Metodos de estudo 2

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MÉTODOS DE ESTUDO II 
Preparação de lâmina para estudo no microscópio: 
 
I – Obtenção do material 
II- Fixação 
III- Inclusão 
IV- Microtomia 
V – Coloração 
VI- Montagem 
VII – Artefatos de técnica 
OBTENÇÃO DO MATERIAL 
• Sacrifício do animal (camundongo) 
• Retirar uma fatia do tecido o mais rápido 
possível. 
• Utilizar lâmina bem afiada 
• A fatia deve ser delgada (± 1 cm) para o 
fixador penetrar homogeneamente 
FIXAÇÃO 
• Fixadores são substâncias químicas ou agentes 
físicos que coagulam as proteínas e estabilizam a 
estrutura. 
 
1) Químicos: 
M.O – formol 4% 
 - Mistura fixadora (líquido de Bouin) 
M.E - Glutaraldeído 
 - Tetróxido de ósmio 
 - Mistura dos dois. 
 
FIXAÇÃO 
2) Físicos: 
Calor: (bacteriologia) 
Congelação: (preservação de lipídes) 
Dessecamento: (esfregaço de sangue) 
 
Desidratação: álcool 70, 80, 90 e 100 % 
Diafanização: Clareamento - Xilol 
 
 
FINALIDADES DA FIXAÇÃO 
• Impedir a autólise (auto-digestão celular) 
• Impedir a invasão bacteriana 
• Endurecer o material (facilitar o corte) 
• Aumentar a afinidade da estrutura pelos 
corantes 
INCLUSÃO 
• M.O – parafina 
• M.E – araldite ou epon 
 
 
MICROTOMIA (corte no micrótomo) 
 
. M.O – Navalha de aço 
 - Cortes de 3 -10 µm de espessura 
. M.E – Navalha de vidro ou diamante 
 - Cortes de 20 a 100 nm de espessura. 
 
Hidratação= álcool 100 – 90 – 80 – 70% 
COLORAÇÃO 
• As estruturas celulares têm diferentes afinidades 
pelos corantes 
• MO - Corantes histológicos 
 - Reações histoquímicas 
 
• ME - contraste 
 - acetato de uranila 
 - citrato de chumbo 
COLORAÇÃO HISTOLÓGICA 
Estrutura ácida ou estrutura básica 
 
O corante básico tem afinidade pelas 
estruturas ácidas (ex: hematoxilina) 
 
O corante ácido tem afinidade pelas 
 estruturas básicas (ex: eosina) 
COLORAÇÃO USUAL OU DE ROTINA 
• Hematoxilina-eosina (HE) 
 
• Núcleo (DNA)  hematoxilina – roxo = 
basofília 
 
• Citoplasma (proteínas básicas)  eosina – 
róseo = acidofilia 
TRICRÔMIO DE GOMORI 
• 1 corante básico = hematoxilina 
 
• 2 corantes ácidos = cromotropo 2 R 
 verde luz 
 
 
HISTOQUÍMICA 
• Detecta na célula uma substância, grupamento de 
substâncias ou radicais. 
 
Ex: PAS (periodic acid Schiff) 
Detecta carboidratos com radical vic-glicol: 
 - glicogênio 
 - glicoproteínas neutras 
 - glicoproteínas ricas em ácido siálico 
 (Sialomucinas) 
 
PAS 
• Obtenção do reativo de Schiff: 
 Fucsina básica + ác. Sulfuroso = reativo de Schiff 
(descorado) 
• Oxidação do radical vic-glicol com ác. periódico 
liberando aldeídos 
• Tratamento dos aldeidos com reativo de Schiff 
• Reação PAS positiva = cor bonina 
PAS (contra-prova) 
Confirmação do glicogênio 
 amilase salivar + PAS (reação negativa) 
 
Confirmação de glicoproteínas neutras 
 amilase salivar + PAS (reação positiva) 
 
Confirmação da sialomucina 
 Alcian blue pH 2,5 positiva 
 
ALCIAN BLUE 
• Detecta: 
• glicoconjugados ácidos carboxilados 
• glicoconjugados ácidos sulfatos 
• sialomucinas 
 
REAÇÃO DE FEULGEN 
• Especificidade: DNA 
 
• DNA + HCl  aldeído 
 
• Aldeído + reativo de Schiff = cor bonina (Feulgen 
positivo) 
 
• O RNA não libera aldeído (Feulgen negativo) 
DESIDRATAÇÃO 
MONTAGEM 
• Transforma o material numa preparação 
permanente 
 
• Desidratação = álcool 70, 80, 90, 100% 
 
• Coloca-se sobre o corte lamínula com 1 gota 
de Entellan ou bálsamo do Canadá 
ARTEFATOS DA TÉCNICA 
• Imperfeições decorrentes da preparação da 
lâmina: 
• Bolhas de ar 
• Retração das estruturas 
• Cristais = fixador mal removido 
• Dobras e rugas 
• Dentes da navalha 
• Uso indevido de pinças etc...