PROTOCOLO MICROBIOLOGIA

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MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ana Mendes Ferreira, António Inês, Maria José Saavedra, Arlete Mendes Faia 
 
 
 
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro 
 
2009 
 
Manual de aulas práticas de Microbiologia 
 
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1 - NORMAS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
As aulas práticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratório de 
Microbiologia. Nessas aulas serão utilizados vários grupos de microrganismos, bactérias e fungos, 
alguns dos quais poderão ser patogénicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras 
de modo a evitar qualquer tipo de contaminações. 
1 - A roupa deve ser sempre protegida por uma bata ; 
2- Não fumar nem comer no laboratório. Não levar à boca qualquer objecto nomeadamente lápis, 
canetas, etc. Não humedecer etiquetas com a boca; 
3 - Manter a superfície da bancada livre de todo o material que não for utilizar durante a 
experiência; 
4 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao terminá-lo lavar e desinfectar as mãos; 
5 - Desinfectar a superfície da bancada que irá utilizar com álcool a 70%, antes e após a execução 
do trabalho; 
6 - Evitar que objectos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama; 
7 - Todo o material usado (pipetas, lâminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do 
recipiente com desinfectante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri serão 
colocadas dentro do balde para posterior inactivação; 
8 - O estudante com cabelos longos deve apanhá-los, sobretudo quando o trabalho exige a 
utilização do bico de Bunsen, de forma a não os queimar. 
9 - Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efectue aspirações 
indevidas ; 
10 - Comunicar imediatamente qualquer acidente do género corte, queimadura, etc. 
11 - Nunca esquecer de flamejar as ansas antes de as guardar no suporte. 
12- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilização; 
13 - O microscópio deve ser manuseado com cuidado : 
a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a colocá-la no final; 
b) As lâminas já observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que está em cima da 
bancada para o efeito; 
c) Só deverá remover a lâmina da platina, depois deslocação da objectiva; 
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d) Nunca deixar a lente de imersão suja de óleo, limpando-a com o lenço de papel seco, 
depois com o lenço embebido em xilol e novamente com o lenço seco. 
14 - Não misturar material conspurcado com o material esterilizado. 
15 - Durante os trabalhos práticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente. 
16 - Etiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa. 
 
2- MATERIAL UTILIZADO NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
Microscópio- amplifica e ilumina objectos tal como bactérias e outros microrganismos que de outro 
modo seriam invisíveis; 
Autoclave - equipamento destinado à esterilização de materiais e meios de cultura utilizados em 
Microbiologia, por vapor de água sob pressão; 
Estufas- equipamento para esterilizar material de vidro (forno de Pasteur), com temperaturas 
máximas até 180-200°C; para incubações, 5°C acima da temperatura ambiente, com temperaturas 
máximas de 70-100°C; 
Incubadora- equipamento de temperatura controlada (0 a 50°C) para cultivo de microrganismos; 
Jarra de anaerobiose- câmara que permite remover o oxigénio do ar, substituindo-o por outro gás, 
para crescimento de microrganismos anaeróbios; 
Caixas de Petri- caixas de vidro com tampa rasa, onde se colocam os meios de cultura sólidos 
(Placa de Petri) para o crescimento dos microrganismos; 
Tubos de cultura- tubos de vidro para o cultivo dos microrganismos em meios líquidos e sólidos; 
Tubos Durham- tubos de vidro de dimensões reduzidas utilizados para o aprisionamento do gás 
produzido pelos microrganismos, em meios líquidos; 
Pipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, etc. Devem ter um tampão de 
algodão na extremidade superior; 
Micropipetas- utilizadas para transferências de líquidos, inoculações, quando se pretendem 
volumes muito reduzidos; 
Lâminas e lamelas- para observações ao microscópio; 
Câmaras de contagem- lâminas de vidro padronizadas e desenhadas para permitirem a contagem 
de microrganismos totais numa suspensão; 
 
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Ansas e agulhas – instrumento com um fio de platina, enrolado ou recto, esterilizável à chama 
antes e após utilização, usado para transferir culturas de microrganismos; 
Para além deste material, há outro tipo de equipamento que é necessário ter num laboratório de 
Microbiologia nomeadamente – frigorífico, balança, aparelho de destilação e desionização de água, 
banho-maria, centrífuga, agitadores magnéticos, filtros de esterilização. 
 
3- LIMPEZA E PREPARAÇÃO DE MATERIAL 
Num laboratório de Microbiologia devem ser mantidas condições de higiene apropriadas na medida 
em que se trabalha com uma grande variedade de microrganismos, alguns dos quais poderão ser 
patogénicos. 
O chão deve ser lavado e desinfectado diariamente; 
As bancadas e todas as superfícies devem ser convenientemente desinfectadas com álcool a 70%; 
As placas de Petri com culturas devem ser previamente esterilizadas (121°C durante 20-25 min.) 
para inactivação das culturas. Após a esterilização o meio de cultura é escorrido e as caixas são 
lavadas com água e detergente e posteriormente mantidas algumas horas nesta solução. Depois 
são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água destilada. As caixas são 
embrulhadas em papel e esterilizadas a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur; 
Os tubos com culturas são submetidos ao procedimento descrito anteriormente. São esterilizados 
a 180°C durante 2 horas num forno de Pasteur. Quando contêm meios de cultura são esterilizados 
em autoclave a 121°C durante 15 min. 
As pipetas são lavadas com água corrente e posteriormente mantidas algumas horas numa 
solução com detergente. Depois são escorridas, passadas por água da torneira, e no fim por água 
destilada. Depois de secas, coloca-se um tampão de algodão na parte superior. São colocadas em 
caixas apropriadas ou embrulhadas em papel antes da esterilização a 180°C durante 2 horas num 
forno de Pasteur; 
As lâminas e lamelas utilizadas nas observações ao microscópio são colocadas numa solução com 
detergente. Depois de lavadas devem ser colocadas numa mistura cromo-sulfúrica durante a noite 
e posteriormente lavadas. 
Notas importantes: 
Flamejar as ansas antes e depois do contacto com as culturas. Deixar arrefecer a ansa antes de 
tocar na colónia da cultura; 
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Flamejar as aberturas dos tubos de ensaio, após a abertura e antes da colocação da tampa. 
Manter a tampa na mão por pressão do dedo mínimo; 
A abertura da tampa da placa de Petri deve ser cuidadosa, devendo ser manuseada junto à 
chama. 
 
4 - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 
O crescimento microbiano está dependente da presença de água e de nutrientes indispensáveis à 
biossíntese de material celular e à obtenção de energia. As exigências nutritivas e as condições 
ambientais que asseguram o crescimento são dependentes do tipo de microrganismo. No cultivo 
de microrganismos são utilizadas soluções de substâncias que funcionam como nutrientes 
necessários ao seu crescimento e multiplicação celular. Estassoluções designadas por meios de 
cultura têm uma composição variável com as exigências nutricionais de cada espécie. Os meios de 
cultura podem ser líquidos (caldo), semi-sólidos ou sólidos (1,5 a 2% de agar). O agar é um 
agente gelificante, de baixo valor nutritivo, extraído de algas marinhas, que se liquefaz a 100°C e 
solidifica a 40°C. Quanto à composição química, são designados por meios sintéticos – quando 
quimicamente definidos; e complexos - com composição química desconhecida (com extracto de 
levedura, extracto de carne, extracto de malte, peptona, ou triptona, por exemplo). Quanto à 
função, os meios de cultura podem ser: meios de enriquecimento – formulados para permitirem o 
crescimento de microrganismos mais exigentes; meios selectivos – formulados para o crescimento 
de uns em detrimento de outros; e meios diferenciais – formulados para distinguir microrganismos 
que possuam determinada característica bioquímica. 
 
Material necessário: Erlenmeyer; Balança; Água destilada; Peptona; extracto de carne; Tubos 
de ensaio 
 
Preparação de agar nutritivo (Como exemplo) 
1- Pesar individualmente 5 g de peptona e 3 g de extracto de carne (usar espátulas bem limpas e 
limpar entre pesagens). Não voltar a introduzir o excesso no frasco. 
2- Adicionar os ingredientes a 500 ml de água destilada colocada num Erlenmeyer de 2000 ml. 
3- Homogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura até que se verifique a dissolução 
completa dos ingredientes. 
4- Adicionar 15 a 20 g de agar aos outros componentes e homogeneizar. 
5- Adicionar água destilada de modo a perfazer o volume de 1000 ml. 
6- Acertar a pH 7.0 com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico 1N, a uma temperatura de 60 °C. 
Lavar rapidamente os eléctrodos do potenciómetro. 
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7- Repartir o meio por 3 balões de 500 ml, previamente esterilizados. Rolhar e esterilizar em 
autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 
 
Composição do agar nutritivo: 
• Extracto de carne ................................ 3 g 
• Peptona .............................................. 5 g 
• Agar ................................................... 15 g 
• H2O destilada ................................... 1000 ml 
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos 
 
Notas importantes: 
A adição do agar aos meios deve ser sempre feita no final, depois de todos os ingredientes 
estarem dissolvidos; 
O meio de cultura deve ser esterilizado logo após a sua preparação; 
Os fracos não devem conter mais de metade do seu volume; 
Os frascos não devem ter as rolhas completamente apertadas durante a esterilização; 
 
5 - TÉCNICAS UTILIZADAS NA CULTURA DE MICRORGANISMOS 
O estudo de microrganismos no laboratório envolve o seu crescimento e manutenção em meios de 
cultura. Há um conjunto de técnicas básicas de repicagens e sementeiras de modo a preservar o 
organismo. Para isso é necessário obter em primeiro lugar uma cultura pura do isolado (colónia 
obtida a partir de uma única célula). A principal fonte de contaminação externa é a atmosfera por 
isso a manipulação dos organismos terá que ser efectuada em condições de assepsia. 
 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
-Placas de Petri com agar nutritivo 
-Tubos com caldo nutritivo 
-Tubos com agar nutritivo inclinado 
-Tubos com agar nutritivo 
-Ansas e agulhas 
-Pipetas 
-Estufa 
 
Procedimento 
1- Isolamento de colónias em meio sólido 
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Por espalhamento- Retirar 0,1 ml de uma cultura líquida para a superfície da placa de Petri. 
Espalhar uniformemente com auxílio de um semeador (vareta de vidro dobrada) ou com pérolas 
de vidro esterilizadas de modo a que as células fiquem afastadas umas das outras e se obtenham 
colónias individualizadas. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas 
à temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. 
 
Sementeira por esgotamento (streak plate) – isolamento e obtenção de cultura pura - 
Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, retire uma porção de 
colónia que pretende isolar e espalhe à superfície da placa de Petri de modo a que as células 
fiquem afastadas umas das outras e se obtenham colónias individualizadas. Identificar a placa com 
o nome do operador e a data. Incubar as placas à temperatura apropriada para o microrganismo 
em estudo. 
 
2- Repicagem de colónias 
Para agar inclinado- Com auxílio de uma ansa previamente aquecida ao rubro e arrefecida, 
retire uma porção de colónia que pretende guardar e ou fazer crescer e espalhe à superfície do 
agar inclinado. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à 
temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. 
Para agar em tubo- Com auxílio de uma agulha previamente aquecida ao rubro e arrefecida, 
retire uma porção de colónia que pretende guardar e/ou fazer crescer e introduza por picada 
dentro do agar. Identifique o tubo com o nome do operador e a data. Incubar os tubos à 
temperatura apropriada para o microrganismo em estudo. 
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Figura 1- Sementeira à superfície da gelose inclinada 
Nota: 
Após a obtenção de uma cultura pura de um isolado, a cultura deve ser mantida em laboratório de modo a que as células 
permaneçam viáveis e sem contaminações. Podem ser refrigeradas a 4°C ou congeladas (-18°C) por períodos curtos ou por 
períodos mais longos a -70°C ou liofilizadas. 
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Trabalho prático 1 
Diversidade e ubiquidade dos microrganismos 
Os microrganismos existem no ar, na água e principalmente no solo. Do solo podem ser 
arrastados pelo vento através das partículas de poeira. Desenvolvem-se logo que as condições 
ambientais (nutrientes, humidade e temperatura) sejam favoráveis ao seu crescimento. Cada 
organismo aparece pelo menos num habitat natural específico no qual pode ser normalmente 
encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado. 
 
Objectivos: 
Comprovar a diversidade e a ubiquidade dos microrganismos 
 
Material necessário 
-Placas de Petri com meio de agar nutritivo 
-Pipetas 
-Estufa 
-Zaragatoas 
 
Procedimento 
1- Pesquisa de microrganismos do ar 
Retirar a tampa de várias placas de Petri com agar nutritivo e manter abertas durante 5, 10 e 15 
minutos. Identificar a placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 
dias. 
 
2- Pesquisa de microrganismos das superfícies da sala de aulas 
Passar um cotonete estéril sobre uma superfície da bancada antes e após a sua desinfecção com 
álcool a 70%. Passar o cotonete (zaragatoa) sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a 
placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. 
 
3- Pesquisa de microrganismos de outros ambientes 
Passar um cotonete estéril entre os dedos, antes e após a lavagem das mãos. Passar o cotonete 
sobre a superfície do meio de cultura. Identificar a placa com o nome do operador e a data. 
Incubar as placas a 37°C durante 3 dias. 
 
4- Pesquisa de microrganismos do solo 
Pipetar 100ul da solução de solo e colocar numa placa de Petri com o meio de cultura. Espalhar a 
solução à superfície do meio com a ajuda de um semeador. 
 
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Identificara placa com o nome do operador e a data. Incubar as placas a 30°C durante 3 dias. 
 
Resultados: 
-Examinar as placas e contar o número de colónias totais e o número de colónias diferentes em 
cada placa; 
-Descrever o tipo de colónias com base na descrição apresentada na Fig.1. 
-Registar os resultados. 
 
Quadro – Caracterização das colónias observadas 
Características das colónias 
Dimensão 
(mm) 
Cor Forma Elevação Margem Representação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Escolher 2 ou 3 colónias que considere mais interessantes. Colocar uma alíquota de líquido ou uma 
porção de colónia (homogeneizar) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Observar ao 
microscópio. Desenhe cada uma das suas observações no Quadro: 
Observação das células retiradas da 
colónia 1 
Observação das células retiradas da 
colónia 2 
Observação das células retiradas da 
Colónia 3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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FORMA 
 
 
 
 
 
 
ELEVAÇÃO 
 
 
 
 
MARGEM 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2- Descrição de vários tipos de colónias 
Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Pevide 
Plana Elevada Convexa Em abóbada Mamilonada 
Inteira Ondulada Lobada Irregularmente 
crenada 
Filamentosa Frisada 
Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide Pevide 
Plana Elevada Convexa Em abóbada Mamilonada 
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Trabalho prático 2 
Morfologia bacteriana e métodos de coloração 
As bactérias são organismos unicelulares que podem apresentar formas esféricas (cocos), 
cilíndricas (bacilos) e espirais (espirilos e espiroquetas). Reproduzem-se por cisão binária. Após o 
alongamento da célula, forma-se um septo que vai gradualmente progredindo até à formação de 
duas células. Estas podem separar-se ou não umas das outras. Com base no número e no plano 
de divisão celular, as células podem apresentar-se sob as seguintes formas: Diplococcos (cocos 
aos pares); Streptococcus (cocos em cadeia); Staphylococcus (cocos em cacho); tétradas 
(agrupamentos de quatro cocos); sarcinas (agrupamentos de oito cocos em cubo). Os bacilos 
também podem aparecer isolados, aos pares e em cadeia. O tamanho das células é variável. O 
exame das bactérias pode ser feito directamente da suspensão, através de preparações a fresco 
em gota pendente. As preparações coradas permitem observar características morfológicas e 
evidenciar diferenças entre espécies (Bactérias Gram positivo e Gram negativo). 
 
Figura 3- Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos 
 
Objectivos: 
Observar células vivas e mobilidade, distinguir microrganismos por coloração do meio envolvente e 
distinguir microrganismos Gram positivo e Gram negativo. 
 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
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-Microscópio 
-Ansas 
-Lâminas e lamelas 
-Azul de metileno 
-Tinta da China 
-Reagentes para a coloração de Gram 
 
Procedimento 
Retirar as lâminas limpas do contentor que se encontra em cima da bancada. Limpar com papel 
absorvente. Manipular tocando apenas nos bordos das lâminas. Identificar a lâmina numa 
extremidade. 
 
Observação a fresco- Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar 
com água) numa lâmina e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. 
 
Observação de mobilidade (preparação de gota pendente) - Colocar uma alíquota de 
líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar com água) numa lamela. Colocar nos cantos da 
lamela um bocado de vaselina. Cobrir com uma lâmina de modo a que a gota fique no centro da 
zona escavada. Observar ao microscópio. 
 
Coloração simples- Colocar uma alíquota de líquido ou uma porção de colónia (homogeneizar 
com água) numa lâmina, adicionar uma gota de azul-de-metileno e cobrir com uma lamela. 
Observar ao microscópio. 
 
Preparação dos esfregaços 
-Marcar na parte inferior da lâmina uma pequena área onde se irá fazer a preparação; 
-Colocar uma gota de água na secção delimitada; 
-Esterilizar a ansa, colocando-a verticalmente à chama de um bico de Bunsen até ficar ao rubro. 
Deixar arrefecer; 
-Retirar com a ansa uma porção da colónia e misturar com a água colocada na lâmina; 
- Deixar secar ao ar; 
-Fixar passando a face inferior da lâmina 3 vezes através da chama. Deixar arrefecer; 
-Corar pelo método escolhido; 
 
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Coloração simples com fixação- Após fixar, deixar arrefecer e adicionar uma das soluções 
apresentadas de seguida, deixando actuar durante o tempo referido para cada uma delas. 
-Cristal de violeta (1 minuto) 
-Azul de metileno de Loeffler (5 minutos) 
-Fucsina (30 segundos). 
-Lavar cuidadosamente e deixar secar ao ar 
 
Coloração negativa- Após fixar, espalhar muito bem uma gota de nigrosina (10%) sobre a 
preparação. Deixar secar o corante e observar com a lente de imersão. Esta coloração poderá ser 
usada na observação de cápsulas. Neste caso a preparação é previamente corada com fucsina, 
lavada e seca antes de se adicionar a nigrosina. 
 
Coloração diferencial de Gram 
Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas na tina de lavagem, 
Colocar algumas gotas de cristal de violeta. Deixar actuar durante 1 minuto; Retirar o excesso do 
corante e passar por água; 
Colocar algumas gotas de Lugol (mordente que aumenta a reacção entre o cristal de violeta e as 
células). Deixar actuar durante 1 minuto; 
Passar por água e secar com papel de filtro; 
Descorar com álcool a 95% durante 10 a 20 segundos;Passar por água e secar; 
Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com água e secar com papel 
absorvente; 
Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão. 
 
Coloração de esporos 
Colocar a lâmina com o esfregaço fixado sobre 2 varetas sobre o contentor com água em ebulição; 
Cobrir o esfregaço com um quadrado de papel de filtro; 
Colocar algumas gotas de verde malaquite (solução aquosa a 5%). Deixar actuar durante 5 
minutos; Passar por água; 
Cobrir com safranina. Deixar actuar durante 30 segundos. Lavar com água e secar com papel 
absorvente; 
Examinar ao microscópio com a objectiva de imersão. 
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Trabalho prático 3 
Morfologia e estrutura dos fungos 
Os fungos são organismos não-fotossintéticos que podem apresentar uma forma filamentosa 
(fungos filamentosos) ou unicelular (leveduras). Alguns fungos podem ser dimórficos, 
apresentando uma estrutura micelial ou unicelular dependendo das condições do meio. 
 
Objectivos: 
Observação das estruturas de vários fungos – hifas, micélio, células e estruturas de reprodução. 
 
1- Fungos filamentosos 
Os fungos são constituídos por uma massa de filamentos muito finos (micélio). Cada filamento 
(hifa) assemelha-se a um longo tubo cilíndrico em que as células se distinguem umas das outras 
devido à existência de septos (hifa septada) ou sem separação das células (hifas cenocíticas). Os 
fungos são constituídos por hifas vegetativas designadas por talo. Estas hifas penetram no 
substrato, tendo algumas funções semelhantesàs raízes das plantas (rizoides). Reproduzem-se 
por esporos que podem ser formados sexuada ou assexuadamente. As hifas fertéis exibem 
normalmente as estruturas de reprodução que permitem classificar e identificar os fungos. 
 
 
 
Figura 4- Morfologia e estrutura de alguns fungos filamentosos 
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Material necessário 
-Culturas de fungos 
-Microscópio 
-Ansas 
-Lâminas e lamelas 
-Lupa 
 
Procedimento 
Comparar macroscopicamente as colónias de diversas culturas de fungos que lhe são fornecidos; 
Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina, adicionar uma 
porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. 
Preparar lâminas com e sem adição de lactofenol. 
 
Resultados 
Descrever as características das colónias observadas, 
Descrever as estruturas reprodutivas dos vários fungos (fazer um desenho), hifas, etc. 
 
2- Leveduras 
As leveduras são fungos unicelulares que se reproduzem assexuadamente por gemulação ou cisão. 
Por vezes, as gémulas não se separam da célula mãe formando longas cadeias de células que se 
designa por pseudomicélio. Outras, quando cultivadas em determinadas condições formam 
verdadeiro micélio (dimorfismo). A morfologia das leveduras é bastante variada. Apresentam 
células esféricas, ovais elípticas, cilíndricas, em forma de limão, triangular e até em forma de 
garrafa. 
 
Material necessário 
-Culturas de leveduras; 
-Microscópio; 
-ansas; 
-Lâminas e lamelas; 
 
Procedimento 
Examinar macroscopicamente as colónias de diversas leveduras; 
Para o exame microscópico a fresco colocar uma gota de água sobre a lâmina, adicionar uma 
porção de colónia e cobrir com uma lamela. Observar ao microscópio. 
 
 
 
 
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MORFOLOGIA DAS LEVEDURAS
ESFÉRICA
OVOIDE
CILÍNDRICA
APICULADA
GARRAFA
TRIANGULAR
Saccharomyces cerevisiae
Dekkera bruxellensis
Pichia membranaefaciens
Kloeckera apiculata
Pitysporum ovale
Trigonopsis variable
 
Figura 5- Morfologia das leveduras 
 
 
 
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Trabalho prático nº4 
Titulação de uma suspensão de bacteriófagos líticos por contagem de placas fágicas 
Os vírus são entidades biológicas acelulares constituídos apenas por um ácido nucleico (DNA ou 
RNA) designado por nucleóide, envolvido por uma cápsula proteica, designada por cápside. O 
conjunto da cápside e nucleóide designa-se por nucleocápside. Alguns, podem ainda ser revestidos 
por um invólucro (envelope) constituído por proteínas e fosfolípidos, adquiridos da membrana da 
célula hospedeira, aquando do processo de libertação das partículas virais. 
Todos os vírus podem apresentar dois estados: extracelular ou intracelular. O estado extracelular, 
designado por partícula viral ou virião, corresponde à forma inerte do vírus, sob a qual é 
transmitido entre células hospedeiras. No estado intracelular ocorre a replicação do ácido nucleico 
viral e a produção de novas partículas virais. Deste modo, os vírus são considerados parasitas 
intracelulares obrigatórios uma vez que o processo de multiplicação viral é estritamente 
dependente da maquinaria da célula hospedeira. Existe uma enorme especificidade entre os vírus 
e as suas células hospedeiras compatíveis. Assim existem vírus que se replicam apenas no interior 
de células animais, outros em células vegetais, outros em fungos, outros em algas e outros em 
protozoários. Os bacteriófagos1, ou simplesmente fagos, são vírus que se replicam apenas no 
interior de bactérias. A replicação dos fagos está ainda restrita a certas espécies/estirpes 
bacterianas. O ciclo de multiplicação dos fagos envolve as seguintes fases: (1) adsorção a 
receptores específicos da superfície; (2) injecção do genoma do fago para o interior da bactéria; 
(3) replicação do genoma viral; (4) maturação em que após a formação de todos os 
componentes virais e consequente montagem dá origem à formação de novos fagos; (5) 
libertação dos novos fagos com ruptura da célula infectada. Este processo de multiplicação é 
designado por ciclo lítico e os bacteriófagos são designados por fagos líticos. Por vezes o 
genoma do fago não se replica mas integra-se no cromossoma bacteriano, sendo transmitido à 
descendência bacteriana como parte integrante do seu genoma. Este processo é designado por 
ciclo lisogénico e os bacteriófagos são designados por fagos temperados. As bactérias que 
transportam no seu cromossoma um genoma viral (profago) são designadas por lisogénicas. 
Em determinadas circunstâncias um profago pode ser activado, replicar-se e induzir o ciclo lítico 
dando origem à libertação de novos fagos. Os vírus líticos provocam a lise da célula bacteriana 
hospedeira aquando da sua libertação. Por isso podem ser detectados por diluição e espalhamento 
em superfícies de agar inoculadas com células hospedeiras para a formação de placas fágicas. 
Estas placas são zonas transparentes sobre uma camada de células hospedeiras, e representam o 
ponto sobre o qual uma partícula viral infecciosa foi depositada. Como resultado de ciclos líticos 
subsequentes, as células hospedeiras nessas zonas são destruídas. O tamanho das placas é 
dependente dos tempos de replicação quer dos vírus quer das bactérias hospedeiras. A contagem 
de placas fágicas é por isso análoga à contagem de colónias bacterianas em caixa de Petri, e deste 
 
1
 Os bacteriófagos (fago: do grego phagein: comer) “comedores de bactérias” foram descobertos por Frederick Twort e 
Felix d’Herelle na 2ª década do sec. XX 
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modo, a contagem de placas fágicas pode ser usada para determinar o título, i.e. a concentração 
de partículas fágicas, na suspensão inicial. 
 
Objectivos: 
Contagem de placas fágicas 
 
Material necessário 
Por grupo: 
8 eppendorfs com 0.9 ml de meio LB 
8 tubos com 5 ml de meio LBss (mantidos em banho a 50 ºC) 
8 tubos vazios esterilizados 
1 erlenmeyer com 100 ml de meio LBs (mantido em banho a 50 ºC) 
8 caixas de Petri esterilizadas 
1 micropipeta 
1 caixa com pontas amarelas esterilizadas 
1 tubo com a cultura de células hospedeiras (Escherichia coli 5911) 
1 eppendorf com a suspensão do fago T72 
 
Procedimento 
No ínicio da aula, distribuir o meio de cultura LBs (sólido) pelas caixas de Petri formando uma 
camada fina no fundo. Deixar solidificar. 
Fundir o meio LBss (semi-sólido) e manter os tubos em banho a 50 ºC. (Consulte o fluxograma em 
anexo como um auxiliar durante o procedimento experimental) 
1. Preparar diluições seriadas (10-1 até 10-8) da suspensão fágica, adicionando (0.1 ml) da 
suspensão inicial ao meio líquido estéril LB (0.9 ml/eppendorf). 
2. Identificar os tubos vazios esterilizados com as diluições realizadas. Retirar 0.1 ml de cada 
diluição e colocar nos respectivos tubos. 
3. Adicionar 0.1 ml da cultura bacteriana hospedeira (DO600nm≈1.0) a cada um dos tubos 
anteriores. 
4. Identificar as caixas de petri previamente preparadas com as diluições efectuadas (10-1 até 10-
8). 
5. Adicionar a cada um dos tubos (ponto 3.) 5 ml do meio LBss contido nos tubos mantidos em 
banho a 50 ºC. Misturar os conteúdos dos tubos por agitação suave (evitar a formação de bolhas) 
e em seguida derramar e espalhar uniformemente sobre a superfície da camada de LBs dascaixas 
 
2 O fago T7 é um dos vários colifagos que infecta estirpes de Escherichia coli. Possui uma molécula linear de DNA em 
cadeia dupla. Apresenta cabeça, cauda curta, não contráctil e pertence à família Podoviridae (Para mais informações 
consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/54010001.htm) 
 
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de petri correspondentes. (Nota: deve preparar 1 tubo de cada vez para evitar que o meio 
solidifique). 
6. Inocular 0.1 ml da cultura de células hospedeiras isoladamente como controlo. 
7. Deixar que o agar solidifique e incubar as caixas a 37 ºC durante 24 horas. 
 
Resultados 
Observar as caixas e determinar o nº de placas fágicas (“plaque-forming units”-pfu), partículas 
fágicas infecciosas, por ml da suspensão original. Apenas as caixas contendo 30-300 placas fágicas 
devem ser consideradas. 
pfu/0.1 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição 
Como apenas foram plaqueados 0.1 ml deve multiplicar-se por 10 para obter pfu/ml 
pfu/1.0 ml = nº de placas fágicas x factor de diluição x 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
placa fágica 
 
 “camada” de E. coli 
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Procedimento experimental 
 
 
 
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Trabalho prático 5 
Avaliação do crescimento microbiano 
O perfil de crescimento de uma população microbiana pode ser avaliado através da determinação 
periódica do número de indivíduos, da massa celular ou através da actividade celular. O processo 
mais usual é o de contagem directa ao microscópio, utilizando câmaras de contagem que 
permitem determinar o número total de células. Para distinguir células viáveis (com capacidade 
para se multiplicar) de não viáveis é necessário cultivar as células num meio de cultura adequado 
ao crescimento da espécie em causa. Para o efeito, um volume conhecido de uma suspensão 
microbiana é espalhado uniformemente à superfície do meio de cultura (técnica de espalhamento) 
ou misturado com o meio ainda liquefeito (método de incorporação). Após alguns dias à 
temperatura adequada, as colónias são contadas (30 a 300) e os resultados são expressos em 
unidades formadoras de colónias (ufc). O número de células viáveis pode ser também estimado 
através de diluições sucessivas da suspensão em análise (3 a 5 tubos para cada diluição). Nas 
diluições mais elevadas não haverá crescimento em todos os tubos. O cálculo do número mais 
provável de microrganismos será efectuado com base no número de tubos positivos, recorrendo às 
Tabelas de MacGrady. 
A massa celular pode ser determinada directamente através do peso seco ou indirectamente por 
turbidimetria. 
 
 
Figura 6- Curva que representa o crescimento microbiano em sistema fechado, em batch (sistema 
descontínuo) 
 
 
Objectivos: 
Comparação de métodos de avaliação do crescimento microbiano 
 
 
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1- Avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem em câmara 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
-Microscópio 
-Câmara de contagem 
 
Procedimento 
Colocar na câmara uma gota da suspensão de microrganismos; 
Cobrir com a lamela; 
Contar o número de células por quadrado (Na zona central estão gravadas duas grelhas que são 
constituídas por um quadrado dividido em 400 pequenos quadrados, cada um com uma área de 
1/400 mm2); Para que o valor seja mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e 
determinar a média; 
 
Resultados 
O número de microrganismos/ml = 10001 x
uadradodexáreadoqprofundidaNx ; 
N= valor médio de microrganismos por quadrado 
 
Numa câmara em que a profundidade seja de 0,1 mm e a área do quadrado de 1/400 = 0.0025 
mm2, o número de microrganismos/ml será igual ao valor médio por quadrado x 4 x 106. 
 
Figura 7- Procedimento para avaliação quantitativa de uma população microbiana - Contagem de 
células em câmara 
 
 
 
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2- Determinação do número de células viáveis - Contagem em placas 
 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
-Tubos de ensaio com 9 ml de água estéril (solução salina) 
-Placas de Petri com meio apropriado à cultura 
-Agitador de tubos 
-Pipetas esterilizadas de 1 ml 
 
 
 
Figura 8 - Determinação do número de células viáveis – contagem em placa 
 
Procedimento 
Pipetar 1 ml da suspensão da cultura para um tubo com 9 ml de água estéril (diluição de 1:10); 
Homogeneizar muito bem num agitador; 
Transferir 1ml do tubo da diluição 1 para um segundo tubo 2 com 9 ml de água estéril (diluição de 
1:100);Homogeneizar muito bem num agitador 
Fazer isto sucessivamente até obter a diluição desejada que permita contar as ufc; 
Espalhar uniformemente em placas de Petri 0,1 ml de cada uma das diluições (Identificar cada 
uma das placas com a diluição respectiva, data e nome do operador); 
Incubar as placas a 30°C durante 3 dias; 
 
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Resultados 
Escolher o número de placas que contenham 30 a 300 colónias e efectuar a contagem. Determinar 
o valor médio de colónias por placa e multiplicar pelo factor de diluição. O resultado será expresso 
em ufc/ml. 
 
 
3- Avaliação do crescimento por turbidimetria 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
-Tubos de ensaio com água estéril (solução salina) 
-Agitador de tubos 
-Pipetas esterilizadas de 1 ml 
-Espectrofotómetro 
 
Procedimento 
Ligar o espectrofotómetro e acertar o comprimento de onda a 640 nm; 
Transferir para a cuvete caldo não inoculado e acertar a absorvância a zero; 
Transferir as suspensões bacterianas para cuvetes do espectrofotómetro (pode ser necessário 
diluir as amostras); Proceder à leitura da absorvância (DO). 
 
 
Figura 8 – Avaliação do número de células por turbidimetria 
Resultados 
Relacionar os valores obtidos por contagem directa ao microscópio, por contagem em placa e por 
turbidimetria, para a mesma suspensão de células. 
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Tabelas de MacGrady para determinação do NMP de microrganismos 
- 3 tubos por diluição 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
000 0,0 120 1,1 221 3,0 311 7,5 
001 0,3 121 1,5 222 3,5 312 11,5 
010 0,3 130 1,6 223 4,0 313 16,0 
011 0,6 200 0,9 230 3,0 320 9,5 
020 0,6 201 1,4 231 3,5 321 15,0 
100 0,4 202 2,0 232 4,0 322 20,0 
101 0,7 210 1,5 300 2,5 323 30,0 
102 1,1 211 2,0 301 4,0 330 25,0 
110 0,7 212 3,0 302 6,5 331 45,0 
111 1,1 220 2,0 310 4,5 332 110,0 
 333 140,0 
 
- 5 tubos por diluição 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
Nº 
Caract. 
Nº 
Microrg. 
000 0,0 203 1,2 400 1,3 513 8,5 
001 0,2 210 0,7 401 1,7 520 5,0 
002 0,4 211 0,9 402 2,0 521 7,0 
010 0,2 212 1,2 403 2,5 522 9,5 
011 0,4 220 0,9 410 1,7 523 12,0 
012 0,6 221 1,2 411 2,0 524 15,0 
020 0,4 222 1,4412 2,5 525 17,5 
021 0,6 230 1,2 420 2,0 530 8,0 
030 0,6 231 1,4 421 2,5 531 11,0 
100 0,2 240 1,4 422 3,0 532 14,0 
101 0,4 300 0,8 430 2,5 533 17,5 
102 0,6 301 1,1 431 3,0 534 20,0 
103 0,8 302 1,4 432 4,0 535 25,0 
110 0,4 310 1,1 440 3,5 540 13,0 
111 0,6 311 1,4 441 4,0 541 17,0 
112 0,8 312 1,7 450 4,0 542 25,0 
120 0,6 313 2,0 451 5,0 543 30,0 
121 0,8 320 1,4 500 2,5 544 35,0 
122 1,0 321 1,7 501 3,0 545 45,0 
130 0,8 322 2,0 502 4,0 550 25,0 
131 1,0 330 1,7 503 6,0 551 35,0 
140 1,1 331 2,0 504 7,5 552 60,0 
200 0,5 340 2,0 510 3,5 553 90,0 
201 0,7 341 2,5 511 4,5 554 160,0 
202 0,9 350 2,5 512 6,0 555 180,0 
 
 
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Trabalho prático 6 
Avaliação do efeito de alguns factores físicos no crescimento microbiano 
O crescimento de um microrganismo é afectado pela disponibilidade de nutrientes e por um 
conjunto de factores físicos como a temperatura, o pH, a pressão osmótica e o potencial de 
oxidação/redução do meio. A temperatura é um dos factores que mais afecta o crescimento e a 
sobrevivência dos microrganismos. Cada espécie, em condições experimentais bem definidas, é 
caracterizada por três temperaturas cardeais – temperatura mínima, máxima e óptima de 
crescimento. Estes valores permitem agrupar os microrganismos em psicrófilos, mesófilos e 
termófilos e hipertermófilos. O comportamento dos microrganismos relativamente ao oxigénio 
disponível é heterogéneo, existindo microrganismos aeróbios e anaeróbios estritos, aeróbios 
facultativos, aerotolerantes e micro-aerofílicos. 
 
 
Figura 9 – Classificação dos microrganismos com base na temperatura óptima 
 
Objectivos: 
Avaliar o efeito dos factores físicos (temperatura e pH) no crescimento microbiano. 
 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
-Placas com meio de cultura 
-Tubos com meio de cultura com diferentes valores de pH – 3, 5, 7, 9 
 
 
 
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Procedimento 
1- Efeito do pH 
Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura a diferentes valores 
de pH, 
Incubar as placas a 30°C durante 3 dias; 
Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo. 
 
2- Efeito da temperatura 
Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura; 
Incubar a 5, 25 e 55°C durante 3 a 7 dias; 
Comparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo. 
 
Resultados 
Verificar os efeitos do pH e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos. 
 
 
 
Figura 10 – Classificação dos microrganismos com base nos valores de pH óptimo de crescimento 
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Trabalho prático 7 
Controlo do crescimento e morte dos microrganismos por métodos físicos 
A morte de microrganismos, isto é, a perda irreversível da viabilidade, é um aspecto fundamental 
no controlo de microrganismos no laboratório e na Indústria, Farmacêutica e Alimentar. A 
esterilização pode ser atingida por processos físicos e químicos. Entre os processos físicos pode 
utilizar-se o calor, a filtração e as radiações. 
 
Objectivos: 
Avaliar o efeito letal de alguns agentes físicos - temperatura e radiações UV. 
 
Material necessário 
-Culturas de microrganismos 
-Placas com meio de cultura 
- Tubos com meio de cultura líquido 
 
Procedimento 
1- Efeito da temperatura 
Inocular cada uma das culturas numa série de tubos com um meio de cultura; 
Introduzir os tubos num banho-maria a 70 °C durante 5, 10 e 15 minutos; 
Após o tempo referido, semear 0,1 ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas 
diferentes para uma placa; 
Incubar as placas a 30°C durante 3 dias; 
Observar o crescimento do microrganismo nas três condições. 
 
2- Efeito das radiações UV 
Semear 3 placas com o mesmo microrganismo; 
Retirar as tampas e colocar as placas sobre uma lâmpada UV, protegida com cartolina; 
Retirar uma placa ao fim de 10, 20 e 30 minutos; 
Incubar as placas 30°C durante 3 dias; 
Comparar o crescimento em cada placa. 
 
Resultados 
Verificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos 
microrganismos. 
Verificar o efeito das radiações no crescimento de cada um dos microrganismos. 
 
 
 
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Trabalho prático 8 
Actividade enzimática dos microrganismos 
As enzimas são proteínas promotoras de reacções químicas específicas na célula. Estes 
catalisadores permitem o transporte e utilização de nutrientes indispensáveis à síntese de material 
celular e à obtenção de energia. A utilização de um determinado substracto pode ser característica 
de uma dada espécie, permitindo a sua identificação. Algumas bactérias fermentam hidratos de 
carbono simples, produzindo ácidos, álcoois e gás como produtos finais. Outros utilizam moléculas 
mais complexas como a celulose e o amido. A capacidade de utilização de substratos específicos, 
pela análise dos metabolitos finais produzidos ou pela pesquisa de determinada enzima, associada 
à observação morfológica das células microbianas e às suas características culturais em meios de 
cultura sólidos e/ou líquidos, são alguns indicadores utilizados em Microbiologia na identificação de 
microrganismos. 
 
Objectivos: 
Avaliação de actividades enzimáticas em alguns microrganismos. Apresentação de alguns testes 
bioquímicos usados na detecção e ou identificação de alguns microrganismos 
 
1- Hidrólise de polímeros 
 Amilases 
 Proteases 
2- Reacções de fermentação 
 Fermentação de açúcares 
 Produção de sulfetos 
 Reacções ImVic 
3- Reacções respiratórias 
 Catalase 
 Citocromo oxidase 
4- Outras reacções 
 Urease 
 
1- Pesquisa de amilase 
Alguns microrganismos hidrolizam moléculas orgânicas de elevado peso molecular, como por 
exemplo o amido, utilizando os seus componentes (glucose e maltose) nos diversos processos 
metabólicos. Ao juntar-se uma solução de iodo a um meio de cultura com amido forma-se um 
complexo com cor azul se não tiver sido hidrolizado. Caso contrário, não há reacção com o iodo. 
 
 
 
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Material necessário 
-Culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis 
-Solução de iodo 
-Placas de Petri com meio de agar de amido 
 
Procedimento 
Inverter uma placa de Petri e dividi-la em duas secções com um marcador. 
Semear uma das secções com E. Coli e a outra com Bacillus subtilis; 
Identificar as secções; 
Incubar as placas a 37ºC durante 24 a 48 horas; 
 
Resultados: 
Após o aparecimento das colónias, colocar algumas gotas de solução de iodo e verificar o 
aparecimento ou não da cor azul. 
 
2- Fermentação de açúcares simples 
Os principais critérios fisiológicos de identificação de microrganismos assentam na fermentação e 
na assimilação de fontes de carbono. A fermentação de açúcares simples é avaliada em tubos com 
meio de cultura líquido, aos quais se adiciona o açúcar a testar. Para verificar a produção de gás é 
introduzido (antes da esterilização), um tubo Durham invertido. A produção de ácidos é 
confirmada pela alteração da cor do indicador. 
 
Material necessário 
-Culturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris; 
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e glucose (Com tubos Durham); 
-Tubosde Caldo com vermelho de fenol e lactose (Com tubos Durham); 
-Tubos de Caldo com vermelho de fenol e sacarose (Com tubos Durham); 
 
Procedimento 
Inocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios; 
Identificar cada um dos tubos com a espécie inoculada e com açúcar adicionado; 
Incubar as placas a 37ºC durante 24 horas; 
 
 
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Resultados: 
Tomar nota das reacções obtidas no quadro com base nos seguintes símbolos: 
A- produção de ácido; 
B- alcalinização do meio 
G- produção de gás 
N- sem modificação de cor do indicador 
 
Espécie Modo de utilização dos açúcares 
 Glucose Lactose Sacarose 
 
 
 
3- Reacções respiratórias 
Pesquisa de Catalase 
Este teste bioquímico é utilizado para comprovar a presença de catalase, enzima que destrói o 
peróxido de hidrogénio, originando H2O e O2. A maioria dos seres vivos possui catalase. 
 
Material necessário 
-Lâminas; 
-Culturas de Bacillus sp; 
-Culturas de Lactobacillus sp.; 
-Água oxigenada (3%); 
 
Procedimento: 
Colocar numa lâmina uma porção de cultura; 
Adicionar uma gota de água oxigenada a 3%; 
 
Resultados: 
Verificar se há ou não desprendimento gasoso; 
Tomar nota dos resultados obtidos em cada uma das espécies. 
 
Pesquisa do Citocromo oxidase 
A citocromo oxidase é uma enzima que transfere electrões para o O2 no final da cadeia de 
transporte de electrões. A detecção desta enzima é particularmente útil para fazer a distinção 
entre algumas espécies Gram negativo. Pseudomonas aeruginosa de Escherichia coli, por exemplo. 
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A presença de citocromo oxidase é detectada pela oxidação de um receptor artificial de electrões 
(p-fenilenodiamina). 
 
Material necessário 
-Cultura microbiana a testar 
-Papel de filtro 
-Tetrametil-parafenildiamina.HCl (1% W/V em água). 
 
Procedimento 
Misturar a cultura em estudo com uma solução de tetrametil-parafenildiamina.HCl numa folha de 
papel de filtro. 
Resultados: 
Verificar a alteração da cor. Este indicador é incolor na forma reduzida e adquire uma cor púrpura 
na forma oxidada (resultado positivo) 
 
4- Pesquisa de outras enzimas 
Pesquisa de Urease 
Alguns microrganismos utilizam a ureia como fonte de azoto. A sua hidrólise origina duas 
moléculas de amónia e a libertação de uma molécula de CO2. A enzima é detectada pela 
modificação da cor do indicador provocada pelo aumento de pH (vermelho de fenol, a pH 6,4 tem 
cor amarela e a pH 8,2 tem cor violácea). 
 
Material necessário 
-Culturas de Proteus vulgaris e Escherichia coli; 
-Tubos com Agar de ureia; 
 
Procedimento 
Inocular um tubo com ureia agar com Proteus vulgaris e outro com Escherichia coli ; Incubar a 37 
˚C durante 24 horas. 
Resultados: 
Verificar a alteração da cor do meio e preencher o quadro: 
Espécie Cor inicial do meio Cor final do meio Urease 
 
 
Considera-se reacção positiva o aparecimento de uma cor rosa forte. 
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Trabalho prático 9 
Avaliação da contaminação fecal de águas 
A pesquisa periódica de microrganismos fecais numa rede de abastecimento de águas é essencial 
para se verificar a pureza da água. Escherichia coli é um bom indicador da contaminação fecal – é 
fácil de identificar, é hospedeiro habitual do intestino e não aparece normalmente na água. 
Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos não-
esporulados, Gram negativo, aneróbios facultativos que fermentam a lactose com produção de 
gás. 
 
Objectivos: 
Pesquisa de coliformes em águas e determinação do NMP de coliformes 
Pesquisa de Escherichia coli 
 
Material necessário: 
-Tubos com caldo de lactose 
-Placas com Agar Endo 
-Tubos com caldo MR-VP 
-Tubos com água peptonada 
-Tubos com Agar de Citrato-Simmons 
-Filtros de 0,45 
 
1- Pesquisa de Coliformes: 
1.1 Teste presuntivo: pesquisa de fermentadores de lactose 
 
Procedimento 
Pipetar 1 ml da amostra de água para cada um dos tubos com caldo de lactose, com tubo Durham 
invertido. Incubar a 35 ºC durante 24 a 48 horas. 
 
Resultados: 
Observação dos tubos ao fim de 24 a 48 horas. A presença de gás em pelo menos 1/4 do tubo 
Durham é indicativa da presença de coliformes. Neste caso fazer a determinação do NMP de 
coliformes por 100 ml de água com base nas tabelas de MacGrady. 
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1.2 Pesquisa de Escherichia coli (membrana filtrante) 
 
Procedimento 
Filtrar 100 ml da amostra de água para placas de Agar Endo; Incubar a 44 ºC durante 24 a 48 
horas. 
 
Resultados: 
O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de Escherichia coli. Deverão ser 
efectuados os testes IMViC. 
 
2- Teste de confirmação de fermentadores de lactose 
 
Procedimento 
Semear 0,1 ml dos tubos positivos para placas com Agar Endo; 
Incubar a 35 ºC durante 24 horas; 
 
Resultados: 
O aparecimento de colónias carmim é indicativo da presença de coliformes não ficando 
estabelecido contudo que seja Escherichia coli. Poderá ser Enterobacter aerogenes. 
 
3- Testes IMViC 
A distinção entre as duas espécies, Escherichia coli e Enterobacter aerogenes pode ser feita 
efectuando um conjunto de testes designados por IMViC: o I de Indol, o M de Methyl-red, o V de 
Voges-Proskauer e o C de Citrato. 
 
Espécies Indol Methyl-red Voges-proskauer Citrato 
Escherichia coli + + - - 
E. aerogenes - - + + 
 
 
3.1- Pesquisa da formação de indol a partir do triptofano 
Num meio de cultura contendo triptofano, algumas bactérias com triptofanase produzem indol. O 
indol é detectado pelo reagente de Kovacks. Este teste permite distinguir Escherichia coli, que tem 
reacção positiva, de Enterobacter que tem reacção negativa. 
 
Procedimento 
Pipetar 0, 1 ml da amostra de água para um tubo com água peptonada; 
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Incubar a 30 ºC durante 48 horas; 
 
Resultados: 
A reacção é positiva quando aparece um anel vermelho à superfície resultante da reacção do p-di-
metil-aminobenzaldeído (reagente de Kovacs) com o indol; a reacção é negativa quando após a 
adição do reagente o anel se mantém amarelo/alaranjado. 
 
3.2- Formação de ácidos por fermentação da glucose 
 Num meio de cultura contendo glucose, as Enterobacteriaceae produzem ácidos a partir do 
piruvato, ácido acético, fórmico, láctico e etanol (fermentação ácido-mista), o que vai provocar 
uma acidificação do meio. A fermentação da glucose com produção de ácidos provoca a redução 
de pH e a alteração da cor do indicador de vermelho de metilo (MR - Methyl red). 
 
Procedimento 
Pipetar 0,1 ml de amostra de água para um tubo com caldo MR-VP; 
Incubar a 37ºC durante 5 dias. 
 
Resultados: 
Confirmar o crescimento no meio de cultura. Adicionar ao meio inoculado, algumas gotas de 
vermelho de metilo. Se houver produção de ácidos, há um abaixamento de pH para valores 
inferiores a 4,4. Quando se adiciona o indicador de pH (vermelho de metilo), a pH 4,4 fica 
vermelho e a pH 6,2 amarelo. 
 
3.3- Fermentação da glucose e produção de acetoína a partir do piruvato (Teste Voges 
Proskauer) 
No mesmo meio de cultura contendo glucose, algumas espécies de Enterobacteriaceaeproduzem 
a partir do piruvato, para além dos ácidos referidos anteriormente, outros metabolitos como a 
acetoína. Se existir acetoína no meio, a adição de α-naftol e hidróxido de potássio (10%), tornam 
o meio avermelhado - teste Voges Proskauer (VP) positivo. 
 
Procedimento 
Pipetar 0,1 ml da amostra de água para um tubo com caldo MR-VP 
Incubar a 37 ºC durante 5 dias. 
 
Resultados: 
Confirmar o crescimento no meio. Adicionar ao meio, α-naftol a 6% e hidróxido de potássio 
(40%). Misturar bem. Se existir acetoína no meio, a adição de α-naftol e hidróxido de potássio, 
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tornam o meio avermelhado (reacção positiva). Se o meio de cultura mantiver a cor original a 
reacção é negativa. 
 
3.4- Utilização do citrato como fonte de carbono e energia 
O meio de Citrato-Simmons contém citrato e azul de bromotimol como indicador de pH. Nas 
Enterobacteriaeceae o desprendimento de CO2, reagindo com os catiôes Na+ existentes no meio, 
vai provocar um aumento do pH visível pela modificação da cor do indicador. 
 
Procedimento 
Repicar a amostra para placa com Agar de Citrato-Simmons; 
Incubar a 37 ºC durante 5 dias; 
 
Resultados: 
A utilização de citrato provoca uma alcalinização do meio que é detectada pela modificação da cor 
do indicador (azul de bromotimol). Verificar se houve ou não modificação da cor do meio (verde 
para azul). 
Escherichia coli - reacção negativa; Enterobacter, Salmonella - reacção positiva 
 
Notas: 
A identificação de Enterobacteriaceae pode ser efectuada através de galerias API 20E que é uma versão miniaturizada dos 
testes convencionais. Este sistema utiliza uma estrutura plástica com 20 compartimentos separados que consistem em 
micro tubos contendo meios desidratados. A inoculação é efectuada por introdução da suspensão do organismo nos 
microtubos com uma pipeta de Pasteur. Para se obter anaerobiose colocam-se algumas gotas de óleo mineral em cada um 
dos tubos. Após 18 a 24 horas registam-se os resultados positivos, obtém-se um número com 7 a 9 dígitos a partir do qual, 
através de um programa informático, se determina o nome do microrganismo em causa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Trabalho prático 10 
Avaliação da eficácia a antibacterianos: antibióticos 
Os antibióticos são compostos químicos que podem ser administrados em doses sub-terapêuticas 
ou de forma terapêutica em Medicina Humana e Animal. Uma vez que a célula bacteriana é uma 
célula procariota, os antibióticos usados na terapêutica devem explorar as diferenças bioquímicas 
entre as células bacterianas e as células hospedeiras. Os antimicrobianos são um grupo bastante 
heterogéneo, existindo antibióticos que actuam na parede celular e outros durante a síntese 
proteica, provocando a lise das células e, portanto, matando as bactérias (efeito bactericida) ou 
inibindo a sua multiplicação (efeito bacteriostático). 
 
Objectivos: 
Determinar o fenótipo a diferentes grupos de antibióticos 
Analisar o perfil de susceptibilidade segundo as normas do CLSI 
 
Material necessário: 
- Zaragatoas 
- Pinças estéreis 
- Ansas 
- Régua 
- Discos de antibióticos (Oxoid) 
- Meio de Cultura (Muller-Hinton agar) 
- Soro fisiológico 
- Para testar a eficácia aos antibióticos serão utilizadas três espécies bacterianas (E. coli, 
Pseudomonas spp. - Gram-negativo e Enterococcus faecalis - Gram-positivo). 
 
Procedimento 
Técnica de Kirby-Bauer 
Preparar uma suspensão bacteriana de cada uma das espécies em estudo, a partir de 3 – 4 
colónias em soro fisiológico estéril (A suspensão deve ter uma turvação equivalente a 0,5 da escala de 
MacFarland) 
Mergulhar uma zaragatoa na suspensão bacteriana retirando o excesso; Semear placas de agar 
Mueller-Hinton; 
Aplicar os discos dos antibióticos a testar (utilizar o “dispenser” como se representa na Figura) 
sobre a superfície do meio de cultura, após a secagem do inóculo; 
Incubar a 37 °C, durante 24 horas. 
 
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Resultados: 
Com uma régua ou craveira medir os diâmetros dos halos de inibição para cada antibiótico. 
Classificar de acordo com as normas do CLSI, 2006 (ex: NCCLS National Committee for Clinical 
Laboratory Standards). Assim, a medida do halo de inibição será comparada com os valores da 
tabela, onde a bactéria é classificada, nas categorias de sensível (S), intermédia (I) ou resistente 
(R). 
 
 
Figura 11 – Representação da aplicação de discos de antibióticos num meio de cultivo inoculado com uma 
estirpe em análise (à esquerda). Resultados obtidos após crescimento bacteriano (à direita). 
 
 
Avaliação da susceptibilidade a antibióticos 
Amostra A (Gram -)_________________________________________________________ 
 
 
Antibiótico Diâmetro do halo Classificação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Amostra B (Gram -)_________________________________________________________ 
 
 
Antibiótico Diâmetro do halo Classificação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Amostra (Gram +)____________________________________________________________ 
 
Antibiótico Diâmetro do halo Classificação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Trabalho prático 11 
Simbiose de microrganismos com plantas 
A disponibilidade de azoto no solo é o maior factor limitante na Agricultura, apesar da atmosfera 
ser constituída por 80% de azoto. A molécula de azoto é quimicamente muito estável e apenas 
alguns procariotas têm capacidade de a reduzir a uma forma biologicamente assimilável. A 
associação Rhizobium x leguminosa é o mais eficiente sistema de fixação de azoto atmosférico. As 
espécies do género Rhizobium são bactérias do solo capazes de provocarem o aparecimento de 
órgãos especializados nas raízes das plantas, os nódulos, nos quais ocorre a redução do azoto 
(Figura 12). 
As espécies do género Rhizobium apresentam a forma de bacilos curtos, isolados ou aos pares, 
não esporulados, Gram negativo, móveis por flagelos polares ou peritriquiais, apresentando 
grânulos de poli-β-hidroxibutirato nas culturas mais envelhecidas. No interior do nódulo as células 
apresentam formas diversificadas designando-se por bacteróides. 
 
Mecanismo de infecção e formação do 
nódulo 
 
 
Legohemoglobina no nódulo 
 
Figura 12 – Mecanismo de formação do nódulo nas leguminosas 
 
Objectivos: 
Observação da nodulação em diferentes leguminosas. Observação dos bacteróides. 
Isolamento de Rhizobium a partir dos nódulos. 
 
Material necessário 
-Microscópio 
-Lâminas e lamelas 
-Caixas de Petri esterilizadas 
-Ansa, Pinça e tesoura 
-Álcool a 70% 
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-Água esterilizada distribuída em tubos com 20ml 
-Solução de lixívia a 1% 
-Placas com Agar de Manitol-levedura 
 
1- Observação da nodulação em diferentes leguminosas 
Identificar as plantas; 
Cortar a parte aérea da planta; 
Lavar o sistema radicular em água corrente; 
Colocar sobre uma folha depapel; 
Observar e tomar nota: 
 
Plantas Forma dos 
Nódulos 
Disposição ao longo do 
sistema radicular 
Constituição interna Observações 
 
 
 
 
 
2- Observação dos bacteróides 
Cortar com uma tesoura várias secções da raiz de 1cm que contenham nódulos saudáveis (rosa); 
Mergulhar as secções dentro de uma caixa de Petri com lixívia a 1%, durante 15 min.; 
Retirar as secções da solução e mergulhar em 20 ml de etanol a 70% durante 1 min.; 
Retirar as secções do etanol e mergulhar em 20 ml de água estéril durante 1 min.; 
Repetir as lavagens com água estéril pelo menos 3 vezes; 
Transferir um dos nódulos para uma caixa de Petri estéril e esmagar com uma vareta de vidro; 
Observar o suco extraído ao microscópio; 
Semear por riscado à superfície de uma placa de Petri com meio de Manitol levedura; 
Incubar as placa de Petri a 25˚C durante 3 a 5 dias. 
 
Resultados: 
Tomar nota e desenhar as formas das células observadas ao microscópio directamente do nódulo; 
Registar as características das colónias formadas no meio de manitol levedura simples e com 
adição dos indicadores - vermelho do Congo e azul de Bromotimol; 
Retirar uma porção de uma colónia para uma lâmina e misturar com uma gota de água estéril; 
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Fazer o esfregaço e proceder à coloração de Gram; 
Observar as preparações ao microscópio; 
Registar a morfologia celular e a reacção à coloração; 
 
BIBLIOGRAFIA 
 
Benson, H. 1994. Microbiological applications. 6th ed. WCB Publishers, Dubuque, IA 52001. 
Martinko, J. Madigan, M. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition. Prentice-Hall Inc., 
New Jersey. 
Canas-Ferreira, W. e J.C.F. de Sousa, 1998. microbiologia. Vol 1. Lidel Editora, Lisboa. 
Schelegel, H. 1993. General Microbiology. 7th ed. Cambridge University Press, Cambridge 
Stanier, R., E. Adelberg,J. Ingraham e M. Wheelis 1979. Introduction to the microbial world. 
Prentice-Hall Inc., New Jersey. 
Wheelis, M. e W.Segel 1979. Introduction to the microbial world – Laboratory manual. Prentice-
Hall Inc., New Jersey. 
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ANEXO 1 - Meios de cultura 
 
Meio de agar nutritivo: 
• Extracto de carne ..................................... 3 g 
• Peptona ................................................... 5 g 
• Agar ........................................................ 15 g 
• Água destilada ....................................... 1000 ml 
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos 
 
Caldo nutritivo: 
• Extracto de carne ..................................... 3 g 
• Peptona ................................................... 5 g 
• Água destilada ....................................... 1000 ml 
Acertar a pH final 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos 
 
Agar de dextrose Sabouraud 
• Peptona ................................................... 10 g 
• Dextrose .................................................. 40 g 
• Agar ........................................................ 15 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 5,6. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Y Malte Agar 
• Extracto de malte ..................................... 3 g 
• Extracto de levedura ................................. 3 g 
• Peptona ................................................... 5 g 
• Glucose ................................................... 10 g 
• Agar ......................................................... 20 g 
• Água destilada ....................................... 1000 ml 
Acertar a pH 5,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Y Malte Caldo 
• Extracto de malte ..................................... 3 g 
• Extracto de levedura ................................. 3 g 
• Peptona ................................................... 5 g 
• Glucose ................................................... 10 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 5,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Agar de amido 
• Extracto de carne ..................................... 3 g 
• Amido solúvel ........................................... 10 g 
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• Agar ........................................................ 15 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Caldo com vermelho de fenol – meio base 
• Peptona ................................................... 10 g 
• Extracto de carne ..................................... 1 g 
• Cloreto de sódio ....................................... 5 g 
• Vermelho de fenol ..................................... 0,018 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 7,2. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
Nota: para avaliar a fermentação de açúcares adicionar, separadamente, 5 g/l de glucose, lactose ou 
sacarose. 
 
Agar de ureia 
• Peptona ................................................... 1 g 
• Dextrose ................................................... 1 g 
• Cloreto de sódio ....................................... 5 g 
• Fosfato de potássio .................................... 2 g 
• Ureia ....................................................... 20g 
• Vermelho de fenol ..................................... 0,012 g 
• Água destilada ..................................... 100 ml 
Acertar a pH 6,8. Esterilizar a mistura por filtração (A). Esterilizar a mistura de 15 g de agar com 900 ml de 
água a 121˚C durante 15 minutos (B). Deixar arrefecer B e adicionar os 100 ml de ª Distribuir em tubos e 
inclinar. 
 
Caldo de lactose 
• Extracto de carne ...................................... 3 g 
• Peptona .................................................... 5 g 
• D-lactose ................................................. 5 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 6,9. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Água peptonada 
• Peptona .................................................... 10 g 
• Cloreto de sódio ....................................... 5 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 7,2. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
Nota: Para pesquisar a fermentação de açúcares adicionar 1,8 ml de vermelho de fenol. 
 
Agar Endo 
• Peptona ................................................... 10 g 
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• D-lactose .................................................. 10 g 
• Sulfito de sódio ........................................ 2,5 g 
• Fosfato de potássio .................................... 3,5 g 
• Agar ........................................................ 15 g 
• Fucsina básica ........................................... 0,5 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 7,5. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Agar de Citrato- Simmons 
• Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g 
• Cloreto de sódio ........................................ 5 g 
• Fosfato de amónio .................................... 1g• Fosfato de potássio .................................... 1g 
• Citrato de sódio ......................................... 2 g 
• Agar ........................................................ 15 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Caldo MR-VP 
• Peptona .................................................... 7 g 
• Fosfato de potássio .................................... 5 g 
• Dextrose ................................................... 5 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 6,8-7,0. Distribuir em tubos. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Agar de Manitol-levedura 
• Fosfato de potássio .................................... 0,5 g 
• Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g 
• Cloreto de sódio ........................................ 0,1 g 
• Manitol ..................................................... 10 g 
• Extracto de levedura ................................. 0,4 g 
• Agar ........................................................ 15 g 
• Água destilada ..................................... 1000 ml 
Acertar a pH 6,8-7,0. Esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 Nota: Poderão ser adicionados, separadamente, os seguintes corantes: Vermelho do Congo (1%) ou Azul de 
Bromotimol (0,5%). 
 
Meio de LB (Luria-Bertani Medium) 
• Triptona 10 g 
• Extracto de levedura 5 g 
• NaCl 10 g 
• Água destilada 1000 ml 
 
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Agitar até à completa dissolução. Ajustar o pH a 7,0 com 5N NaOH (~0.2ml). Esterilizar em 
autoclave durante 15 minutos a 121ºC. 
 
Meio de LBss (Luria-Bertani semi-sólido) 
• Triptona 10 g 
• Extracto de levedura 5 g 
• NaCl 10 g 
• Agar 7 g 
• Água destilada 1000 ml 
LBss = LB + 0.7% Agar 
 
Meio de LBs (Luria-Bertani sólido) 
• Triptona 10 g 
• Extracto de levedura 5 g 
• NaCl 10 g 
• Agar 15 g 
• Água destilada 1000 ml 
LBs = LB + 1.5% Agar 
 
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ANEXO 2 – Corantes e soluções 
 
Solução de azul de metileno 
• azul de metileno ....................................... 0,3 
• Álcool etílico a 95 % ............................... 30 ml 
• Hidróxido de potássio 1% ........................ 1 ml 
 
Solução de Cristal de violeta 
• Cristal de violeta ....................................... 0,5 g 
• Água destilada ....................................... perfazer a 100 ml 
 
Soluto de Lugol 
• Cristais de iodo ......................................... 1,0 g 
• Iodeto de potássio .................................... 2,0 g 
• Água destilada ....................................... 300 ml 
 
Solução de Safranina 
• Safranina .................................................. 2,5 g 
• Álcool etílico a 95% ........................... 10 ml 
Dissolver a safranina em etanol. Perfazer a 100ml em água destilada. 
 
Solução de Fucsina 
• Fucsina básica ........................................... 1 g 
• Etanol ..................................................... 10 ml 
• Fenol 5% (solução aquosa) ..................... 100 ml 
Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Solução de Nigrosina 
• Nigrosina ................................................. 10 g 
• Água destilada .................................. perfazer a 100 ml 
Filtrar. 
 
Solução de verde malaquite 
• Verde malaquite ....................................... 5 g 
• Água destilada .................................. perfazer a 100 ml 
Filtrar. 
 
Solução de iodo 
• Cloreto de sódio ....................................... 2,25 g 
• Cloreto de cálcio ....................................... 0,12 g 
• Cloreto de potássio .................................... 0,105 g 
• Bicarbonato de sódio ................................ 0,05 g 
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• Água destilada ....................................... perfazer a 1 L 
 
Solução de tetrametil-parafenildiamina.HCl 
• Tetrametil-parafenildiamina.HCl ............. 0,1 g 
• Água destilada ....................................... até 10 ml 
 
Solução de vermelho de metilo 
• Vermelho de metilo ................................... 0,1 g 
• etanol ....................................................... 300 ml 
• Água destilada ....................................... 200ml 
 
Reagente de Kovacs 
• Álcool amílico .......................................... 150 ml 
• p- dimetil-aminobenzaldeído ....................... 10 g 
• Ácido clorídrico ....................................... 50 ml 
Dissolver o aldeído no álcool, a 60 C, deixar arrefecer e adicionar o ácido gota a gota. Guardar no frigorífico. 
 
Solução de α-Naftol 
• α-Naftol .................................................... 5 ml 
• Álcool etílico a 95% ........................... perfazer a 100 ml 
 
Solução salina de Ringer 
• Cloreto de sódio ....................................... 2,25 g 
• Cloreto de cálcio ....................................... 0,12 g 
• Cloreto de potássio .................................... 0,105 g 
• Bicarbonato de sódio ................................ 0,05 g 
• Água destilada ....................................... perfazer a 1 L 
Distribuir em frascos e esterilizar a 121˚C durante 15 minutos. 
 
Solução de lactofenol-azul de algodão 
lactofenol 
• Ácido láctico ............................................. 100 ml 
• fenol ....................................................... 100 g 
• glicerol ..................................................... 100 ml 
• Água destilada ....................................... 100 ml 
Dissolver o fenol em água, sem aquecer. Adicionar depois o ácido láctico e o glicerol. 
 
azul de algodão 
• sol. Saturada de azul de algodão ................ 10 ml 
• glicerol ..................................................... 10 ml 
• Água destilada ....................................... 80 ml 
Misturar em partes iguais o lactofenol e o azul de algodão. 
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Corantes (Coloração de Gram variante de Chan) 
A - Solução de cristal de violeta 
• Cristal de violeta ........................................... 10 g 
• Oxalato de amónio ......................................... 4 g 
• Etanol ........................................................... 100 ml 
• Água destilada ............................................... 400 ml 
 
B - Solução de iodo 
• Iodo ............................................................ 1 g 
• Iodeto de potássio ........................................ 2 g 
• Etanol .......................................................... 25 ml 
• Água destilada .............................................. 100 ml 
 
C - Álcool iodado 
• Solução de iodo ............................................ 5 ml 
• Etanol .......................................................... 95 ml 
 
D - Safranina 
2,5% de safranina em álcool .......................... 10 ml 
Água destilada .............................................. 100 ml 
 
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