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* Proteínas em alimentos Adriana Seixas Bromatologia * Proteínas Compostos poliméricos complexos, formados por moléculas orgânicas, que estão presentes em toda a matéria viva. Grego proteios = que tem primazia = fundamentais Funções biológicas Contráteis Estruturais Biocatalizadores Hormonais Transferência Reserva Proteção * Aminoácidos Unidades estruturais das proteínas. Característica da proteína ↕ soma das características dos aminoácidos constituintes * Aminoácidos Representação da fórmula geral dos aas. Perde H+ em pH neutro Recebe H+ em pH neutro São ionizáveis – apresentam característica ácido-básica * Tabela dos aminoácidos * Aminoácidos Anfólitos Se comportam tanto como ácido como base. Diferentes estados de ionização. Curva de titulação de um aminoácido típico. * Propriedades ácido-básicas pH neutro Íon dipolar ou zwitterion Grupos -amino e -carboxílico ionizados é um composto químico eletricamente neutro neutrostas * Propriedades ácido-básicas Ponto isoelétrico pH no qual o íon dipolar é eletricamente neutro Pka1 – pH onde [ COO-] = [COOH] Pka2 – pH onde [NH3+] = [NH2] Os aas que apresentam grupos R ionizáveis apresentam valores de pK correspondente a dissociação desses grupos * Ionização de um aminoácido * Classificação de acordo com a cadeia lateral - APOLARES * Classificação de acordo com a cadeia lateral – POLARE E NEUTRA * Classificação de acordo com a cadeia lateral – AROMÁTICA * Classificação de acordo com a cadeia lateral – POSITIVOS * Classificação de acordo com a cadeia lateral – NEGATIVOS * Isomeria óptica * Estereoisomeria * Ligação peptídica Uma ligação peptídica é uma ligação química que ocorre entre dois aminoácidos quando o grupo carboxila de uma molécula reage com o grupo amina de outra molécula, liberando uma molécula de água ( H2O ). * O AMINOÁCIDO CISTEINA GERALMENTE APARECE AOS PARES NAS PROTEÍNAS, FORMANDO PONTES DISSULFETO QUE ESTABILIZAM A ESTRUTURA TERCIÁRIA DE PROTEÍNAS. * Papel em doenças de origem alimentar Botulismo Toxina botulínica Encefalopatias espongiformes Prions Doença da vaca louca - bovinos Scrapie - ovinos Creutzfeld - Jacob - humanos * Presença de proteínas na dieta Quantidade e qualidade Compostas por 21 aminoácidos (selenocisteína) Teor e proporção de aminoácidos essenciais aminoácidos essenciais não são produzidos pelo organismo Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Valina * Proteína alimentar Aquelas que apresentam fácil digestão, são atóxicas, adequadas no aspecto nutricional, funcionalmente utilizáveis em produtos alimentícios, disponíveis em abundância e cultiváveis por agricultura sustentável. Principais fontes: Leite Carnes Ovos Cereais Leguminosas Oleaginosas * Proteínas Simples Compostas apenas por aminoácidos (aas) Conjugadas Porção protéica + porção não protéica Derivadas Hidrólise ácida ou enzimática Aminoácidos Grupo prostético lipídeo, carboidrato,composto inorgânico * Proteínas conjugadas GLICOPROTEÍNA * Proteínas Derivadas Compostos formados a partir de proteínas simple e conjugadas. Proteínas derivadas primárias Desnaturadas Proteínas derivadas secundárias Digestão hidrolítica da molécula peptídica. * * PROTEÍNAS NOS ALIMENTOS * * Propriedades das proteínas Preferências alimentares X atributos sensoriais (textura, sabor, cor, aparência) Papel das proteínas nos alimentos. Diversos alimentos processados são produtos de espuma ou emulsão. Sistemas dispersos e instáveis – substância anfifílica na interface entre as fases. * Propriedades emulsificantes Alimentos naturais e processados: Leite Gema do ovo Manteiga Margarina Salsichas Bolos São produtos do tipo emulsão – papel importante das proteínas Índice de atividade emulsificante Mede a estabilidade de uma emulsão * Emulsão Emulsão é um sistema heterogêneo que consiste em um líquido imiscível, completamente difuso em outro na forma de gotículas com diâmetro superior a 0,1 m. As emulsões são classificadas como: Emulsão do tipo óleo em água gotículas de óleo dispersas na fase aquosa Exemplo: maionese, leite, emulsões cárneas e sopas. Na emulsão do tipo água em óleo gotículas de água dispersas na fase oleosa Exemplo: manteiga e margarina. * Emulsão Para que uma emulsão se torne estável, é necessário um agente emulsificante. é definido como qualquer substância capaz de ajudar a formação de uma mistura estável de duas substâncias anteriormente imiscíveis, como por exemplo, óleo e água. As proteínas podem atuar como emulsificantes iônicos naturais. Por serem moléculas anfifílicas, as proteínas migram espontaneamente para a interface da emulsão do tipo óleo em água. A caseína do leite é a proteína mais utilizada como emulsificante. * Propriedades espumantes Espuma – fase contínua aquosa Fase gasosa dispersa Produtos do tipo espuma Cremes batidos, merengues, suflês, musses, marshmallows. Proteínas ajudam na formação e estabilização da fase dispersa aquosa – agentes ativos de superfície Película fina e resistente na interface gás-líquido, bolhas de gás são incorporadas. * Espuma As espumas alimentícias podem ser definidas como uma dispersão de glóbulos de gás, separados por uma suspensão de proteínas que reduz a tensão superficial entre o ar e o líquido, facilitando a deformação do líquido e a formação de filmes estruturais em volta das gotas de ar, prendendo-as e formando bolhas. A capacidade de uma proteína em formar espuma refere-se à expansão de volume da dispersão proteica com a incorporação de ar por batimento ou agitação. * Fixação de aroma Proteínas são inodoras. Podem ligar-se a compostos de aroma e mudar as propriedades de alimentos. Proteínas de sementes oleaginosas carreiam odores indesejáveis Oxidação de ácidos graxos compromete uso * Viscosidade Aceitação de alimentos semi-sólidos ou líquidos depende da viscosidade. Molhos Sopas Bebidas Viscosidade – forma e tamanho das moléculas proteícas Viscosidade das proteínas Interação proteína-solvente Tamanho Forma Volume hidrodinâmico Flexibilidade molecular * Gelificação Gel é uma fase intermediária entre sólido e líquido. Géis protéicos de alimentos Aquecimento de uma solução protéica moderadamente concentrada Desnaturação Estado pró-gel Formação de uma rede proteica * Texturização Tranformação de uma proteína do estado globular para o estado fibroso. Propriedades esperadas para proteínas texturizadas: Mastigabilidade Elasticidade Maciez Suculência * DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS * Elementos Analisados CARBONO ou NITROGÊNIO Grupos Analisados AMINOÁCIDOS E LIGACÕES PEPTÍDICAS * * ANÁLISES ELEMENTARES ANÁLISE DE CARBONO Digestão mais fácil do que para o nitrogênio; Menores erros no resultado: maior quantidade em relação ao nitrogênio; Fator de correção mais constante que para o nitrogênio; Dificuldade: separar os carbonos pertencentes à proteína dos carbonos provenientes de outros componentes. * Fração nitrogenada Determinação do conteúdo de proteína bruta do alimento. Fontes de nitrogênio Protídeos Aminoácidos Ac. nucléicos Sais de amônio Nitratos Bases púricas * Análise de nitrogênio nas proteínas * Fatores de Conversão Específicos para cada Alimento Trigo: 5,70; Leite: 6,38; Gelatina: 5,55. * MÉTODO DE KJELDAHL Determinação através do “N” total 1883: Kjeldahl (Dinamarca) Proteínas em grãos * Determinação do N orgânico total N protéico e não protéico orgânico Maioria dos alimentos: N não protéico representamuito pouco no total. Nitrogênio medido / proteína estimada Depende do tipo de amostra. * Variações nos alimentos Trigo Variedade; Condições de crescimento; Quantidade e tipo de fertilizante utilizado. * PROCEDIMENTO Três etapas: Digestão: o nitrogênio orgânico é convertido em amônio (NH4+), e os componentes orgânicos em CO2, H2O etc. Destilação: o gás amônia é liberado e recolhido em uma solução receptora. Titulação: determinação da quantidade de amônia (NH3) recolhida na solução receptora. * 1. Aquecimento da amostra com ácido sulfúrico (H2SO4) Digestão: carbono e hidrogênio oxidados. Nitrogênio da proteína: reduzido e transformado em sulfato de amônio. 2. Adição de NaOH concentrado. Liberação de gás amônia (NH3). * 3. Aquecimento para a liberação do gás amônia (NH3) dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico (HBO3) será formado borato de amônio (NH4H2BO3). 4. Dosagem do borato de amônio formado com uma solução ácida de HCl padronizada. * Outra maneira... A amônia é recolhida em uma solução ácida de H2SO4 padrão em excesso, e depois titula-se o ácido que não reagiu com a amônia, com uma solução básica padronizada de NaOH. Desvantagens: Necessita de duas soluções padronizadas. Determinação indireta. * Aparelhos utilizados Digestor Destilador de N * 2 2 Reações envolvidas na análise ácido sulfúrico sulfato de amônio hid. sódio gás amônia ácido bórico borato de amônio ác. Cloridrico cloreto de amônia ácido bórico * Cálculos Peso da amostra (mg) ------------------P Titulação da amostra (mL) -------------V fator de correção do ácido --------------f 1mL de HCl 0,1N reage com 0,0014g N N° de meq de HCl = N° de meq de N amostra 3 mols de HCL = 3 mols de N V x f x 0,0014 x 6,25 x 100 = proteína em % peso / peso P % proteína = % N x fator * Adolfo Lutz, Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais * Modificações do Método de Kjeldahl Adição de catalisadores 1885: Wilforth Adição de óxidos de metais de mercúrio, cobre, ferro etc. acelera a digestão da amostra. * Catalisadores MERCÚRIO: é superior ao cobre como catalisador. Necessidade de um etapa adicional ao processo para poder separar o complexo mercúrio-amônia formado. Precipitação do mercúrio com tiossulfato de sódio. COBRE: é o menos eficiente e tem limite de aplicação por sua toxidez. * SELÊNIO: tem efeito mais rápido do que o mercúrio e não necessita de separação. Pode haver perda de N se for utilizado em excesso ou se a temperatura de digestão não for cuidadosamente controlada. Atualmente: mistura dos três catalisadores. * B. Adição de sulfato de potássio 1889: Gunning A adição de sulfato de potássio aumenta o ponto de ebulição da mistura de digestão, acelerando o processo (370 oC e 410 oC). * C. Ácido bórico O recolhimento da amônia é feito em excesso de ácido bórico, ao invés do ácido padronizado. Vantagem: necessidade de somente uma solução padronizada. * MÉTODO DE DUMAS 1831: Dumas Determina N total, após combustão da amostra a 700 oC-800 oC, por medida volumétrica do N gasoso. Amostra é muito pequena e às vezes não- representativa de todo alimento (50 mg). * 282/IV Determinação espectrofotométrica de hidroxiprolina em carnes e produtos cárneos Resultado expresso em % m/m. A hidroxiprolina é quantitativamente determinada como medida das proteínas colágenas de carnes e produtos cárneos. O tecido conjuntivo colagenoso contém 12,5% de hidroxiprolina quando o fator 6,25 (conversão nitrogênio para proteína) é utilizado, ou 14% quando o fator é 5,55. * Metodologia A amostra é hidrolisada com solução de ácido clorídrico em constante ebulição sob refluxo, a solução é filtrada e diluída. A hidroxiprolina é oxidada com cloramina T. A cor vermelha púrpura que se desenvolve após a adição de 4-dimetilaminobenzaldeído é medida espectrofotometricamente a 558 nm. * 285IV Determinação de proteínas de soja pelo método ELISA As proteínas de soja são ingredientes utilizados na elaboração de alimentos como fonte protéica e como extensor em produtos cárneos. As amostras de produtos cárneos crus ou processados termicamente são maceradas e extraídas com solventes orgânicos. O resíduo desta extração, pó de acetona, é solubilizado a quente em solução aquosa de uréia. Após diluição, as proteínas de soja renaturadas são analisadas pelo método ELISA, utilizando anticorpos comercialmente disponíveis. * Método Na quantificação de proteínas de soja, o método ELISA é um imuno-ensaio competitivo indireto em que o analito proteína de soja (antígeno) reage com volume fixo de anticorpo anti-proteína de soja (antissoro produzido em coelho) em excesso. A reação é evidenciada pelo desenvolvimento de cor com a adição de substrato após uso de um anticorpo conjugado com uma enzima. A amostra é geralmente analisada em diluições seriadas na razão 3. A resposta é comparada a uma curva-padrão de proteína de soja. * O ELISA é semi-quantitativo na determinação de proteínas de soja em produtos cárneos crus e processados termicamente, podendo ser quantitativo quando o teor de protídios da proteína de soja adicionado é conhecido e, especialmente, se a proteína de soja (texturizada, concentrada ou isolada) está disponível para calibração. * Proteina de soja padrão – Utilize como padrão, o concentrado de proteína de soja (Loders CroKlaan B.V., Holanda) ou pó de acetona de soja (equivalente Sigma S7756) ou isolado protéico de soja Supro 500E (Protein Technologies International, USA) na preparação da solução de sensibilização. (Recomendação Manual do Instituto Adolfo Lutz) * * ELISA * XVII OVOS E PRODUTOS DE OVOS Do ponto de vista de controle, é interessante a análise eletroforética das proteínas que diferencia ovos de origem diversa (pata, galinha, etc.) * Leites e Derivados 435/IV Leites – Determinação de protídios Procedimento – Transfira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 5 mL da amostra para um frasco de Kjeldahl de 300 mL e proceda conforme método 036/IV ou 037/IV, utilizando o fator 6,38 para conversão de nitrogênio em proteína. 036/IV - 037/IV Protídios – Método de Kjeldahl * Queijos 467/IV Queijo – Determinação de protídios Procedimento – Pese 0,5 g da amostra em papel de seda e proceda conforme método 036/IV ou 037/IV, considerando o fator 6,38 para a conversão nitrogênio em proteína. * Metodologia * Curva padrão de proteína de soja * MATERIAL SUPLEMENTAR * ANÁLISE POR GRUPOS Método por Biureto 1914 – Riegler Substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas. Intensidade da cor: é proporcional à quantidade de proteína, e a medida é feita num colorímetro. * Vantagens É bastante específico por não apresentar problemas de interferentes. É simples, rápido e barato. O método determina proteína, por envolver uma reação com a ligação peptídica. Desvantagens Necessidade de uma curva de calibração tomada com um padrão conhecido de proteína (determinado por Kjeldahl). A cor formada no complexo não é idêntica para todas as proteínas. * Método por Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry) 1912: uma das primeiras determinações colorimétricas de proteína. Interação das proteínas com o reagente fenol e cobre em condições alcalinas. A reação colorimétrica envolve uma oxidação, catalisada por cobre, de aminoácidos aromáticos por um reagente heteropolifosfato (fosfotúnsticofosfomolíbdico), desenvolvendo uma cor azul. * Vantagens É de 10 a 20 vezes mais sensível que a determinação por UV,e 100 vezes mais sensível que o método por biureto. É bastante específico (poucas substâncias potencialmente interferentes, por exemplo: sacarose em alta concentração). Desvantagens A intensidade da cor pode variar com a composição da proteína analisada em aminoácidos. É lento. Destrói a amostra. Necessita de um período de incubação entre a adição dos reagentes. Necessita de curva padrão com proteína conhecida. * Método por Espectrofotemetria Ultravioleta Proteínas: absorção UV em 280 nm. Presença de tirosina, triptofano e fenilalanina, que são aminoácidos aromáticos (ligações duplas conjugadas). * Vantagens Rápido Simples Não-destrutivo Desvantagens Resultados não muito precisos: depende da concentração dos três aminoácidos na composição da proteína. Não tem interferência com sais de amônia, mas os ácidos nucléicos podem dar interferência na análise. * Métodos Turbidimétricos A medida é baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente precipitante, como o ácido tricloroacético, ferricianeto de potássio e ácido sulfossalicílico. * Vantagens É rápido É simples para amostras líquidas, nas quais a proteína está em solução. Desvantagens Não compensa ser utilizado para amostras sólidas, nas quais a proteína deve ser extraída para uma solução. Os resultados variam com o tipo de proteína. Pode haver precipitação de outras substâncias com as proteínas, causando interferência no método. O método depende de calibração com padrões conhecidos de proteínas determinados por outros métodos. * Método dye-binding 1944: quando uma amostra é tratada com excesso de corante (do tipo indicador), o corante e a proteína reagem quantitativamente para formar um complexo insolúvel que pode ser separado por centrifugação ou filtração. O excesso de corante não reagido em solução é medido colorimetricamente e, por diferença, obtém-se indiretamente a quantidade de proteína da amostra. Grãos de cereais, sementes oleaginosas, produtos vegetais e animais e latícinios. * Vantagens Simplicidade Rapidez Exatidão Economia * Bibliografia: Introdução a Ciência dos alimentos. Eliane Moretto et al. Química de alimentos de Fennema. Srinivasan Damodaran et al.
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