Determinação Proteina Bruta

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MANUAL DIDÁTICO 
ANÁLISES BROMATOLÓGICAS 
 
Professor: Luiz Fernandes Cardoso Campos 
 
4. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA BRUTA (PB) 
Método micro-Kjeldahl 
 
O termo Proteína Bruta (PB) envolve um grande grupo de substâncias com 
estruturas semelhantes, porém com funções fisiológicas diferentes. O método de 
Kjeldahl (1883) é o mais utilizado, principalmente em forragens, e vem sendo usado nos 
laboratórios de nutrição animal por mais de 120 anos. Este método determina o 
nitrogênio contido na matéria orgânica, incluindo o nitrogênio protéico propriamente dito 
e outros compostos nitrogenados não protéicos, como: aminas, amidas, lecitinas, nitrilas 
e aminoácidos. 
Esta técnica possibilita a determinação indireta de proteínas em várias amostras 
biológicas, assim como o nitrogênio em plantas para a avaliação do estado nutricional. 
O método é baseado na decomposição da matéria orgânica através da digestão da 
amostra a 400ºC com ácido sulfúrico concentrado, em presença de sulfato de cobre 
como catalisador que acelera a oxidação da matéria orgânica. O nitrogênio presente na 
solução ácida resultante é determinado por destilação por arraste de vapor, seguida de 
titulação com ácido diluído. 
As reações químicas que se passam durante o processo da determinação dos 
compostos nitrogenados podem ser assim resumidas: 
 
Digestão 
O carbono contido na matéria orgânica é oxidado e o dióxido de carbono (CO2) se 
desprende. Durante o processo da digestão a solução passa de uma coloração escura 
(preto) para um verde claro. Além dos agrupamentos protéicos, existe o nitrogênio sob a 
forma de amina, amida e nitrila, que é transformado em amônia (NH3) a qual reage com 
o H2SO4, formando o sulfato de amônio ((NH4)2SO4) conforme mostrado nas reações 
durante a digestão, e esse ao esfriar forma cristais. 
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Durante a digestão ocorrem as seguintes reações: 
 
 
Destilação 
Após a digestão inicia-se o processo de destilação que pode ser feita por 
aquecimento direto ou por arraste de vapor. O sulfato de amônio é tratado com hidróxido 
de sódio (NaOH), em excesso, ocorrendo a liberação de amônia, conforme as reações: 
 
Ao se adicionar o hidróxido de sódio, deve-se utilizar algumas gotas de solução 
indicadora, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. A amônia que 
desprende na reação é coletada num frasco contendo ácido bórico (H3BO3) com o 
indicador, previamente adaptado ao conjunto da destilação. 
Considera-se terminado o processo, quando toda a amônia já se desprendeu. A 
solução contendo ácido bórico com o indicador que no início apresentava coloração 
rósea adquire a cor azulada à medida que vai se formando o borato de amônio 
(NH4H2BO3), conforme a reação: 
 
Titulação 
A última etapa do processo corresponde a titulação. O borato de amônio é titulado 
com uma solução padrão de ácido clorídrico (HCl) de título conhecido até a viragem do 
indicador, conforme a reação: 
 
Na determinação da proteína bruta, multiplica-se o valor do nitrogênio total 
encontrado pelo método de Kjeldahl por um fator que converte o nitrogênio em proteína. 
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Convencionalmente, em amostras de alimentos para animais: plantas forrageiras, rações 
concentradas, entre outros materiais, a proteína bruta (PB) é expressa pelo fator 6,25, 
considerando que a maioria das proteínas contém nas suas moléculas aproximadamente 
16% de nitrogênio. A expressão abaixo é utilizada para determinar a proteína bruta: 
Expressa-se o resultado corrigido, tendo-se como base de correção a matéria seca 
a 105ºC. Deve se fazer testes em branco com o objetivo de eliminar a interferência e 
contaminação dos reagentes. 
 
4.1. Reagentes, padrões e materiais 
Todos os reagentes devem ser de grau analítico (p.a.), exceto quando especificado. 
Toda a água utilizada nos procedimentos deve ser destilada/deionizada, exceto quando 
especificada. 
 
4.1.1 Reagentes 
 Ácido bórico (H3BO3); 
 Ácido clorídrico (HCl); 
 Ácido sulfúrico (H2SO4); 
 Etanol (CH3CH2OH); 
 Hidróxido de sódio (NaOH); 
 Sulfato de amônio ((NH4)2SO4); 
 Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O); 
 Sulfato de sódio anidro (Na2SO4) ou sulfato de potássio anidro (K2SO4); 
 Verde de bromocresol (C21H14Br4O5S); 
 Vermelho de metila (C15H15N3O2). 
 
4.1.2 Padrões 
 Carbonato de sódio (Na2CO3), material de referência. 
 
4.1.3 Materiais 
 Balões volumétricos (1000 mL); 
 Bureta graduada ou titulador automático; 
 Erlenmeyers de 125 ou 250 mL; 
 Gral de porcelana com pistilo; 
 Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio); 
 Provetas de 50, 100 e 250 mL; 
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 Tubos de vidro compatíveis com sistemas micro. 
 
4.2. Equipamentos 
 Balança analítica, com precisão mínima de quatro casas decimais; 
 Bloco digestor; 
 Capela de exaustão; 
 Destilador micro ou macro-Kjeldahl; 
 
4.3 Precauções analíticas 
Este método emprega substâncias químicas nocivas e procedimentos que podem 
representar risco ao operador. Todos os procedimentos devem ser realizados com uso 
de equipamentos de proteção individual e uniforme apropriado. O preparo das soluções 
reagentes deve ser feito em capela de exaustão. 
 
4.4 Preparo de soluções e reagentes 
4.4.1 Mistura catalítica 
Juntar dez partes de sulfato de sódio (ou potássio) anidro e uma parte de sulfato 
de cobre pentahidratado. Triturar em gral, homogeneizar e armazenar em frasco 
identificado. 
 
4.4.2 Solução de hidróxido de sódio 50% (m/v) 
Em um béquer de PVC, em capela dissolver lenta e cuidadosamente 500 g de 
hidróxido de sódio em 800 mL de água destilada. Esperar esfriar. Transferir para balão 
volumétrico de 1 L e completar volume com água destilada. 
 
4.4.3 Indicador misto 
Pesar 0,132 g de vermelho de metila e 0,06 g de verde de bromocresol. Dissolver 
em 200 mL de álcool etílico 70% (v/v). Filtrar se necessário e guardar em frasco âmbar. 
 
4.4.4 Solução de ácido bórico 4% (m/v) 
Dissolver 40 g de ácido bórico em 800 mL de água quente. Homogeneizar. Deixar 
esfriar, transferir para um balão de 1000 mL, adicionar 8 mL de indicador misto. 
 
4.4.5 Solução de ácido sulfúrico 0,05 M (mol/L) 
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Na capela de exaustão, transferir cuidadosamente 2,7 mL de ácido sulfúrico para 
balão volumétrico de 1000 mL, contendo aproximadamente 400 mL de água. Deixar 
esfriar e completar o volume. 
 
4.4.6 Solução hidro-alcoólica de vermelho de metila 0,1% (m/v) 
Em um balão volumétrico de 100 mL, dissolver 0,1 g de vermelho de metila em 40 
mL de etanol. Completar o volume com água. Homogeneizar e armazenar em frasco 
âmbar identificado. 
 
4.4.7 Solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1 M (mol/L) 
Na capela de exaustão, adicionar com cuidado e lentamente pelas paredes de um 
balão de 1000 mL contendo 500 mL de água deionizada, 8,6 mL de ácido clorídrico, com 
auxílio de uma pipeta. 
Completar o volume com água deionizada e transferir a solução preparada para 
frasco de vidro e rotular. Essa solução poderá ser armazenada à temperatura ambiente. 
 
4.5. Padronização da solução titulante 
4.5.1 Solução de ácido sulfúrico 0,05 M 
Realizar a padronização em triplicata. 
Colocar cerca de 5 g de Carbonato de sódio (Na2CO3) em cadinho de porcelana de 
50 mL. 
Comprimir a substância contra as paredes do cadinho, com uma espátula. 
Aquecer a 300ºC, durante duas horas utilizando um forno mufla. Transferir o 
Na2CO3 para um dessecador e deixar esfriar. 
Pesar adequadamente (com ajuda de papéis de seda), em um erlenmeyer de 250 
mL, cerca de 0,130 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de água deionizada e três 
gotas de solução de vermelhode metila 0,1% (m/v). Titular com solução de ácido 
sulfúrico 0,05 M. Calcular o fator de correção (f) utilizando a seguinte fórmula: 
f = m __ __ 
0,053 . V. M 
Onde: 
m = massa (g) de carbonato de sódio; 
V = volume (mL) da solução de ácido sulfúrico gasto na titulação; 
M = concentração (molaridade) da solução de ácido sulfúrico utilizada. 
 
4.5.2 Solução de ácido clorídrico 0,1M 
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Realizar a padronização em triplicata. 
O procedimento de tratamento do sal (Na2CO3) e o cálculo do fator de correção (f) 
deverão ser realizados conforme o item 5.1. 
Pesar adequadamente (com ajuda de papéis de seda), em um erlenmeyer de 250 
mL, cerca de 0,132 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de água deionizada e uma 
gota de solução de vermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com solução de ácido clorídrico 
0,1 M. 
 
4.6. Procedimento Analítico 
4.6.1 Digestão 
Pesar, em balança analítica, cerca de 0,25 g de amostra em papel de pesagem e 
transferir para o tubo. 
Adicionar aproximadamente 1 a 1,2 g de mistura catalítica e 5 mL de ácido sulfúrico. 
Aquecer em bloco digestor, realizando uma sequência conforme tabela 1, até o 
líquido se tornar límpido e transparente, de tonalidade azul-esverdeada. 
Deixar esfriar. 
 
Tabela 1. Sequência de aquecimento para digestão de amostras para determinação de 
proteína bruta (método micro-Kjeldahl). 
ETAPA TEMPERATURA TEMPO 
1 50°C 30 minutos 
2 100°C 20 minutos 
3 150°C 20 minutos 
4 200°C 20 minutos 
5 250°C 20 minutos 
6 300°C 20 minutos 
7 350/400°C* Até clarear 
* Para produtos lácteos manter a 350°C; outros produtos: 400°C. 
 
4.6.2 Destilação 
Diluir a amostra que está no tubo de digestão com 15 ml de água destilada (a 
amostra deverá estar fria). 
Levar ao destilador de nitrogênio um erlenmeyer contendo 10 mL de solução de 
ácido bórico 4% com indicador misto. Cuidar para que o terminal do condensador esteja 
mergulhado na solução. 
Acoplar o tubo de micro-Kjeldahl ao destilador. 
Adicionar a solução de hidróxido de sódio 50% (aproximadamente 15 a 25 mL) até 
obter uma solução de cor escura, que é indicativa da neutralização da reação. 
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Proceder à destilação. 
Recolher aproximadamente 50 ml do destilado. 
 
4.6.3 Titulação 
A titulação poderá ser realizada com solução fatorada de ácido sulfúrico 0,05 M ou 
de ácido clorídrico 0,1 M. 
Titular diretamente no erlenmeyer em que foi coletado o destilado. 
Certificar-se de que a ponta da bureta esteja bem dentro do erlenmeyer. 
Introduzir a solução de titulação lentamente, agitando constantemente o 
erlenmeyer para assegurar a mistura. 
O ponto final da titulação será indicado pela mudança de cor da solução para róseo. 
Anotar o volume de ácido gasto na bureta. 
 
4.7. Cálculo 
O resultado a ser expresso é a média das duplicatas, em % de proteína bruta, deve 
ser calculado de acordo com as fórmulas abaixo: 
 
4.7.1. Cálculo do nitrogênio 
 
%N = V x Fc x N x 0,014 x 100 
PA 
Em que: 
N = nitrogênio (%) 
V = volume ácido gasto na titulação (ml). 
Fc = Fator de correção do ácido. 
N = normalidade do ácido. 
0,014 = miliequivalente-grama do nitrogênio. 
PA = peso da amostra seca (g). 
 
4.7.2. Cálculo da proteína bruta 
PB(%) = %N x FN 
Em que: 
PB = teor de proteína bruta na amostra (%); 
N = Nitrogênio (%); 
FN = Fator de conversão de nitrogênio em proteína = 6,25. 
 
4.7.3. Ajuste à base de 100 % da matéria seca 
 
Base seca = %PB na ASA x 100 
%MS (105ºC) 
 
Onde: 
%PB na ASA = % de extrato etéreo na amostra seca ao ar. 
%MS (105°C) = % de matéria seca na amostra. 
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Universidade Estadual de Goiás Câmpus de São Luís de Montes Belos Curso: Zootecnia Disciplina: Bromatologia. 
Prof.: Luiz Fernandes Cardoso Campos 
Aluno (a): ___________________________________________________________ 
 
 
Aula Prática 
 
DETERMINAÇÃO DO NITROGÊNIO E PROTEÍNA BRUTA: 
 
 Ácido clorídrico (mL) 
Amostra 
Nº 
Amostra 
%MS ASA (g) 
Vol. 
Total 
Vol. 
Branco 
Vol. 
Real 
Normalidade 
do ácido (N) 
FC 
(Nx0,014) 
Nitrogênio 
(%N) 
PB 
ASA (%) 
Média PB 
ASA (%) 
PB (MS) 
Alim1 1 
93,26 
0,2504 2,47 0,20 0,1 
 
Alim1 2 0,2500 2,54 0,20 0,1 
Alim2 3 
91,15 
0,2550 2,82 0,20 0,1 
 
Alim2 4 0,2508 2,68 0,20 0,1 
Alim3 5 
92,06 
0,2502 3,58 0,20 0,1 
 
Alim3 6 0,2504 3,38 0,20 0,1 
Alim4 7 
75,76 
0,2507 2,63 0,20 0,1 
 
Alim4 8 0,2508 2,52 0,20 0,1 
 
 
 
 
 
 
 
Vreal = Vtotal - Vbranco %N = Vreal x FC x 100 %PB = %N x 6,25 %PBMS = (%PBASA / %MS) x 100 
 ASA (g)