AULA+PRÁTICA+DE+FERMENTAÇÃO 2018

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AULA PRÁTICA DE FERMENTAÇÃO
OBJETIVO: Monitorar a fermentação da sacarose (condições anaeróbicas) através da produção de CO2 e pelo consumo de sacarose.
MATERIAIS: Fermento de pão fresco em pasta, sacarose, água destilada, solução de Seliwanof, 2 tubos Falcon, pipetas de 1 e 5ml, Becker de 500ml, Becker de 250ml, balança, tubos de ensaio, banho-maria, estufa e espectrofotômetro.
PROCEDIMENTO: 
PREPARO DA SOLUÇÃO DE LEVEDURA:
Coloque a levedura (3g) em um Becker de 100 ml. 
Adicione 60ml de água destilada.
Agite até que a levedura fique dissolvida.
Deixe à temperatura ambiente.
PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE DE SACAROSE:
Pesar 10g de sacarose.
Avolumar a 100ml com água destilada.
PREPARO DA SOLUÇÃO DILUÍDA DE SACAROSE:
Separe 30ml da solução estoque de sacarose.
Avolume a 300ml de água destilada.
Coloque no banho a 40ºC.
PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE PARA A CURVA DE CALIBRAÇÃO:
Prepare uma estante com 11 tubos de ensaio.
Numere de 1 a 11 e siga a tabela abaixo:
	Número do tubo
	Solução de sacarose 1% (ml)
	Água (ml)
	% final de sacarose
	1
	0,0
	3,0
	
	2
	0,3
	2,7
	
	3
	0,6
	2,4
	
	4
	0,9
	2,1
	
	5
	1,2
	1,8
	
	6
	1,5
	1,5
	
	7
	1,8
	1,2
	
	8
	2,1
	0,9
	
	9
	2,4
	0,6
	
	10
	2,7
	0,3
	
	11
	3,0
	0,0
	
PREPARO DAS SOLUÇÕES FINAIS PARA A CURVA DE CALIBRAÇÃO:
Prepare uma estante com 11 tubos de ensaio.
Numere os tubos de acordo com a tabela abaixo:
	Número do tubo
	Solução estoque para a curva de calibração (ml)
	Água (ml)
	1’
	0,3
	2,7
	2’
	0,3
	2,7
	3’
	0,3
	2,7
	4’
	0,3
	2,7
	5’
	0,3
	2,7
	6’
	0,3
	2,7
	7’
	0,3
	2,7
	8’
	0,3
	2,7
	9’
	0,3
	2,7
	10’
	0,3
	2,7
	11’
	0,3
	2,7
PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO:
Prepare uma estante com 11 tubos de ensaio.
Numere os tubos de acordo com a tabela abaixo:
	Número do tubo
	Solução final para a curva de calibração (ml)
	Solução de Seliwanof
	1’’
	0,5
	2,5
	2’’
	0,5
	2,5
	3’’
	0,5
	2,5
	4’’
	0,5
	2,5
	5’’
	0,5
	2,5
	6’’
	0,5
	2,5
	7’’
	0,5
	2,5
	8’’
	0,5
	2,5
	9’’
	0,5
	2,5
	10’’
	0,5
	2,5
	11’’
	0,5
	2,5
Guarde fora da área de trabalho!!!
FERMENTAÇÃO:
Prepare dois tubos Falcon de 50 ml, um deles deve estar com a tampa furada.
Pipete 5ml da solução estoque de sacarose em cada tubo Falcon.
Pipete 10 ml da solução de levedura (agite bem antes de pipetar), e complete o volume (até encher) com água.
Atarraxe as tampas e agite.
Retire uma alíquota de 3ml do tubo sem furo e coloque no banho a 100ºC por 10 minutos. Esta será a amostra do tempo zero.
Simultaneamente, coloque os tubos Falcon no Becker contendo a solução diluída de sacarose no banho a 40ºC. O tubo com a tampa furada deve estar virado de cabeça para baixo. Faça isso com cuidado!! Se houver uma bolha de ar no fundo do tubo (que agora está para cima), marque com a caneta o contorno dela. 
COMECE A MARCAR O TEMPO!!!
A cada 30 minutos, retire uma alíquota de 3ml do tubo fechado e marque com uma caneta, no tubo furado, onde está o líquido (volume de gás).
As alíquotas devem ser aquecidas a 100ºC por 10 minutos
Após o aquecimento, retire 0,5ml do sobrenadante de cada tubo e adicione 4,5ml de água. Agite bem.
Retire uma alíquota de 0,5ml destas diluições e adicione 2,5ml da solução de Seliwanof em cada tubo. Estas são as amostras.
Após retirar a alíquota do último tempo, coloque os tubos da curva de calibração junto com as amostras no banho a 100ºC. Deixe ferver por 40 minutos. Após esse tempo, as soluções começarão a apresentar uma cor acastanhada.
Leia no espectrofotômetro a 520nm.
	Número do tubo
	Abs
	Concentração
	1
	
	
	2
	
	
	3
	
	
	4
	
	
	5
	
	
	6
	
	
	7
	
	
	8
	
	
	9
	
	
	10
	
	
	11
	
	
	Amostras
	Tempo (min)
	Abs
	Concentração (%)
	Volume de CO2 (ml)
	1
	
	
	
	0
	2
	
	
	
	2,0
	3
	
	
	
	11,0
	4
	
	
	
	26,0
	5
	
	
	
	32,0
	6
	
	
	
	35,0
Prepare o gráfico da curva de calibração (Abs X concentração);
Calcule o fator;
Calcule a concentração das amostras;
Prepare os gráficos: teor de sacarose X tempo e volume X tempo;
Interprete os gráficos;
Se a via glicolítica utiliza primariamente glicose e frutose, como é possível que a sacarose esteja sendo utilizada?