Imunocitoquímica: Identificação de Proteínas em Tecidos

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IMUNOCITOQUÍMICA
É um termo comumente utilizado na Histologia e é geralmente usado para identificar proteínas específicas nos cortes de tecidos. Esta técnica baseia-se no fato de que quando uma molécula estranha, antígeno, é introduzida num organismo, este geralmente reage produzido uma proteína, anticorpo, que se combina especificamente com antígeno. A imunocitoquímica utiliza algumas substâncias marcadoras que têm a capacidade de se ligarem aos anticorpos, sem que estes percam a sua capacidade de se acoplarem com o antígeno. Para tal, existem duas formas distintas de fazê-lo, a técnica direta e a técnica indireta.
Os três métodos mais usados para marcar os anticorpos são:
– Conjugação com composto fluorescente. Torna possível a identificação do anticorpo marcado e, portanto, do antígeno a que ele se liga, pelo emprego do microscópio de fluorescência.
– Conjugação com uma enzima. O anticorpo é localizado por meio de técnicas histoquímicas, geralmente, usadas em enzimas. A enzima mais usada é a peroxidasse, que pode ser localizada pelo método DAB (3-3’diaminobenzidina) e visualizada tanto no microscópio ótico como no eletrônico.
– Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispersa eletros. Um dos marcadores mais frequentemente usados é o ouro, cujas partículas podem ser visíveis nos microscópios ótico e eletrônico.
Técnica direta
Imagine-se que, de um determinado órgão de rato (ou de outro animal), se possa extrair e purificar uma proteína, que será denominada de proteína Y (ou antígeno). Pretende-se saber em que célula ou tecido do órgão ela se localiza. Injetando-se a proteína Y num outro animal, por exemplo, num coelho, este formará um anticorpo com a capacidade de se combinar de uma forma específica com a proteína alvo, mas não com outras. Do sangue do coelho extrai-se e purifica-se o anticorpo contra a proteína Y, podendo-se ligar quimicamente este anticorpo a um composto fluorescente ou a um ao outro marcador. Assim, procedendo desta forma, obtém-se um anticorpo que se liga à proteína de interesse (neste caso, proteína Y), e que consegue ser identificado ao microscópio. De seguida, mergulha-se um corte do mesmo órgão do qual se obteve a proteína Y numa solução que contenha o anticorpo marcado, haverá uma combinação dos dois e as estruturas que contiverem a proteína Y serão visíveis.
Técnica indireta
Esta técnica é realizada da seguinte forma: faz-se a imersão do corte histológico em solução com anticorpo não marcado, obtido do sangue de um animal no qual foi injetado o antígeno cuja localização se pretende determinar. O anticorpo liga-se ao antígeno, mas não pode ser observado ao microscópio, uma vez que, não está marcado. Logo, imerge-se o preparado em solução com antigamaglobulina marcada. Esta fixa-se àgamaglobulina que já está ligada ao antígeno, revelando a sua localização. A antigamaglobulina é obtida pela injeção da fração gamaglobulina no plasma sanguíneo do animal que recebeu injeções do antígeno numa outra espécie diferente.
Os métodos imunocitoquímicos vêm sofrendo aperfeiçoamentos para que se obtenha uma maior especificidade uma localização cada vez mais precisa das macromoléculas pesquisadas. Uma dessas melhorias é o método do ouro-proteína A que tem sido muito usado e tem contribuído significativamente na investigação da Biologia Celulares na evolução de algumas técnicas de diagnóstico médico.
Vantagens 
Custo baixo a moderado.
Alta sensibilidade e especificidade.
Permite a análise de 1 ou múltiplos antígenos simultaneamente.
Possibilidade de detecção e localização de proteínas intracelulares, bem como do tráfego intracelular. Para essa finalidade, as membranas celulares são solubilizadas com Triton.
É possível analisar 1 antígeno particular em vários tecidos em uma mesma lâmina.
Aplicável a células vivas.
Padronização e realização simples.
Necessidade de pequenas quantidades de tecido.
Desvantagens 
Necessidade de mão de obra especializada.
Processamento demorado da amostra.
Não automação.
Preparações não permanentes.
Técnicas especiais para fixação e inclusão de tecidos para imunohistoquímica nem sempre estão presentes.
Necessidade de microscopia especializada (quando usando fluorocromos).
Variabilidade do resultado conforme a leitura realizada pelo observador na imunohistoquímica por fluorescência