polimerases de Bactéria
ALTO GRAU DE FIDELIDADE DURANTE A REPLICAÇÃO
n Pares de bases padrão A/T e
G/C possuem geometrias
semelhantes e o sítio da enzima
é ajustado para acomodá-las.
n A geometria dos pares de bases
incorretos pode excluí-los do
sítio ativo. A DNA polI possui
um centro ativo que exclui tais
parceiros incorretos de
pareamento
ALTO GRAU DE FIDELIDADE
n Em E. coli ® 1 nt incorreto para cada
109 a 1010 nts incorporados
n Cromossomo = 4,6 x 106 nt
n 1 erro a cada 1.000 a 10.0000
replicações
n FATORES GEOMÉTRICOS
n CAPACIDADE DE REVISÃO DA DNA POL
n MECANISMOS DE REPARO DO DNA
DNA POLIMERASE I
ATIVIDADE REVISORA DA 
DNA POLIMERASE I
Base despareada (C*)C-A impede a
translocação da enzima para o sítio
seguinte.
n DNA POL I desliza para trás, corrige o
erro com a atividade exonucleásica
3'→5' e resume a sua atividade
polimerásica 5'→3'
DNA POLIMERASE III
n Sintetiza a maior parte do novo DNA.
n Alta processividade, potência catalítica e fidelidade.
DNA POLIMERASE III
A REPLICAÇÃO DO DNA REQUER MUITAS ENZIMAS 
E FATORES PROTÉICOS
n DNA POL + 20 ou mais proteínas = Sistema DNA Replicase ou Replissomo
n HELICASES - separação das 2 fitas.
- Movem ao longo do DNA e separam as fitas (gasto ATP)
n TOPOISOMERASES - aliviam o estresse topológico gerado pela separação das
fitas.
n PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO DNA (SSB) - associam-se às fitas simples
estabilizando-as.
n PRIMASES - síntese dos iniciadores (PRIMERS)
n LIGASES - selam os cortes na fita descontínua.
A REPLICAÇÃO DO DNA OCORRE EM TRÊS ETAPAS
n INICIAÇÃO
n ELONGAÇÃO
n TERMINAÇÃO
PROTEÍNAS NECESSÁRIAS PARA INICIAR A 
REPLICAÇÃO EM E. coli
INICIAÇÃO
n OriC- 245 pb:
n 3 repetições de 9 pb ricas em AT
n 4 repetições de 9 pb de seqüência consenso (TTATCCACA)
n 9 enzimas ou proteínas diferentes participam da iniciação
oriC de E. coli
® ~ 20 moléculas de DnaA, associadas a 1 
ATP, ligam-se às 4 repetições de 9 pb.
® O DNA é desenrolado ao redor desse 
complexo
® As 3 repetições de 13 pb são desnaturadas 
seqüencialmente
® Hexâmeros da proteína DnaB ligam-se a 
cada fita com a ajuda da proteína DnaC. 
A atividade da DnaB helicase desenrola 
ainda mais o DNA, preparando a 
iniciação e a síntese do DNA.
INICIAÇÃO
SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKASAKI
-Fita descontínua ® direção 
oposta ao movimento da 
forquilha de replicação.
-A PRIMASE sintetiza um
RNA iniciador para o
fragmento de okazaki.
-Cada iniciador é estendido
pela DNA pol III.
-O fragmento se estende até o
“primer” do próximo
fragmento de Okazaki.
SÍNTESE DO DNA NAS FITAS LÍDER E DESCONTÍNUA
Os primers de RNA na fita descontínua são removidos pela atividade exonuleásica 5’® 3’ da 
DNA polI e substítuídos por DNA pela mesma enzima. O “nick” é selado pela DNA ligase.
ETAPA FINAL DA SÍNTESE DA FITA DESCONTÍNUA
PROTEÍNAS NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DE E. coli
MECANISMO DE REAÇÃO DA DNA LIGASE
n Ativação do fosfato 5’ no corte.
Um grupo AMP é transferido a
um resíduo de Lys na Enzima e
então ao fosfato 5’ no corte
n 3 o grupo OH 3’ ataca esse fosfato
e desloca AMP, produzindo uma
ligação fosfodiéster par selar o
corte.
n DNA ligase de vírus e eucariotos
usam ATP e liberam pirofosfato e
de E. coli usam NAD e liberam
NMN na etapa 1
TERMINAÇÃO
-Seqüências Ter (20 pb) 
posicionadas no cromossomo em 2 
agregados com orientações 
opostas. Sítio de ligação da 
proteína Tus (terminus utilization 
substance)
-Tus + Ter param a forquilha de 
replicação. 
Apenas 1 complexo Tus + Ter 
funcionam em cada ciclo de 
replicação (o primeiro complexo 
Tus + Ter encontrado por qualquer 
1 das forquilhas de replicação).
TERMINAÇÃO
n A replicação do DNA separa as
forquilhas de replicação opostas e
deixa os cromossomos sintetizados
unidos como círculos interligados.
n A separação dos mesmos requer a
ação das TOPOISOMERASES.
n Em E. coli top IV (tipo II), quebra
transitoriamente ambas as fitas de
DNA de um dos cromossomos e
permite que o outro passe através
da quebra.
REPLICAÇÃO DO DNA
EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS
EM EUCARIOTOS A REPLICAÇÃO É RESTRITA A 
UMA PARTE DO CICLO CELULAR
The four successive phases of a 
standard eucaryotic cell cycle. During 
the G1, S, and G2 phases, the cell 
grows continuously. During M phasegrowth stops, the nucleus divides, and 
the cell divides in two. DNA 
replication is confined to the part of 
interphase known as S phase. G1 is 
the gap between M phase and S phase; 
G2 is the gap between S phase and M 
phase 
REPLICAÇÃO EM EUCARITOS
n ARS (“autonomously replicating sequences”) ou replicadores – origem de
replicação em leveduras, seqüências conservadas de aproximadamente 150
pb.
n 16 cromossomos de leveduras ~ 400 replicadores
n INICIAÇÃO: Complexo de Reconhecimento da Origem (ORC) – proteína
com várias subunidades que se liga a várias seqs dentro do replicador.
n ORC interage e é regulada por várias proteínas envolvidas no ciclo celular
n Replicação bidirecional
n Velocidade de replicação (50 nts/seg) é 1/20 procariotos
n Humanos – replicação bidirecional em vários origens (espaçadas entre
30.000 e 300.000 pb)
REPLICAÇÃO EM EUCARITOS
DNA pol α
múltiplas subunidades (1 com atividade iniciadora e a maior com atividade polimerásica; não
possui atividade 3’→ 5’ exo e não é adequada para manter fidelidade do processo).
Atua na síntese de iniciadores curtos e dos fragmentos de Okazaki.
DNA pol δ
Atividade exo 3’→5’ e síntese das 2 fitas de DNA (similar a DNA pol III de E. coli).
DNA pol ε
Substitui DNA pol δ em algumas situações, como reparo do DNA. Pode funcionar como a DNA
pol I de bactérias removendo iniciadores na fita atrasada.
RPA- proteína de ligação ao DNA de fita simples semelhante a SSB da E. coli. Facilita a
montagem dos complexos ativos de replicação.
Terminação: telômeros na extremidade
UM GRANDE COMPLEXO DE 
PROTEÍNAS SE LIGA À 
ORIGEM DE REPLICAÇÃO 
NOS EUCARIOTOS
TELOMERASETELOMERASE
nn Síntese da fita descontínua Síntese da fita descontínua → necessita de “primers”.necessita de “primers”.
nn Quando a forquilha de replicação encontra a extremidade de um cromossomo linear Quando a forquilha de replicação encontra a extremidade de um cromossomo linear 
não há espaço para produzir o primer necessário para iniciar o último fragmento de não há espaço para produzir o primer necessário para iniciar o último fragmento de 
Okazaki.Okazaki.
nn Solução: seq nt na extremidades dos cromossomos que são incorporadas nos Solução: seq nt na extremidades dos cromossomos que são incorporadas nos 
telomeros que atraem a enzima TELOMERASE.telomeros que atraem a enzima TELOMERASE.
nn Seq DNA nos telomeros: repetições de pequenas seqs que contêm um bloco de Seq DNA nos telomeros: repetições de pequenas seqs que contêm um bloco de 
nucleotídeos G. nucleotídeos G. 
nn Em humanos GGGTTA, por aproximadamente 10.000 nucleotídeos.Em humanos GGGTTA, por aproximadamente 10.000 nucleotídeos.
nn A TELOMERASE reconhece estas seqs e elonga o DNA na direção 5′A TELOMERASE reconhece estas seqs e elonga o DNA na direção 5′--3′. Ela sintetiza a 3′. Ela sintetiza a 
nova cópia utilizando um molde de RNA que é parte da própria enzima.nova cópia utilizando um molde de RNA que é parte da própria enzima.
TELOMERASETELOMERASE
Telomerase is a protein–RNA complex 
that carries an RNA template for 
synthesizing a repeating, G-rich 
telomere DNA sequence. Only the part 
of the telomerase protein homologous 
to reverse transcriptase is shown here 
(green). A reverse transcriptase is a 
special form of polymerase enzyme 
that uses an RNA template to make a 
DNA strand; telomerase is unique in 
carrying its own RNA template with it 
at all times. (Modified from J. Lingner 
and T.R. Cech, Curr. Opin. Genet. Dev.
8:226–232, 1998.) 
Alça D replicação dos DNAs mitocôndriais