Técnicas+imunológicas

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TÉCNICAS PARA 
IMUNODIAGNÓSTICO
DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA CLÍNICA
PROFESSORA AMANDAVELA
IMUNODIAGNOSTICO
Sorologia
Estudo dos componentes do soro (principalmente anticorpos)
Imunodiagnóstico
Utilização de técnicas imunológicas para se pesquisar 
determinados antígenos ou antígenos específicos
Afinidade
Força de interação entre um único sítio de ligação
Ag-Ac (em um único epítopo).
Interações Ag - Ac
- Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente 
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas similares.
Reação cruzada
USO DOS IMUNOENSAIOS
 Confirmação de uma hipótese diagnóstica
 Diferenciar a fase de uma doença
 Diagnóstico de doenças conjuntas 
 Triagem sorológica em bancos de sangue
 Seleção de doadores e receptores de transplante
 Conferir prognóstico de uma doença
USO DOS IMUNOENSAIOS – cont.
 Estabelecer a prevalência de uma doença em determinada 
população
 Verificar a erradicação da doença
 Verificar novos casos da doença em áreas consolidadas
 Avaliação e monitoramento terapêutico
 Diferenciar imunidade ativa de imunidade passiva
TIPOS DE TESTE
Difere indivíduo 
Teste 
Qualitativo
Teste 
Quantitativo
Doente: teste positivo
Sadio: teste negativo
Doente: teste positivo
Sadio: teste negativo
Difere indivíduo 
É possível quantificar os anticorpos
TIPOS DE TESTE – cont.
Teste Semi-
quantitativo
Estima a quantidade de anticorpos através do 
título desses anticorpos (menor diluição do soro 
onde é possível a detecção de anticorpos)
Exemplo: 
 amostra de soro sem diluir – tem grande quantidade de anticorpos
 Diluir a amostra (1:2), (1:4), (1:8), (1:16), (1:32)..., até que se chegue 
a uma diluição que não seja possível encontrar anticorpo 
Essa será a diluição que chamamos de 
título do anticorpo
MÉTODOS IMUNOLÓGICAS PARA 
DETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOS
Com reagente não 
marcado
 Reação de aglutinação
 Reação de precipitação
 Enzimático (ELISA)
 Imunofluorescência (IF)
 Quimioluminescência
Com reagente 
marcado
Reação de Precipitação
E uma reação na qual ocorre a interação de antígenos e anticorpo 
solúveis correspondentes, resultando na formação de complexos 
insolúveis visíveis a olho nu (precipitado)
Reações de Precipitação
 Imunodifusão simples linear
 Imunodifusão simples radial
 Imunodifusão dupla radial
Imunodifusão
Difusão de substâncias solúveis, por movimento ao acaso, 
em um meio geleificado (com agarose)
Curva de precipitação
É o ponto em que ocorre a 
precipitação máxima ou ótima
1 – Imunodifusão simples linear (técnica de Oudin)
Adicionar 
uma solução 
de ágar + 
anticorpo
[conhecida] 
= esperar 
solidificar 
Adicionar 
uma solução 
de antígeno
[conhecida]
Antígeno
Interação antígeno-
anticorpo sobre a ágar
Incubar por 1 semana
Princípio da técnica: o anticorpo permanece fixo no gel, enquanto o 
antígeno migra através dele em uma difusão vertical. A interação entre 
Ag e Ac forma uma linha de precipitação (zona de equivalência)
Anticorpo
Difusão 
vertical
Vantagem
 Técnica barata
Desvantagens
 É demorada, tem ↓ sensibilidade e especificidade
Utilidade
Quantificar proteínas (imunoglobulinas) referentes a 
determinada patologia
2 – Imunodifusão simples radial (técnica de Mancini)
Princípio da técnica: o anticorpo permanece fixo ao gel em uma placa 
de Petri. Nos orifícios feitos no gel adiciona-se a solução de antígeno no 
orifício. A difusão do antígeno pelas várias direções do orifício criará 
um halo de precipitação (interação Ag-Ac)
Colocar uma solução de ágar + 
anticorpos específicos 
[conhecida] na placa de Petri 
e esperar solidificar
Abrir orifícios no ágar e adicionar 
uma solução de antígeno (mesmo 
volume em cada orifício) e incubar 
Usar 3 orifícios para adicionar 3 
concentrações diferentes de 
antígeno conhecida
1mg/ml
2mg/ml
3mg/ml
Os demais orifícios 
são para as amostras 
teste [desconhecida]
Após a incubação por 48 – 72h, medir a 
área onde se formou o halo (usar régua)
Em caso positivo, forma-se um halo 
estabelecendo a formação de precipitado
Vantagem
 Técnica mais rápida = resultados entre 48-72 horas
  sensibilidade = usa pequena quantidade de amostra
Desvantagens
Não utilizar para dosar hormônios e pesquisa de antígenos 
tumorais
Utilidade
Dosagem de Ig sérico (quantificação)
Dosagem da proteína C reativa - PCR
3 – Imunodifusão dupla radial (técnica de Outch Erlony)
 Princípio da técnica: baseada na difusão tanto do Ag como do Ac de 
modo que ambos se encontrem e precipitem em forma de arco (zona 
de equivalência)
AG
AG
AG
AG
AC
AC
AC
AC
AC
AGOU
AG
AG
AG
AG
AC
Durante a incubação (18 a 24h), Ag e 
Ac migram e se fundem formando a 
zona de equivalência (Ac=Ag)
Esperar a camada de 
agarose solidificar 
sobre uma lamina de 
vidro; abrir orifícios 
na agarose
Colocar Ac no orifício central e 
Ag nos laterais
Colocar Ag no orifício central e 
Ac nos laterais
Vantagem
 Técnica barata, rápida, de fácil visualização, semiquantitativa
(titulação de anticorpo)
Desvantagens
 ↓ sensibilidade (precisa de Ag e Ac em mg/ml)
Utilidade
 Triagem inicial de doenças auto-imunes
 Confirmar por imunofluorescência
ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORBÂNCIA - ELISA
Teste imunológico que mede a quantidade de ligação entre antígeno e 
anticorpo através da mudança de cor gerada pela enzima com seu 
substrato
 O ensaio é feito em placas de 96 poços (plástico => 
poliestireno ou polipropileno)
Detecção de anticorpo
Detecção de antígeno
ELISA (ensaio 
imunoenzimático)
 Resultado colorimétrico – onde ocorreu a interação Ag-Ac há 
alteração de cor 
Vantagem
  sensibilidade (~99,9%), técnica rápida, fácil visualização, 
pode ser qualitativa, quantitativa ou semi-quantitativa
Desvantagens
 Estabilidade das partículas / células revestidas por antígenos 
tem ↓ duração
Utilidade
Algumas doenças compartilham antígenos, podendo gerar 
dúvidas no diagnostico (HIV e HTLV)
TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Teste que utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para 
revelar a formação de um imunocomplexo Ag-Ac
Fluoróforo: = molécula capaz de emitir 
fluorescência
Conjugado = anticorpos + fluoróforo
Direta
Indireta
Anticorpo primário
Antígeno Antígeno
Anticorpo primário
Anticorpo 
secundário (anti-
anticorpo
Fluoróforo
Imunofluorescência Direta
 É a detecção direta de antígenos usando anticorpo (marcado com 
substância fluorescente) específico para o antígeno. 
 Método é qualitativo
 Uso: detecção de antígeno em amostras de tecidos: biopsias, células 
– infectados por bactérias, vírus respiratorios (influenza, 
parainfluenza, virus sincicial respiratorio e adenovirus).
Imunofluorescência Indireta
 O anticorpo presente na amostra do paciente reage com um 
antígeno especifico fixado na lamina de microscopia. O anticorpo 
anti-humano (conjugado) marcado com fluoresceína é adicionado. 
As lâminas positivas apresentam fluorescência em microscopia
 Método: qualitativo
 Uso: pesquisa de anticorpos específicos (IgG, IgA e IgM) para 
diagnóstico de doenças infecciosas e autoimunes (auto anticorpos 
em vasculites sistemicas (ANCA) e no diagnostico de infecções pelo 
T. pallidum, T. cruzi, para as diversas Chlamydiae, entre outros.
TESTES RÁPIDOS
Teste realizado a partir de tiras reagentes que contêm uma área 
pontilhada com anticorpo na sua extremidade
Podem ser realizados nas seguintes amostras: sangue, soro,
plasmaFigura 1 – Exemplos de testes rápidos (TR): (1a) imunocromatografia de fluxo lateral; (1b) imunocromatografia de 
dupla migração – DPP; (1c) imunoconcentração; (1d) fase sólida.