Marcadores Moleculares (4)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO GRANDE DO SUL
UNIDADE UNIVERSITÁRIA EM SANTA CRUZ DO SUL
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
Alunos: Fabio Leipelt
 David Fagundes
 Thais Nunes 
Marcadores Moleculares
Professor: Dr. Alexandro Caligari
Santa Cruz do Sul
2014
Índice
1 INTRODUÇÃO
 1.1 Marcadores Moleculares: Definições
 1.1.1 Marcadores Morfológicos
 1.1.2 Marcadores Biológicos
 1.2 Vantagens
 1.3 Aplicações em geral
2 CLASSIFICAÇÃO 
	2.1 Amplificação (PCR)
		2.1.1 RAPD
		2.1.2 STS
		2.1.3 SCAR
		2.1.4 SSR
	2.2 Hibridização
	2.3 Sequências Expressas
 2.4 Isoenzimáticos
APLICAÇÃO
 3.1 Marcadores Moleculares no Pré-Melhoramento
 3.2 Marcadores Moleculares no Melhoramento
 3.3 Marcadores Moleculares no Pós-Melhoramento
 3.4 Outras aplicações
4 Conclusão
	
1. INTRODUÇÃO
Cada cromossomo contém uma longa e única molécula de DNA, além de proteínas que atuam no seu empacotamento. As tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referência nos cromossomos, tecnicamente denominados “marcadores moleculares”.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Marcadores Moleculares: Definições
“Por marcador molecular define-se todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso” (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
“Marcadores moleculares são características de DNA que diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdados geneticamente” (Milach,1998).
“Marcadores de DNA são derivados de pequenas pequenas regiões regiões do DNA que apresentam polimorfismo entre indivíduos dentro de uma espécie” (Vilella, 2000).
Marcadores Morfológicos
Até meados da década de 60, os marcadores utilizados em estudos de genética e melhoramento eram controlados por genes associados a caracteres morfológicos, em geral fenótipos de fácil identificação visual, como nanismo, deficiência clorofílica, cor de pétala ou morfologia foliar. 
Marcadores morfológicos contribuíram para o desenvolvimento teórico da análise de ligação gênica e para a construção das primeiras versões de mapas genéticos.
Marcadores Biológicos
Marcadores biológicos são substâncias e estruturas (núcleo, angiogênese, micróvilos...) que podem ser medidos quantitativamente por métodos bioquímicos, imunológicos, morfométricos, ultra-estruturais e moleculares nos fluídos ou tecidos corporais associados a neoplasias.
Nas ultimas décadas, várias proteínas e pequenos peptídeos foram identificados como produtos de secreção de neoplasias sólidas podendo ser utilizados como marcadores de neoplasias diagnósticos. 
Vantagens
Muito esforço e planejamento são necessários para construir um mapa a partir de marcadores morfológicos uma vez que um número reduzido de marcadores por linhagem restringe a cobertura de genoma. Por outro lado, um grande número de locos de marcadores moleculares pode ter seus alelos estudados em populações segregantes de cruzamentos específicos.
Vantagens
Marcadores moleculares são, em geral, neutros em relação a efeitos fenotípicos. Enquanto os morfológicos muitas vezes coíbem ou restringem o desenvolvimento normal da planta (albinos, mutantes clorofílicos), e seu controle genético pode afetar, ou ser afetado, por genes controlando outros caracteres, dificultando a caracterização dos genótipos.
Em geral os marcadores moleculares são co-dominantes, contendo maior quantidade de informação genética por loco. Já os marcadores morfológicos são em sua maioria dominantes ou recessivos.
Vantagens
Além destes aspectos, os marcadores morfológicos apresentam ainda a desvantagem de serem somente identificados ao nível de planta adulta. Entretanto os moleculares podem ser utilizado sem qualquer estágio de desenvolvimento da planta, desde que suficiente DNA possa ser obtida.
Aplicações em geral
Marcadores moleculares de DNA têm sido usados para melhoramento dos pais de híbridos; desenvolvimento de mapas genéticos; reconstituição de pedigrees; testes de pureza genética; seleção de resistência a patógenos; associação com caracteres quantitativos; estudos de interação genótipo-ambiente; processos legais; entre outros...
Contudo, os principais motivos para aplicação limitada de marcadores moleculares em programas de melhoramento ainda têm sido o custo e procedimentos elaborados da maioria dos marcadores disponíveis. Assim, novos tipos de marcadores estão surgindo e abrindo novas perspectivas.
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 Multiplicação exponencial da amostra de DNA (in vitro)
 Ciclos repetidos
 Reagentes: DNA, DNAP, dNTPs, primers
 Automatização – Termociclador
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 DNA: Dois sítios complementares aos primers
1)
Banco de 
Dados
Sequências
de Interesse
Síntese de
primers
2) 
Sequenciamento de fragmentos de DNA
Desenho e Validação
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.1 RAPD 
RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA
AP-PCR – Arbitrarily Primed-Polymarase Chain Reaction)
Um único primer randômico (10 nucleotídeos)
 Não há necessidade do conhecimento prévio das sequências
Duas regiões complementares ao primer separadas por até 4 kb
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.1 RAPD
Vantagens:
Execução rápida, simples
Fabricação barata
“Primer universal”
Automatização
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.1 RAPD
Desvantagens:
DNA repetitivo
Pouca informação genética em cada locus
		Apenas um dos alelos é identificado
Dominância – não distingue homo e heterozigotos
Baixa reprodutibilidade dos resultados – técnica sensível
	f (pequenas modificações nas concentrações dos componentes) 
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.2 STS 
STS – Sequence Tagged Sites
Oligonucleotídeos com certa especificidade
Unificar a linguagem de mapeamento no genoma humano
Sequências curtas (200-500 pb) e de cópias únicas
Primers de 18-26 nucleotídeos
RFLP
 Bibliotecas de cDNA
STS
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.2 STS
Vantagens:
Codominância
Mais reproduzíveis que RAPDs – primers maiores
Obs.: Possuem os mesmos métodos de extração de DNA, execução da PCR e equipamentos utilizados na técnica RAPD
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.2 STS
Desvantagens:
Exigem algum conhecimento prévio das sequências de DNA-alvo
Caro e trabalhoso - desenvolvimento dos primers 
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.3 SCAR 
SCAR – Sequence Characterized Amplified Regions
Sequência e intervalo entre cada membro do par de primers
Primers de 16-24 nucleotídeos
Podem conter sequências de DNA repetitivo
Testes de validação
SCAR
RAPD
AFLP
Difícil interpretação
Baixa reprodutibilidade
Resultados fidedignos
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR 
SSR – Simple Sequence Repeat
STR – Short Tandem Repeats
SSLP – Simple Sequence Lenght Polymorfism
STMS – Sequence Tagged Microsatellite Sites
Microssatélites
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR 
1 a 6 nucleotídeos repetidos n vezes em tandem
5´	ATATATATATATATATATATATATATAT 3´
3´ TATATATATATATATATATATATATATA 5´
Frequência: 1 a cada 6-7 kb
Ocorrência: Eucariotos e Procariotos (alguns)
Sequências de DNA que flanqueiam são conservadas
		 primers específicos
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR 
Classificação:
Simples ou Compostos
Perfeito
Imperfeito
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Simples – formados por apenas uma repetição (classe)
5´	ATATATATATATATATATATATATATAT 3´
3´ TATATATATATATATATATATATATATA 5´
Compostos – duas ou mais repetições adjacentes (classes)
5´	ATATATATATATGGTGGTGGTGGT 3´
3´ TATATATATATACCACCACCACCA 5´
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Perfeitos – não apresentam nenhuma interrupção
5´	ATATATATATATATATATATATATATAT
3´
3´ TATATATATATATATATATATATATATA 5´
Imperfeitos – apresentam interrupções de bases não repetidas
5´	ATATATATATCGCTATATATATATATAT 3´
3´ TATATATATAGCGATATATATATATATA 5´
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Unidade Repetitiva:
Nome
Sequência
Mononucleotídica
(G)n
Dinucleotídica
(GA)n
Trinucleotídica
(GAT)n
Tetranucleotídica
(GATA)n
Pentanucleotídica
(GATAC)n
Hexanucleotídica
(GATACA)n
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Unidade Repetitiva:
Nome
Sequência
Mononucleotídica
(G)n
Dinucleotídica
(GA)n
Trinucleotídica
(GAT)n
Tetranucleotídica
(GATA)n
Pentanucleotídica
(GATAC)n
Hexanucleotídica
(GATACA)n
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Vantagens:
Comportamento codominante – Heterozigotos podem ser identificados
Alto polimorfismo – Altas taxas de mutação nos loco
Evolução rápida
Reprodutibilidade
Simplicidade técnica
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Desvantagens:
Fabricação lenta, trabalhosa e cara
Impossibilidade de utilizar “primers universais”
			 Desenvolvidos especificamente para cada espécie
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Desenvolvimento:
Técnica proposta inicialmente
 i) Biblioteca genômica, hibridização com sondas contendo microsatélite, 
 sequenciamento dos clones hibridizados, e desenho dos primers
2) Seleção de Microssatélites em Biblioteca Genômica
3) Seleção de Microssatélites em Biblioteca Genômica Enriquecida
2 CLASSIFICAÇÃO
2.1 Amplificação (PCR)
 2.1.4 SSR
Aplicações:
Mapeamento genômico
Estudos de ligação
Identificação de genótipos
Proteção de variedades
Avaliação de pureza de sementes
2 CLASSIFICAÇÃO
2.4 Isoenzimáticos 
 Formas moleculares múltiplas de enzimas que ocorrem em um mesmo organismo e membros da mesma espécie.
Podem ser produtos de diferentes sítios genéticos, resultar de alterações secundárias estruturais, ou pela duplicação de um gene com mutação.
Detecção: cromatografia, filtração gélica, eletroforese, etc.
Segregação monogenética e co-dominância 
	 
		Distinção: híbridos X genitores (banda isoenzimática).
2.4 Isoenzimáticos
Extração da enzima do tecido vegetal 
		Separação por eletroforese 
 			Revelação das bandas por 						métodos de coloração histoquímica do gel.
Aplicações: caracterização de variabilidade genética, estudos de evolução e dispersão de espécies e analises filogenéticas. 
Vantagens: Muitos sistemas isoenzimáticos são informativos, técnica barata, operacionalmente acessível (análises que não demandam ampla amostragem do genoma).
2 CLASSIFICAÇÃO
2.4 Isoenzimáticos
Limitações: reduzida cobertura dos genomas investigados (poucos locos detectados), baixo nível de polimorfismo identificado por loco, especificidade à tecidos ou órgãos vegetais, influência do ambiente, complexidade de alguns zimogramas (interpretação dos padrões de bandas revelados nos géis)
2 CLASSIFICAÇÃO
3 APLICAÇÃO
3.1 Marcadores Moleculares no Pré-Melhoramento
Conhecimento genético Marcadores Moleculares
Diversidade Genética (RAPD)
 Manipulação do germoplasma
Dispersão de uma espécie (AFLP)
Seleção de genótipos de resistência
3 APLICAÇÃO
3.1 Marcadores Moleculares no Pré-Melhoramento
Banco de Germoplasma
		Atividades: aquisição, caracterização, avaliação, distribuição e documentação.
	Uso: características atrativas (SSR Primers, RAPD, AFLP)
	Limitação: classificação botânica
	Estabelecimento de coleções nucleares
3 APLICAÇÃO
3.1 Marcadores Moleculares no Pré-Melhoramento
Paternidade
Proteção, correta multiplicação de sementes, controle da pureza genética em campos de produção de sementes híbridas, disputa judicial de material genético.
RAPD, SCAR, VNTR, STMS, ISSR-PCR, FISSR-PCR
Construção de Mapas Genéticos de Ligação 
Informação básica para estudos como mapeamento, estabelecimento de programas de melhoramento
Primers/sondas: de acordo com a população a ser mapeada
3 APLICAÇÃO
3.1 Marcadores Moleculares no Pré-Melhoramento
Mapeamento comparativo
É mais fácil mapear e analisar os genes na espécie de genoma mais simples/menor tamanho e utilizar o aprendizado desse mapa para desenvolver estudos genômicos na outra espécie.
RFLP, c-DNA...
Mapeamento Gênico
Genes associados a caracteres qualitativos e quantitativos.
3 Aplicação
3.2 Marcadores Moleculares no Melhoramento
Certificação de Cruzamentos
Hibridização em plantas autógamas (melhoramento).
Uso dos marcadores morfológicos para evitar contaminação das futuras gerações.
Seleção de Genitores
Predição de Híbridos
Alocação de linhagens
Avaliação da divergência genética.
Possibilitam ampla amostragem 
do genoma
RFLP, RAPD, SSR, AFLP
3 APLICAÇÃO
3.2 Marcadores Moleculares no Melhoramento
Seleção assistida
Característica de Interesse (SSR, STS)
Recuperação do Genoma Recorrente 
Melhoramento de Característica Quantitativas
Piramidação de genes QTLs
Melhoramento de Plantas Autógamas ou de Linhagens
3 APLICAÇÃO
3.3 Marcadores Moleculares no Pós-Melhoramento
Caracterização de cultivares
SSR, SNP, AFLP
Informação adicional em processos de descrição de cultivares para proteção.
Pureza Genética de Cultivares
Elevado grau de homozigose
STS, SSR
3 APLICAÇÃO
3.3 Marcadores Moleculares no Pós-Melhoramento
Identificação de mistura varietal em lotes de sementes
Sementes de outros cultivares em um lote de sementes.
3 APLICAÇÃO
3.4 Outras aplicações
Filogenia: métodos de reconstrução de árvores
Estudo de pedigree
Diagnose: Doenças
OGM
4 CONCLUSÃO
Marcadores moleculares ligados à características quantitativas não irão nunca substituir os métodos tradicionais de seleção, mas poderão auxiliar geneticistas através do fornecimento de informações referentes ao genótipo, o que aumentará o ganho genético e diminuirá o intervalo entre gerações quando genótipos superiores forem detectados.
Na ultima década, houve um avanço significativo tanto nas técnicas moleculares quanto nas metodologias estatísticas, o que tornou o melhoramento assistido uma realidade.
Referencias Bibliográficas
BORÉM, A. CAIXETA, E.T. Marcadores Moleculares. 2ª edição. Universidade Fereral de Viçosa. 2009.
www.researchgate.net/...marcadores.../6a85e52e0fa2e7eb84.pdf
http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_do03_4.htm
http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-extras/marcadores-moleculares/