DNA completo RESUMO

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RESUMO: Ácidos Nucléicos
HISTORIA DO DNA
 Em 1869, através de células de pus, Fritz Miescher descobriu que havia um composto ácido juntamente com fosfato (porção básica protéica) no núcleo. Chamou de nucleína. 
 Posteriormente, Mendel (criador da genética moderna) utilizou a estática para chegar a uma conclusão determinada. Por meio do experimento da ervilha, Mendel percebeu que havia algo que era transmitido aos descendentes e que esse algo tinha duas unidades.
 T.H Morgan reconheceu na célula o cromossomo, descobrindo essa estrutura genética. Mais tarde, em 1928, Frederick Griffith utilizou a bactéria Streptococcus pneumoniae em um experimento: ele dispunha de um tipo de bactéria patogênica (que causava a morte em ratos) e bactérias não patogênicas (que não matavam). Ao aquecer as patogênicas (matando-as) e inseri-las juntamente com as não patogênicas em ratos, percebeu que esses animais morriam de pneumonia. Logo, havia algo que era liberado pela bactéria morta que transformava a bactéria não patogênica. Deu-se origem aí o princípio transformante.
 Esse princípio foi utilizado novamente em 1944 Oswald Avery e seus colaboradores utilizaram novamente as bactérias da pneumonia. Trataram esses microorganismos com proteases, amilases, e ribonucleases, percebendo que em todos os casos, a bactéria não patogênica ainda assim se tornava patogênica. Porém, ao serem tratada com rnases (enzimas que degradam o DNA), a transformação não mais ocorreu. Logo, chegou-se a conclusão de que o DNA estava relacionado à transmissão da mensagem geneticamente herdável da bactéria infectada.
 No fim da década de 40, Erwin Chargaff descobriu que as quatro bases do DNA ocorrem em proporções variadas em diferentes organismos e que certas bases tem quantidades proporcionalmente relacionadas. Através de seu estudo chegou a conclusões como: a composição das bases do DNA geralmente variam de uma espécie para a outra e que a quantidade de adenina é sempre igual a de timina, enquanto a de citosina é sempre igual a de guanina, chegando a regra de Chargaff: A + G = T + C.
 Já no início da década de 50, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, iluminando cristais de DNA com raios X, perceberam que o DNA tinha um padrão de difração desses raios característico em formato de cruz (ou X). A partir disso, deduziram que o DNA tinha uma estrutura helicoidal com duas periodicidades. Também descobriram que por fora dessa estrutura de dupla hélice ficavam os açucares e fosfatos.
 Mas foi somente em 1953 que o DNA foi realmente desvendado, quando Watson e Crick postularam um modelo tridimensional da molécula de DNA com todos os dados já existentes e descobrindo também novos dados a partir desses. Em tal modelo, o DNA é formado por uma dupla hélice. Entre as bases, há as chamadas ligações de hidrogênio. Entre a adenina e a timina são formadas 2, entre a citosina e a guanina, 3. Decidiram também que as fitas de DNA deveriam ser antiparalelas, isto é, suas ligações 5’, 3’ fosfodiésteres deveriam ocorrer em sentidos opostos. Foi determinado também que as fitas eram complementares entre si.
É de importância citar também, que a dupla hélice é mantida unida devido as pontes de hidrogênio entre as bases e às interações de empilhamento das bases. 
Eles supuseram também que, devido a complementaridade das fitas do DNA, a estrutura poderia facilmente ser replicada através da separação das duas fitas e do uso de cada uma delas como molde para a síntese de uma nova fita. 
ESTRUTURA
Os ácidos nucléicos (DNA e RNA) são formados por nucleotídeos, responsáveis por transportar a informação genética. Dizemos que os ácidos nucléicos armazenam e transmitem as informações genéticas para as próximas gerações.
 É de importante citação também que a seqüência do DNA que contém a informação necessária para a síntese de um produto biológico funcional, isto é, uma proteína ou RNA é chamado de GENE. 
 Os nucleotídeos são compostos pelas bases nitrogenadas, um açúcar (pentose) e um grupamento fosfato (Ac. Fosfórico). A molécula sem o grupo fosfato é chamado de nucleosídeo. As bases podem ser purínicas (A ou G) ou pirimidínicas (C ou T/U).
 Os nucleotídeos sucessivos são unidos por forças covalentes, isto é, “pontes” de fosfato, o que chamamos de ligações fosfodiéster. Tais ligações ocorrem entre o grupamento fosfato de um nucleotídeo e o grupamento pentose do outro. 
 Os grupos hidroxilas dos resíduos de açucares formam ligações de hidrogênio com a água. Já os grupos fosfatos (hidrofóbicos) estão completamente ionizados e consequentemente carregados negativamente (isso gera uma força de repulsão entre as cadeias).
 Entre as bases, ocorrem as ligações de hidrogênio. São ligações fracas, porém suficientemente fortes. A importância dessas ligações é permitir que a dupla hélice do DNA seja desfeita para codificação de uma nova fita a partir da primeira. Há também interações hidrofóbicas entre as bases aminadas (essas interações hidrofóbicas forçam as bases a se esconderam dentro da dupla hélice).
 As cadeias são ANTIPARALELAS, ou seja, uma cadeia tem o carbono 5’ da pentose livre em uma extremidade e o 3’ livre na outra enquanto a outra tem essa ordem invertida, já que foi montada no sentido contrário. 
 Deve-se citar também que, durante a replicação, pode ocorrer o que chamamos de pareamento irregular. Se esse pareamento irregular não for corrigido, a informação errada é perpetuada e consequentemente a síntese protéica é comprometida (esse pareamento pode ser devido a alguma forma tautomérica, por exemplo).
 É de importância citar também que as bases ficam perpendiculares ao eixo helicoidal. 
 Certas seqüências do DNA adotam estruturas não muito usuais. Isso ocorre em casos de palíndromos, por exemplo. Trata-se de repetições invertidas na seqüência das bases, ocorrendo em simetria dupla nas duas fitas do DNA. Essas seqüências são autocomplementares em cada uma das fitas, formando estruturas como grampos ou cruzes. Pode ocorrer também o modelo de espelho invertido. Nesse caso, a repetição invertida ocorre na mesma fita do DNA. 
 Não podemos deixar de citar que o DNA pode ser desnaturado. Assim como as proteínas, quando é aquecido a uma temperatura muito alta, rompendo as ligações de hidrogênio ou em pH não ideal. No caso do aquecimento do ácido nucléico, chamamos de hipercromia. Quanto mais pares de bases C-G tiverem mais tempo demorará a desnaturar, pois entre esses pares há 3 ligações de hidrogênio. Quando resfriamos o ácido nucléico, chamamos de Hipocromia. 
Já uma desnaturação com cloreto de sódio, por exemplo, torna-se mais difícil, pois o íon sódio anula o fosfato, aproximando mais as bases e tornando mais difícil a dissociação, necessitando, consequentemente de mais temperatura. 
 A renaturação do DNA é um processo fácil desde que um segmento de dupla hélice de uma dúzia ou mais de resíduos ainda unam as duas fitas. Neste caso, quando as condições de temperatura ou pH voltam ao normal, os segmentos desenrolados se enrolam novamente. Porém, caso essas fitas estejam completamente separadas, é preciso esperar que se encontrem aleatoriamente e formem um segmento curto de dupla hélice complementar. Depois, as duas fitas fecham como um zíper, formando a dupla hélice. 
HIBRIDIZAÇÃO DO DNA
 A capacidade de duas fitas de DNA de parear uma com a outra permite detectar seqüências de DNA semelhantes. É o que usamos, por exemplo, no teste de paternidade (juntamente com a eletroforese). 
 Nesse processo, primeiramente desnaturamos duas amostras de DNA completamente por aquecimento. Em seguida, mistura-se essas duas amostras, resfriando essa nova solução lentamente. Com isso, as fitas de DNA tendem a se associar com as suas complementares normais, se anelando e formando os duplex. Porém, se os dois DNAs tiverem seqüências semelhantes significantemente, tenderão a formar duplex parciais ou híbridos. Quanto maior a semelhança das seqüências das amostras, maior é o número de híbridos formados. 
 Normalmente, usam-se isótopos radioativos (marcandoum dos DNAS) para medir a formação de híbridos. 
 Essa técnica pode ser realizada também para detectar uma seqüência de DNA específica ou gene na presença de muitas outras seqüências se já tivermos uma fita complementar adequada (o que chamamos de HIBRIDIZAÇÃO IN SITU, utilizada, por exemplo, para a detecção de vírus). Além disso, esse processo pode ocorrer entre diferentes espécies, como, por exemplo, o homem e o camundongo. 
CLONAGEM DO DNA
 Quando falamos em clonagem, estamos falando em fazer cópias idênticas. Na clonagem específica do DNA temos a separação de um gene específico ou seqüência de DNA do seu cromossomo maior, a sua ligação a uma molécula de DNA transportadora pequena e depois a replicação desse DNA modificado, pelo aumento no número de células e a criação de múltiplas cópias em cada célula do DNA clonado.
 Na clonagem do DNA, temos cinco procedimentos gerais. O primeiro deles é cortar o DNA em uma seqüência específica usando as endonucleases de restrição (enzimas) que funcionam como tesouras moleculares para essas seqüências específicas. 
 Depois, deve-se unir covalentemente dois fragmentos de DNA. Esse procedimento é feito pela DNA ligase. 
 No terceiro procedimento, deve-se selecionar uma pequena molécula de DNA capaz de auto-reaplicação. Segmentos de DNA a serem clonados podem se unir a vetores de clonagem como DNAs de plasmídeos e de vírus. Temos, nesse caso, um DNA RECOMBINANTE. 
 Posteriormente, o DNA recombinante deve ser transferido do tubo de ensaio para uma célula hospedeira, para que possa ser replicado. 
 O quinto e último passo seria selecionar as células hospedeiras que tenham o DNA recombinante. 
 Resumidamente, o processo de clonagem acontece primeiramente com a clivagem de um cromossomo eucarioto (separando os fragmentos) e a consequente clivagem de um plasmídeo com auxílio das endonucleases de restrição. Depois, com a DNA ligase, formar o vetor recombinante ou DNA recombinante. E por fim, infectar a célula hospedeira com o plasmídeo. 
 É importante citarmos que as endonucleases de restrição só clivam seqüências específicas, deixando extremidades coesivas (com fitas simples projetadas) e extremidades cegas. 
 Os plasmídeos são inseridos nas células bacterianas através de processos como a transformação (choque térmico) e a eletroporação. No primeiro, a célula sofre um choque térmico de uma temperatura muito baixa (0 ºC numa solução de cloreto de cálcio) para um temperatura entre 37 e 43ºC. Com isso, a membrana da célula abre, permitindo a entrada do plasmídeo. Depois, é resfriada novamente a 0ºC, fechando a membrana. 
 Já no segundo processo, dando-se um pulso na bactéria, a membrana se torna permeável a transição de grandes moléculas. 
 Para selecionar as células que incorporaram o plasmídeo, utilizamos a estratégia da resistência ao antibiótico. O plasmídeo inserido apresenta resistência a determinado antibiótico e logo, as células transformadas pelo plasmídeo irão ter resistência a esse antibiótico específico, enquanto as que não foram transformadas não terão.
 Outra forma de realizar a clonagem é utilizando bacteriófagos. Utilizamos a endonuclease de restrição para retirar uma parte do DNA que é desnecessária para o empacotamento. Com a DNA ligase, adicionamos fragmentos de DNAs estranhos, formando DNAs recombinantes. Depois, realiza-se o empacotamento in vitro, isso é, os DNAs recombinantes resultantes podem ser empacotados em partículas virais, adicionando-os a extratos brutos de células bacterianas, contendo todas as proteínas necessárias para formar um fago completo. 
 Em caso de segmentos de DNA muito grandes, utilizamos a técnica de cromossomo artificial de bactéria. A introdução na bactéria hospedeira de grandes DNAS circulares, por exemplo, se dá através da eletroporação. A bactéria usada nos processos utilizando BAG (nome em inglês), sofrem mutações que comprometem a estrutura da parede bacteriana, facilitando a incorporação desses grandes fragmentos de DNA.
 É possível, através da hibridização com um segmento de DNA particular, determinar um clone. Nesse processo, a sonda de DNA radioativa hibridiza com o DNA complementar, sendo revelado por auto-radiografia. Depois que as colônias marcadas são identificadas, as colônias correspondentes na placa Agar original podem ser utilizadas como fonte do DNA clonado em estudos posteriores. 
MICROARRANJOS 
 Nessa técnica, o DNA é posicionado sobre uma superfície sólida (normalmente uma lâmina), utilizando-se luz UV para fixar o DNA na lâmina. Depois, o microarranjo pode ser encontrado através de outros ácidos nucléicos marcados com fluorescência. 
 Um exemplo seria o mRNA isolado de uma célula sendo convertido para sondas de cDNA pela transcriptase reversa usando os dNTPS marcados com fluorescência. Os cDNAs fluorescentes anelam as seqüência complementares nos microarranjos. Após retirar a sonda que não hibridizou, cada ponto fluorescente representa um gene que está sendo expresso na amostra (expressão alta = vermelho, expressão baixa = verde).
GENES E CROMOSSOMOS
 Sabemos que o DNA é uma das maiores macromoléculas das células, e que são empacotados em cromossomos. Um cromossomo pode conter milhares de genes.
 Podemos dizer que os genes são responsáveis por codificar proteínas (cadeias polipeptídicas) e RNAs. Primeiramente, acreditava-se que o DNA estava relacionado somente a codificação de proteínas (interação DNA - Proteína). Mas tarde, relacionamos a codificação de uma cadeia polipeptídica a um gene. Isso porque, há proteínas com duas ou mais espécies de cadeias polipeptídicas diferentes, sendo codificadas por genes diferentes e com sequência de aminoácidos diferente. Além disso, os genes são capazes de codificar rRNAs e tRNAs (RNA ribossomal e RNA transportador).
 Nos eucariotos, o empacotamento do DNA está diretamente relacionado as histonas, que são carregadas positivamente. Elas se ligam com o DNA através de ligações eletrostáticas (uma vez que o DNA tem carga negativa, se liga com a carga positiva das histonas) e formam o que chamamos de Nucleossoma. 
 A formação da cromatina do DNA se dá a partir dos nucleossomas. Há a eucromatina e a heterocromatina. A primeira se relaciona aos genes ativos enquanto a segunda se relaciona aos genes inativos.
 Quando falamos do empacotamento do DNA, é importante falarmos das histonas acetilases, que adicionam um grupamento acetila às cadeias, bloqueando a carga e dando maior fluidez ao processo. 
OBS: Pseudogenes – Genes que foram preservados a ponto de virar inativos mas que podem ser usados e reativados se necessário. 
BIOSÍNTESE DO DNA (REPLICAÇÃO)
 A replicação do DNA tem características únicas. A primeira que devemos falar é o fato da replicação ser semiconservativa. Isso é, durante a replicação, cada fita de DNA serve de molde para a síntese de outra, formando duas moléculas de DNA, ambas formadas por uma fita velha e uma fita nova (como se mantém a fita velha, chamamos de semiconservativa).
 Deve-se saber também que as fitas do DNA são replicadas simultaneamente e que a síntese é bidirecional. Há pontos chamados forquilhas de replicação, onde o DNA parental está sendo desenrolado e as fitas separadas rapidamente replicadas.
 É importante sabermos também que a síntese se dá no sentido 5’->3’ e que é semidescontínua. Quando dizemos que é semidescontínua, dizemos que uma das fitas é sintetizada continuamente enquanto a síntese da outra se dá de forma pausada. Vemos isso da seguinte forma: uma fita líder ou contínua é sintetizada no sentido 5’->3’, na mesma direção do movimento da forquilha de replicação e outra fita descontínua ou atrasada é sintetizada no sentido 5’->3’ porém na direção oposta à direção do movimento da forquilha de replicação.
 A degradação do DNA se dá pelas nucleases ou DNAses, que se ativam na ausência do nucleotídeo. Podem ser exonucleases ou endonucleases. As primeiras degradam o DNA somente a partir de uma extremidade, operando somente em uma direção e removendo nucleotídeos apenasde uma extremidade (5’ ou 3’). Já as endonucleases podem começar a degradação de qualquer lugar, reduzindo o DNA em pedaços cadê vez menores.
 A enzima relacionada a síntese do DNA é a DNA polimerase (atuando na presença do nucleotídeo). As DNA polimerases necessitam de iniciadores, isto é, primers (feitos pela enzima Primase). A enzima reconhece o primer e assim inicia a codificação. O primer é específico para um segmento específico do DNA.
 Durante a replicação podem ocorrer erros ao acaso gerando mutações. Mutações, quando acumuladas podem levar ao processo de apoptose da célula, isso é, o suicídio da célula. As mutações podem gerar também, por exemplo, câncer. 
 Para correção de tais erros, temos alguns mecanismos de reparo para situações específicas. Podemos citar, por exemplo, o reparo de despareamentos: a fita molde é metilada para distingui-las das fitas recém sintetizadas. Com isso, após o processo, a correção dos despareamentos com base na fita mãe é possibilitada.
 Há também o reparo por excisão de base. Há enzimas chamadas DNA glicosilases que reconhecem lesões particularmente comuns no DNA, removendo a base afetada e fazendo uma clivagem. 
 Não podemos deixar de citar o reparo por excisão de nucleotídeos, onde uma enzima com subunidades múltiplas hidrolisa duas ligações fosfodiésteres, uma em qualquer lado da lesão. 
 Por último temos o reparo direto, isto é, sem a remoção da base ou do nucleotídeo.Um exemplo: a fotorreativação dos dímeros ciclobutano e pirimidina promovida pela DNA fotoliase. 
OBS: Pirofosfato – forma como são eliminados os fosfatos.
APLICAÇÕES DO CONCEITO DE REPLICAÇÃO
 PCR
 O método do PCR é utilizado para amplificar um determinado fragmento de DNA. Composto por três etapas: A primeira delas consiste na separação das fitas através da desnaturação por aquecimento da região a ser amplificada. Depois, os primers devem ser hibridizados, ocorrendo o anelamento dos mesmos. Por fim, a temperatura deve-se elevar de novo a fim de permitir a atuação da DNA polimerase (É adicionada ciclo a ciclo pois não resiste às bruscas mudanças de temperatura). 
 O PCR é usado para teste de paternidade, detecção de DNA de agentes infecciosos, diagnóstico molecular, translocação (se tiver amplificação é porque houve translocação, caso contrário não), detecção de genes de interesse, dentre outros. 
 A detecção do produto do PCR se dá através da realização da eletroforese.
 Há também o PCR em tempo real, onde a medição da quantidade do produto é analisada ciclo a ciclo e é uma técnica bem mais sensível que a outra. 
 ELETROFORESE
 Serve para separar moléculas por peso molecular/carga (se for proteína deve ser desnaturada com detergente SDS). Trata-se do movimento de partículas dispersas em um fluido sob influência de um campo elétrico uniforme. Como o DNA é negativo, tende a migrar para o pólo positivo. 
 Podemos visualizar os resultados utilizando brometo de etídio, por exemplo. No resultado, vemos que fragmentos mais leves se deslocam mais enquanto os mais pesados deslocam bem menos. 
 SEQUENCIAMENTO DO DNA
 Os métodos de seqüenciamento de DNA estão relacionados a obter sequências de DNA. No início da década de 80, surgiu um método relativamente simples que consistia na adição de reagentes químicos, quebrando o DNA em partes e a posterior análise por eletroforese. Havia necessidade de se fazer a marcação radioativa da molécula.
 Alguns anos depois surgiu uma nova técnica, a qual chamamos de seqüenciamento de Sanger. Trata-se da incorporação aleatória de nucleotídeos modificados (chamados dideoxi e didesoxi) sem a hidroxila na posição 3’, fazendo com que o seqüenciamento seja interrompido e gerando diversas sequências de diversos tamanhos. No método atual, é necessária a utilização de fluorescência para marcar o ddNTP (nucleotídeo modificado). No modelo antigo, era o primer que era marcado, sendo necessárias quatro reações para cada base.
 Para realizar essa reação, os reagentes devem ser levados até o PCR, onde ocorrerá a amplificação das sequências de DNA, utilizando somente um primer. Posteriormente, as diversas sequências já contendo os ddNTPs devem ser levadas até um seqüenciador de DNA. Nesse seqüenciador, ocorre o que chamamos de eletroforese capilar, emitindo um laser que determina o comprimento de onda (cor) emitido pelo didesoxi, além é claro, dos diferentes tamanhos. No final desse processo, é gerado um gráfico chamado eletroferograma, onde os picos e agudos representam as bandas e quanto mais altos, mais qualidade tem (e maior será a probabilidade de que a base registrada seja correta).
 Outra técnica que deve ser citada é a pirosequenciamento. Em tal, utilizamos enzimas (luciferase, ATP e sulfurilase) e substratos (adenosina 5’, fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato é liberado quando um nucleotídeo é incorporado, gerando luz detectável. Logo, quando um novo nucleotídeo é acrescentado pela DNA polimerase, pirofosfato é gerado, produzindo ATP. Esse ATP vai gerar a conversão enzimática da luciferase, produzindo fótons (luz). Na análise do gráfico do resultado, devemos saber que as intensidades dos picos são proporcionais aos números de nucleotídeos incorporados.
 Não devemos deixar de citar os métodos mais recentes, como por exemplo o método nanoporo. Esse método utilizado nanoporos que são compostos por dois eletrodos que registram a corrente elétrica perpendicular ao DNA conforme o DNA passa através do poro. Cada base cria sua assinatura eletrônica, podendo assim ser identificadas (já que são estruturalmente e quimicamente diferentes). 
 Temos também o método de íon torrent, que registra uma mudança de pH quando próton H+ é liberado quando ocorre a incorporação do nucleotídeo. 
TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO
 
 Dogma Central da Vida
 Começaremos pela transcrição. Trata-se da síntese de RNA a partir de uma única fita de DNA (fita molde 3’->5’), sempre no sentido 5’->3’ e sempre igual a outra fita do DNA duplex (5’->3’). Segue as regras de complementaridade e antiparalelismo, exceto pelo uso da uracil (U) pareando com a timina (T) e adenina (A). 
 A transcrição é realizada pela RNA polimerase, que tem diversas funções como, por exemplo, reconhecer e se ligar a sequências específicas do DNA, desnaturar o DNA, expondo as sequências de nucleotídeos a ser copiada, restaurar o DNA, terminar a síntese do RNA (podem estar acompanhadas de proteínas), etc. Existem RNAs polimerases que transcrevem diferentes RNAs, como RNAm (mensageiro), RNAt (transportador), etc.
 Além disso, associadas a essas RNAs polimerases temos proteínas acessórias, as quais chamamos de fatores de transcrição, auxiliando no início desse processo. São esses fatores de transcrição que irão identificar no gene as sequências do DNA em que a RNA polimerase deve se ligar para iniciar o processo de transcrição.
 As sequências reguladoras da transcrição podem ser divididas em dois tipos: promotores e elementos reforçadores. Essas sequências são um padrão de bases encontrado em todos os genes que tem uma função determinada dependendo do fator/enzima/proteína que o reconhecem e se ligam a ele. 
 Os promotores se ligam ao código e sinalizam a outros agentes o local de ação. Já os elementos reforçadores se ligam ao código e modulam a atividade de outros agentes. As regiões em que isso ocorre, por estarem em todos os genes são chamadas de região de consenso. 
 O início da transcrição se dá com a ligação de um fator ao TATA box (elemento que determina onde a síntese deve ser iniciada). Essa ligação vai sinalizar para que outros elementos liguem entre si e outros elementos do promotor. Quando todos os fatores estão em seus devidos lugares, a RNA polimerase é recebida, formando o complexo de iniciação da transcrição. A RNA polimerase abre as fitas de DNA e coloca a primeira base. A transcrição dá inicio quando outros fatores se ligam aos elementos reforçadores,interagindo com o complexo de iniciação da transcrição. É importante termos em mente que há uma região chamada região promotora, a qual se ligarão os fatores que permitirão ou não a transcrição.
 Em seguida, temos o alongamento, que consiste no aumento da cadeia de RNA, sendo necessários outros fatores de transcrição. A RNA polimerase se modifica. A medida que a cadeia de RNA é sintetizada, a parte anterior e aberta do DNA é fechada enquanto a parte posterior fechada é aberta pela chamada “bolha de transição”, formada no início da mesma. A RNA polimerase nessa etapa é também responsável pela correção de erros na sequência do RNA. Ao término da transcrição, há enzimas que se ligam ao RNA, clivando-o para formar a extremidade 3’.
 Durante a transcrição, pode ocorrer o que chamamos de palíndromos (sequências repetidas ou invertidas) que formam uma alça durante o processo. Há uma proteína ao final do processo de transcrição que atua como uma RNA-DNA helicase (separando essa alça): rho. 
 Após a transcrição, ocorre o processamento do DNA, isto é, a transformação do RNA em um RNA maduro. Nesse processamento é que ocorrem diferentes processos, como o splicing do RNA. 
 No processo de splicing temos os éxons (sequências que permanecem no RNA maduro e consequentemente estão relacionadas a codificação de proteínas) e os íntrons (sequências que não estão no RNA maduro e não estão relacionados a codificação de proteínas). Logo, o processo de splicing é a retirada dos íntrons e a junção dos éxons. Os íntrons são deformados para ser eliminados e os éxons são unidos por uma estrutura chamada de lariat. Com a separação de íntrons e éxons temos a quebra de ligações fosfodiésteres e depois a formação de novas na união dos éxons. 
 Ainda sobre o processamento de RNA (principalmente RNA mensageiro), podem ocorrer outros processos como o da adição de uma cauda poli-A, formada por 200 resíduos de adenina na sua extremidade 3’. É importante, pois facilita o transporte do RNA para o citoplasma e ao ser lentamente degrada estabiliza o RNA em tal meio. 
OBS: Nos procariotos, o DNA está disperso no protoplasma e a transcrição ocorre ao longo do DNA (policistrônica). Nos eucariotos, o DNA está no núcleo e a transcrição acontece em pontos diferentes do DNA. 
OBS2: Eritropoetina/Doping/Doping Genético 
 A eritropoetina é um hormônio que regula a produção de células vermelhas. Graças a técnicas de recombinação gênica, é possível, em células de mamíferos, inserir o gene responsável pela síntese da Eritropoetina humana, formando tal hormônio. Com isso, pode ser usado para tratamento de diversas formas de anemia, tratamentos pós-cirurgicos em que é necessário sangue, tratamento de hepatite, etc. 
 O doping é a administração de uma droga ilícita no corpo, gerando aumento na capacidade física, menos fadiga, etc. Já o doping genético é a introdução de genes diretamente para as células-alvos (núcleo das células, geral), onde esse DNA é transcrito e posteriormente traduzido, formando determinada proteína. Com isso, podemos aumentar a produção de uma determinada proteína funcional. Isso vem sendo usado por atletas para aumentar a capacidade física. Um exemplo seria o aumento da capacidade respiratória através do aumento de hemácias. 
 Agora falemos da tradução. Nesse processo, o RNAm sintetiza uma proteína, isto é, a “linguagem” dos nucleotídeos é traduzida para a “linguagem” dos aminoácidos. Envolvidos nesse processo temos o próprio RNAm (mensageiro), que contém o código do gene; o RNAt (transportador) que possui um anticódon que se liga a um códon específico do RNAm, carregando um aminoácido. Em outras palavras, une o mundo do ácido nucléico com o mundo dos aminoácidos (a leitura é complementar e antiparalela, ou seja, o códon do RNAm é lido no sentido 5->3’ por um anticódon pareado em orientação invertida 3’->5’); RNAr (ribossomal), que faz parte do ribossomo e está relacionado a enzima que catalisa a ligação entre aminoácidos adjacentes. 
 Falando do RNA transportador, o mesmo é formado por um aminoácido unido por meio de uma ligação covalente à extremidade 3’. Na parte oposta, há uma sequência de nucleotídeos chamada de anticódon. Esses anticódons são complementares aos códons do RNA mensageiro. Logo, o RNA mensageiro específica uma sequência de aminoácidos por meio do RNA transportador. Afirmamos então que o DNA transportador tem como função transferir os aminoácidos corretos para suas posições ao longo do molde de RNA mensageiro, para que sejam adicionados a cadeia polipeptídica crescente. 
 O local de ocorrência da tradução é o ribossomo, com auxílio de proteínas enzimáticas e RNA ribossomal. O RNAr tem como função auxiliar a ligação do RNAm e do RNAt com o ribossomo. O ribossomo liga-se ao códon de iniciação AUG (que codifica o aminoácido metionina) no RNAm e depois liga a sua superfície ao RNAt, de modo que haja um pareamento entre RNAm e RNAt. O ribossomo percorre o RNAm no sentido 5’->3’ códon por códon, traduzindo em aminoácidos através do anticódon do RNAt. A ligação entre o códon e o anticódon coloca o aminoácido apropriado na posição seguinte do ribossomo, gerando condições para a formação de uma ligação peptídica com a ponta carboxila e a cadeia polipeptídica crescente. 
 Nesse processo, o ribossomo disponibiliza uma enzima que impede a formação de ligações peptídicas covalentes entre aminoácidos adjacentes, o que resulta em um polipeptídio crescente. Quando o ribossomo chega a um códon de terminação, a tradução acaba. Os chamados “RF”s são os responsáveis por reconhecer o códon de terminação. O grupamento amina fica na extremidade 5’ do RNAm enquanto o grupamento carboxila fica na extremidade 3’.
 Sobre o código genético, temos algumas características que são importantes. A primeira delas é fato do código genético ser degenerado, isto é, o mesmo aminoácido pode ser codificado por diferentes códons. Além disso, não há sobreposição na leitura do código, ou seja, cada códon codifica um aminoácido. 
 Não se deve deixar de dizer também que o código genético é extremamente conservado, isto é, igual em todos os seres. Deve-se citar também que o pareamento do terceiro nucleotídeo não é perfeito e não segue as regras de complementaridade, isto é, é oscilante. 
 Quando falamos de tradução, temos algumas questões a serem tratadas. Uma delas seria como o aminoácido correto é ligado ao DNA transportador. Esse trabalho estaria associado a uma enzima específica, a tRNA-aminoacil sintetases. Essa enzima reconhece o anticódon e carrega o aminoácido correto. O aminoácido deve se encaixar no sítio sintético da enzima e não no sítio de edição. 
 O controle da tradução é dado por diferentes mecanismos. O primeiro deles seria o fato de que o aminoácido correto se associa e dissocia do RNAt com muito mais facilidade. Já um errado, de associa muito mais lentamente, embora também dissocie rápido. 
 Além disso, o fato do aminoácido se encaixar no sítio sintético da enzima e não no sítio de edição acaba funcionando como um mecanismo de peneira dupla. Os aminoácidos que são menores e encaixam no sítio de edição são descartados e os que são maiores e não encaixam no sítio sintético também.
 Porém, não acontece a verificação de aminoácido na tradução, somente no momento da aminoacilação do RNAt.
 Quando estamos falando de tradução, é importante explicarmos algumas diferentes entre a tradução em procariotos e eucariotos. Nos procariotos vemos RNA policistrônico e monocistrônico. Temos também a sequência Shine-Delgarno, que se trata de uma sequência conservada de 6 nucleotídeos. Esta sequência pode parear com algumas bases do rRNA 16S da sub-unidade menor do ribossomo procarioto. A interação entre os dois RNAs é fundamental para a eficiência do início da tradução e ainda oferece uma oportunidade para regular a tradução, pro exemplo, através de proteínas que se ligam ao RBS, bloqueando-o. Além disso, nos procariotos, a metionina é formilada. 
 Já nos eucariotos, o RNA é monocistrônico, formado porinteração entre proteínas que se ligam a cauda poli-A e proteínas do complexo de iniciação. Não possui o Shine-Delgarno. Há também o conceito de consenso de Kosak, cujo qual é uma hipótese de que o ribossomo realiza uma espécie de “scanning”. 
 Não se deve deixar dizer que em organismos como as bactérias, por exemplo, o mRNA é traduzido pelos ribossomos enquanto ela ainda está sendo transcrito do DNA pro RNA. Isso acontece porque o RNAm não precisa ser transportado do núcleo para o citoplasma para encontrar os ribossomos. 
 
OBS: Há um aminoácido chamado de Puromycin capaz de inibir a tradução.
 É também de grande importância falarmos do endereçamento protéico. Afinal, depois de pronta, a proteína pode ser enviada para a mitocôndria, para o cloroplasto e retículo endoplasmático. O que diz para onde a proteína é endereçada é uma sequência sinalizadora. Essa sequência está localizada no aminoterminal de um peptídeo recém sintetizado. Na maioria dos casos, a capacidade de direcionamento de sequências sinalizadoras particulares tem sido confirmada pela sequência sinalizadora de uma proteína com uma segunda proteína. Nesse caso, a proteína seria endereçada para o local onde a primeira proteína é geralmente encontrada. 
 Além disso, antes que um polipeptídio inicie sua vida funcional como proteína, pode passar pelo que chamamos de mudanças pós-traducionais. Essas modificações podem ser de vários tipos, desde a clivagem em unidades polipeptídicas menores, passando pela combinação com outros peptídeos para gerar uma proteína maior até a adição de cadeias laterais de carboidratos. Outros exemplos seriam a formação das pontes dissulfeto e a glicosilação da proteína. 
 Essas modificações pós-traducionais são necessários, por exemplo, para produzir o dobramento apropriado na proteína final ou para estabilizar sua estrutura. A cadeia recém traduzida é dobrada e associada a uma estrutura tridimensional específica determinada pela própria sequência de aminoácidos. 
 Outras modificações seriam a adição de fosfato (modificação química) ou até mesmo a clivagem para retirar um grupamento aminoterminal utilizado para endereçamento protéico. 
 Não devemos deixar de falar sobre a degradação das proteínas. No caso, essa degradação acontece quando temos proteínas anormais (defeituosas, com inserção de aminoácidos incorretos, etc.), indesejadas ou de meia vida caracteristicamente curta e permite a reciclagem de aminoácidos. 
 Normalmente, essa degradação depende de ATP. Nos eucariotos, por exemplo, temos a ubiquitina auxiliando o processo de degradação. Ela se liga covalente a proteína por meio de uma via depende de ATP. Dessa forma, faz com que a proteína seja identificada e degradada. 
REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA
 Todas as células de um organismo contêm o mesmo conteúdo genético. A diferença entre células distintas ou entre condições fisiológicas diferentes são os genes que são expressos. A regulação da expressão gênica é essencial para a célula fazer melhor uso da energia disponível, dado o alto custo da síntese de proteínas.
 O processo do aumento da expressão de um gene é chamado de indução enquanto o processo que diminui a expressão de um determinado gene é chamado de repressão. Um exemplo de indução seriam as enzimas de reparo do DNA, que são induzidas em resposta ao alto nível de lesões no DNA. Um exemplo de repressão seria a presença de amplos suprimentos de triptofano que gera a repressão de genes das enzimas que catalisam a biossíntese de triptofano nas bactérias. 
 O controle de expressão na iniciação da transcrição relaciona diretamente a RNA polimerase e o DNA. O que liga ambos são os promotores. A regulação da iniciação da transcrição impõe alterações em como a RNA polimerase interage com certos promotores. É importante sabermos que a sequência dos promotores varia.
 São três tipos de proteínas que regulam a iniciação da transcrição a partir da RNA polimerase: os fatores de especificidade, que alteram a especificidade da RNA polimerase em relação a algum promotor; os repressores que impedem a integração da RNA polimerase com o promotor; os ativadores que aumentam a interação entre enzima e promotor. 
 A regulação por meio de proteína repressora é chamada de regulação negativa. Essa regulação está relacionada a um sinal externo e pode se dar de dois tipos: o repressor ligado ao DNA impede a transcrição com a ausência de algum sinal externo. Ao receber esse sinal, o repressor sai e a transcrição é permitida. No segundo caso, o repressor está ligado sob a presença de um sinal. Quando esse sinal sai, a transcrição se inicia. 
 A regulação por meio da proteína ativadora se chama regulação positiva. Também está associado a um sinal externo, ocorrendo de duas formas distintas: na primeira, o ativador está ligado ao DNA, permitindo a ocorrência da transcrição. Quando recebe um sinal externo, se desliga do DNA, impedindo a transcrição. No outro caso, o ativador liga-se na presença do sinal e só para a transcrição quando esse sinal sai. 
 Quando falamos de regulação, devemos citar o exemplo da regulação em bactérias com base na beta galactosidade. Para dar esse exemplo, é necessário sabermos o conceito de Operon: trata-se do agrupamento de genes e o promotor, mais as sequências adicionais que funcionam juntos na regulação. 
 Sobre o operon da beta galactosidade, descrevemos da seguinte forma: Quando há glicose e lactose no meio, a bactéria tem tal nutriente como fonte de energia preferencial, já que não precisará ser quebrada. Quando há glicose e lactose no meio, toda a glicose é usada. Só então que a lactose é usada. A glicose gera uma via de sinalização que inibe a formação do ligante amp cíclico. Quando não há mais glicose, existe uma sinalização que formará o ligante. Esse ligante se liga a uma proteína (CRP) formando uma proteína ativadora que se conecta com o promotor e permite a transcrição do gene. Isso porque é importante que os genes expressados a partir daí sejam os necessários para a quebra de lactose. Trata-se de uma regulação positiva.
 Há também o caso em que uma proteína repressora se liga ao inibidor, impedindo a transcrição. Quando há lactose no meio, essa é capaz de agir como ligante, interagindo com a proteína repressora e fazendo com que ela solte do DNA. Isso permite que a RNA polimerase transcreva os genes para formação da beta galactose que irá quebrar a lactose em glicose e galactose. Se não houver a lactose, esses genes NÃO precisarão ser expressos. Trata-se de uma regulação negativa. 
 Outro tipo de regulação é o do operon da síntese de triptofano. Nessa regulação, se há triptofano meio, não há necessidade de sintetizar as enzimas que sintetizam triptofano, pois o que está no meio é usado e a transcrição ocorre. Se não há triptofano no meio, a transcrição é interrompida até que seja sintetizado mais. Esse mecanismo é chamado de atenuação. 
 
 
 Nas células eucarióticas, os níveis regulatórios são muito maiores. A compactação do DNA é muito grande, logo o DNA não fica acessível a RNA polimerase, então a predominância é de regulação positiva, de proteínas que abram o DNA para permitir a ação da RNA polimerase. O DNA está condensado, o que é importante, pois é necessário permitir um remodelamento da cromatina para que a RNA polimerase possa agir. Nos eucariotos há fatores que impedem até mesmo a tradução. 
 Para reconhecer as sequências, as proteínas devem ter acesso ao DNA. A cromatina é possível de ser regulada para tal. Uma das formas é as variantes de histonas, que tem algumas modificações pós traducionais que permitem com que a cromatina fique mais aberta ou fechada. Um exemplo é a histona H3.3, tem menor afinidade pelo DNA, logo o DNA fica mais solto e as sequências de DNA ficam mais disponíveis para os fatores da transcrição. 
 Outra forma de modelar a cromatina é a metilação de citosinas e guaninas no DNA. Nesse caso, observamos as Ilhas CPG (citosina, fosfato e guanina) que ficam em regiões promotoras e servem comosinais para metilação e repressão da transcrição. 
 A terceira é a modificação de histonas. As histonas possuem uma cauda n terminal que fica fora do nucleossomo e não participa da interação histona-histona. Essa cauda pode sofrer modificações pós traducionais como metilação, acetilação, etc., e essas modificações, dependendo de qual aminoácido sofre modificação, gera ou ativação ou repressão da transcrição. Exemplo: acetilação de histonas. Nesse caso, as histonas, que tem carga positiva (tendo afinidade com o DNA que é negativa), têm algumas dessas cargas são neutralizadas, fazendo com que as histonas fiquem menos positivas, tendo menos afinidade com o DNA, deixando-o mais solto e ativando a transcrição. 
 Há também os fatores de transcrição (necessitam de vias de sinalização) que, ligados ao DNA, são capazes de regular a transcrição gênica. Os fatores de transcrição são ativados por proteínas que passam informações uma a uma (cascata de sinalização). Dois exemplos: hormônios esteróides, que são apolares, atravessando a membrana e chegando ao núcleo com facilidade. Com isso, se ligam a uma proteína receptora que se liga diretamente ao DNA, havendo o remodelamento da cromatina. A partir daí, a transcrição é ativada. 
 Além disso, há casos onde há uma sinalização extracelular, que vai interagir com um receptor de membrana, ativando proteínas que ativam fatores de transcrição (como o NF-KB). Ele é regulado pelo I-KB, que ao ser ativado fosforila NF-KB. Com isso, há sinalização para que essa proteína seja degradada. A partir dessa degradação, o NF-KB vai expor o sinal de localização nuclear, vai entrar no núcleo a ativar a transcrição. 
 Não podemos deixar de citar a regulação pós-transcricional (depois da transcrição). Um exemplo é o splicing que retira os íntrons e une os éxons. O splicing alternativo, no entanto, consiste em remover éxons e incluir íntrons para ter diferentes proteínas na tradução. 
 O RNA pode ser degradado (RNA de referência). Há a escolha de uma das fitas de RNA (quando há dupla fita no citoplasma da célula – relacionado do micro RNA) por uma enzima, que vai procurar um RNAm que tenha uma sequência complementar àquela que está na proteína. O RNAm que possuir uma sequência complementar ou parcialmente complementar pode ser degradado ou a tradução pode ser interrompida, respectivamente.
 Isso gera implicações em várias patologias, como por exemplo o câncer (células que adquirem modificações genéticas e se replicam, foge de sinais supressores, foge do sistema imune, tem estabilidade genômica, resiste a morte celular, modifica toda bioenergética da célula para satisfazer suas necessidades). Exemplo: c-Myc (formado através da recombinação entre cromossomos, sendo expresso de uma forma muito maior).