Atividade Enzimática Prática8

Prévia do material em texto

�PAGE �
INTRODUÇÃO
A concentração de atividade enzimática (U/mL) em uma amostra pode ser determinada a partir da velocidade da reação catalisada pela enzima em análise. Antes de iniciar a explicação da estratégia usada neste cálculo deve ser lembrado que por definição 1 unidade (1U) de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima que catalisa uma reação com velocidade de formação de 1 micromol de produto por minuto.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS 
Durante a prática foram utilizados os seguintes materiais e soluções:
Pipetas graduadas diversas;
12 tubos de Folin-Wu;
Solução de sacarose 0,5 mol/L em tampão acetato 0,05 mol/L pH 4,7;
Solução de invertase;
Reagente do DNS;
Solução padrão de glicose 5,0 μmol/mL em tampão de acetato 0,05 mol/L, pH 4,7.
2.2. DESCRIÇÃO DO EXPERIMENTO 
2.2.1. Obtenção da enzima invertase
Essa etapa foi previamente realizada pela estagiária do laboratório. Pesou-se 15g de fermento biológico e 15g de NaCl, misturando-os por 10 minutos. A seguir a mistura foi centrifugada por 20 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi então recolhido e diluído na proporção de 1:250.
2.2.2. Construção da curva padrão de glicose
Em 6 tubos de Folin-Wu foram adicionados 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da solução padrão de glicose 5,0 μmol/mL, completando o volume a 1,0 mL.
Em cada tubo adicionou-se 1,0 mL do reagente do DNS, aquecendo as soluções em banho maria durante 5 minutos. Com os tubos resfriados, avolumou-se as soluções para 12,5 mL, homogeneizando os tubos. 
Então, foram lidas as absorvâncias a 540 nm.
2.2.3. Influência do tempo de reação 
 Foram marcados 6 tubos de Folin-Wu com os seguintes tempos de reação:1, 2, 3, 5, 10 e 15 minutos. 
Em cada tubo adicionou-se 0,5 mL da solução de sacarose 0,5 mol/L e 0,5 mL da solução da enzima invertase, disparando o cronômetro assim que a enzima foi adicionada. Com o tempo esgotado, adicionou-se 1,0 mL do reagente do DNS e o tubo foi levado a banho maria em ebulição por 5 minutos. 
Após resfriados os tubos, avolumou-se a 12,5 mL e as absorvâncias foram lidas a 540 nm no mesmo espectrofotômetro utilizado para a construção da curva de calibração.
3. RESULTADOS
Na tabela 1 são apresentados os resultados das absorvâncias obtidas para a confecção da curva de calibração.
	Volume de Glicose adicionado em mL
	Glicose µmol/mL
	ABS
	0
	0
	0
	0,2
	0,08
	0,076
	0,4
	0,16
	0,175
	0,6
	0,24
	0,269
	0,8
	0,32
	0,361
	1
	0,4
	0,436
Plotando os dados da tabela 1, obtemos o gráfico da curva padrão de glicose:
Gráfico 1 Curva Padrão de Glicose
	Abaixo as absorvâncias obtidas para a curva de velocidade de reação, em função do tempo:	
	Tempo (min)
	ABS
	1
	0,195
	2
	0,28
	3
	0,384
	5
	0,243
	10
	0,15
	15
	0,232
Substituindo os dados de absorvância da tabela 2 no modelo obtido para curva padrão de glicose, que é y = 1,1175x - 0,004. Obtemos os resultados apresentados na tabela abaixo:
	Tempo (min)
	ABS
	Fator de diluição
	Produto formado µmol/mL
	Tempo (min)
	1
	0,195
	
	0,1986
	1
	2
	0,28
	
	0,2836
	2
	3
	0,384
	
	0,3876
	3
	5
	0,243
	2
	0,4932
	5
	10
	0,15
	5
	0,7679
	10
	15
	0,232
	5
	1,1779
	15
	Plotando os dados da tabela acima, obtemos os seguintes gráficos: 
Usando todos os intervalos de tempo, obtivemos o seguinte gráfico:
Gráfico 2: Utilizando todos os intervalos de tempo.
 y= ax +b
	
Onde b = 0, devido a curva partir da origem, logo, o parâmetro a seria a constante que relacionaria a variação da formação de produto com o tempo.
	A constante obtida no experimento será
	Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante 
 Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico da figura 
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico 2, onde y= 0,0668x + 0,1505
 
Então v0 = 0,0668 µmol/mL.min. 
 
( Cálculo da atividade da preparação enzimática 
 
Unidade padrão (U) de uma enzima é a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de produto por minuto sob a condição definida. Neste caso considerar U= 1 µmol de glicose/min .
 
1 µmol/min -----------------U 
0,0668 µmol/mL.min ----- x x = 0,0668 U/mL
 Determinação da velocidade inicial da reação é de extrema importância, pois ela nos fornece a taxa da conversão de substrato em produto. 
Usando todos o intervalo de 1à 3minutos, obtivemos o seguinte gráfico:
Gráfico 3: Utilizando os tempos de 1à 3 minutos.
 y= ax +b
	
Onde b = 0, devido a curva partir da origem, logo, o parâmetro a seria a constante que relacionaria a variação da formação de produto com o tempo.
	A constante obtida no experimento será
Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante 
 Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico da figura 
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico 2, onde y = 0,0945x + 0,1009
 
Então v0 = 0,0945 µmol/mL.min. 
 
( Cálculo da atividade da preparação enzimática 
 
Unidade padrão (U) de uma enzima é a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de produto por minuto sob a condição definida. Neste caso considerar U= 1 µmol de glicose/min .
 
1 µmol/min -----------------U 
0,0945 µmol/mL.min ----- x x = 0,0945U/mL
Usando todos o intervalo de 5 à 15 minutos, obtivemos o seguinte gráfico:
Gráfico 4 Utilizando os tempos de 5à 15 minutos
 y= ax +b
	
Onde b = 0, devido a curva partir da origem, logo, o parâmetro a seria a constante que relacionaria a variação da formação de produto com o tempo.
	A constante obtida no experimento será
	Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante 
 Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico da figura 
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico 2, onde y= 0,0685x + 0,1282
 
Então v0 = 0,0685 µmol/mL.min. 
 
( Cálculo da atividade da preparação enzimática 
 
Unidade padrão (U) de uma enzima é a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de produto por minuto sob a condição definida. Neste caso considerar U= 1 µmol de glicose/min .
 
1 µmol/min -----------------U 
0,0685 µmol/mL.min ----- x x = 0,0685 U/mL
Determinação da velocidade inicial da reação é de extrema importância, pois ela nos fornece a taxa da conversão de substrato em produto. 
A velocidade da reação catalisada por uma enzima é aumentada devido ao abaixamento da energia de ativação necessária para converter o substrato no produto. O aceleramento da reação pode ser da ordem dos milhões de vezes. Num dado momento t a atividade catalítica é dada pelo declive da curva nesse tempo t. À medida que o tempo de ensaio aumenta diminui a velocidade e esse fato pode ser causado pela diminuição de concentração de reagentes (que se vão consumindo), pelo aumento de concentração de produtos (que podem tornar significativa a velocidade da reação 
inversa) ou/e simplesmente porque a enzima é instável nas condições de ensaio.
_1573584955.unknown
_1573585137.unknown
_1573585225.unknown
_1572857046.unknown