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Eletroforese
Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas –
proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou 
conformação
Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram 
para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou
positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)
Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel
O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar
E também para manter o pH mais ou menos constante.
Gel: composto de agarose ou poliacrilamida 
Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. 
Usada em concentrações de 0,5 to 2%. Fácil de preparar. 
Não-tóxico.
Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação 
mas baixa resolução
Dependendo da concentração podem separar fragmentos de 
DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.
Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Comprimento
das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%). 
São mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam 
ser montados entre placas de vidro. 
Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!!
Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida é
considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença 
de acrilamida livre
Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas
alta capacidade de resolução. Para DNA a poliacrilamida é usada para 
separar fragmentos de menos de 500 bp. Às vezes podem ser separados 
fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. Também usados 
para separação de proteínas.
Equipamento e reagentes para gel de agarose:
•Uma cuba de eletroforese e um fonte de força
•Bandejas de Gel, em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV. 
As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese
•Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas
•Tampão de eletroforese (corrida), Tris-acetato-EDTA (TAE) ou 
Tris-borato-EDTA (TBE). 
•Tampão de amostra material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra
Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp) 
•Brometo de Etídeo, corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos. 
Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico
•Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA corado com EtBr
Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV)
http://www.stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg
Tampão de amostra
VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE
O corante mais comum para géis de agarose é o brometo de etídio 
(EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA 
(ou RNA) 
Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV 
podemos ver as bandas de DNA. 
http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
SYBR Green > Molecular Probes 1995 
> Revolucionou a detecção de DNA em géis
A intensidade da fluorescência do SYBR 
Green é aumentada em 100X quando se
liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas 
de DNA.
Junto a sua sensibilidade superior o SYBR 
Green tem outras vantagens sobre o EtBr:
- É muito menos mutagênico, 
- Pode ser adicionado diretamente à
amostra antes da eletroforese. 
Eletroforese Vertical
VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE
Coomassie Blue
Coomassie Brilliant Blue R250, 
se liga inespecificamente a 
praticamente todas as 
proteínas. É menos sensível 
que corar com a prata mas 
efetivo também, além de ser 
fácil de corar.
http://www.theses.ulaval.ca/2005/22772/22772049.jpg
Método da Prata
A maior vantagem é a sensibilidade sobre 
os outros métodos. Tipicamente 50X maior 
que com Coomassie* Brilliant Blue R-250. 
Sensibilidade maior oferece vantagens 
como menos amostra no gel e análise de 
amostra diluída. 
A prata pode detectar também ácidos 
nucléicos, glicoproteínas e lipoproteínas. 
	Eletroforese

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