Estudo de fatores de virulência em estafilococos coagulase 5

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Estudo de fatores de virulência em estafilococos coagulase-negativos isolados de recém-nascidos
Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha I, 1 ; Ligia Maria Suppo de Souza Rugolo II ; Carlos Alberto de Magalhães Lopes I
I Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências 
II Departamento de Pediatria, Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista, Unesp, 18618-000 Botucatu, SP, Brasil
ABSTRATO
Os estafilococos coagulase-negativos (SNC) foram identificados como agentes etiológicos em várias infecções e atualmente são os microorganismos mais freqüentemente isolados em infecções nosocomiais.No entanto, pouco se sabe sobre os fatores de virulência produzidos pelo SNC que contribuem para a patogênese das infecções causadas por esses microrganismos. O estudo do SNC isolado de processos infecciosos de recém-nascidos hospitalizados na Unidade Neonatal do Hospital da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp, indicou Staphylococcus epidermidis como a espécie mais freqüentemente isolada (77,8%), que também foi associada a situações clinicamente significativas. A análise dos fatores de virulência revelou a produção de limo em 20 (17,1%) de todas as amostras de SNC isoladas e a síntese de um amplo espectro de enzimas e toxinas, incluindo hemolisinas (19,6%), lipase (17,1%), lecitinase (3,4% ), DNAse (15,4%), termonuclease (7,7%) e enterotoxina A, B ou C (37,6%). Levando em consideração que a importância etiológica do SNC freqüentemente foi negligenciada, a presente investigação confirmou que esses microorganismos não devem ser ignorados ou classificados como meros contaminantes.
Palavras-chave: estafilococos coagulase-negativos - fatores de virulência - limo - enzimas - toxinas
Poucos relatórios de infecções com estafilococos coagulase-negativos (SNC) foram publicados antes da década de 1970; clínicos e microbiologistas consideraram que eram contaminantes de amostras clínicas, sendo Staphylococcus aureus a única espécie patogênica no gênero Staphylococcus (Kloos & Bannerman, 1995). Esta distinção, amplamente utilizada para o diagnóstico clínico, representa um desafio em relação ao papel desses microrganismos em processos infecciosos.
Atualmente, o SNC é considerado basicamente microorganismos oportunistas que prevalecem em numerosas condições orgânicas, produzindo infecções graves (Kloos & Ban-nerman 1995, Lark et al., 2000). O reconhecimento do SNC como agentes etiológicos também pode ser devido à valorização deste grupo de organismos como agentes patogênicos oportunistas e ao uso crescente de procedimentos invasivos, como cateteres intravasculares e interferência protética. Os dados obtidos entre 1995 e 1998 pelo programa Vigilância e Controle de Patógenos de Importância Epidemiológica (SCOPE) demonstraram que o SNC são os agentes etiológicos mais freqüentemente encontrados em bacteriemias nosocomiais nos Estados Unidos (Edmond et al., 1999).
Os fatores de virulência produzidos pelo SNC e como eles contribuem para a patogenicidade de infecções associadas a corpos estranhos estão atualmente sob investigação. A evidência indica que a patogenicidade pode estar relacionada à produção de um polissacarídeo extracelular, conhecido como lodo, que permite que esses microrganismos adiram a superfícies plásticas lisas, cateteres colonizadores, válvulas cardíacas próteses, pacemakers e próteses articulares (Vogel et al., 2000).
A diferenciação entre cepas virulentas e não virulentas tem sido difícil uma vez que os fatores de virulência desses microrganismos ainda não estão bem definidos (Gemmell, 1987). De acordo com este autor e com Koneman et al.(1997), o SNC produz outros fatores de virulência, como hemolisinas, lipases, proteases e toxinas.
Com base nas considerações acima, decidimos avaliar esta questão em nossa instituição, sendo os principais objetivos a identificação de espécies do SNC isoladas de casos clínicos de recém-nascidos hospitalizados na Unidade Neonatal do Hospital da Faculdade de Medicina de Botucatu, Unesp, Botucatu, Brasil, e a determinação da produção de limo, enzimas e toxinas pelos diferentes isolados.
MATERIAIS E MÉTODOS
Organismos - isolados do SNC foram obtidos de 107 recém-nascidos hospitalizados na Unidade Neonatal do Hospital Universitário de Ensino, Unesp, Botucatu, entre 1990 e 1996. Os procedimentos utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética da Escola.
A identificação de SNC - SNC foi isolada em agar de sangue. As colónias bacterianas foram coradas pelo método de Gram e submetidas a testes de catalase e coagulase (Koneman et al., 1997). O gênero Staphylococcus foi diferenciado do Micrococcus pelo teste de oxidação e fermentação da glicose e pela resistência à bacitracina (0,04 U) e sensibilidade à furazolidona (100  g) conforme descrito por Koneman et al. (1997).
As espécies do SNC foram identificadas como descrito por Kloos e Schleifer (1975), Kloos e Bannerman (1995), e Cunha et al. (2004). Foram utilizados os seguintes testes: utilização de xilose, arabinose, sacarose, trealose, manitol, maltose, lactose, xilitol, ribose e frutose, caracterização de hemólise, redução de nitrato, urease, descarboxilase ornitina e resistência à novobiocina.
As seguintes cepas internacionais de referência do SNC foram utilizadas como controles: S. epidermidis (ATCC 12228), S. simulans (ATCC 27851), S. warneri (ATCC 10209), S. xylosus (ATCC 29979) e S. saprophyticus (ATCC 15305 ).
Relevância clínica - Os dados foram obtidos através da análise dos prontuários médicos dos pacientes. Os dados relativos aos fatores de risco da infecção perinatal foram revisados, incluindo ruptura prolongada da membrana (> 24 h), idade gestacional, peso ao nascer e procedimentos invasivos, como cateterismo umbilical arterial ou venoso, cateterismo central venoso ou periférico, ventilação mecânica, procedimentos cirúrgicos, diálise peritoneal, nutrição parenteral, drenagem de tórax e shunts ventriculoperitoneais. A possibilidade de remoção de corpos estranhos durante a infecção pelo SNC também foi examinada.
A evolução da situação clínica do recém-nascido durante a semana anterior e posterior ao isolamento do SNC foi analisada, com ênfase no diagnóstico e nos prontuários clínicos sugestivos de infecção do SNC, caracterizados por sintomas insidiosos e não específicos, afetando mais freqüentemente a saúde geral, instabilidade térmica, e apnéia (Hall et al., 1987).
Com a progressão da situação clínica, as alterações na contagem sanguínea e / ou positividade para a proteína C-reativa foram determinadas no momento do isolamento do SNC. Os parâmetros hematológicos normais foram os propostos por Manroe et al. (1979). As mortes observadas foram atribuídas à infecção do SNC ocorrendo nas primeiras 72 h após o isolamento do agente e possível associação com SNC entre os dias 4 e 7 após o isolamento do SNC.
Outro aspecto investigado e considerado relevante foi o uso prévio da antibioticoterapia, incluindo antibióticos adequados para o SNC após o diagnóstico bacteriológico, bem como o uso de antibióticos específicos, como vancomicina, oxacilina ou teicoplanina.
O SNC isolado no presente estudo foi classificado como "significativo" e "contaminante" de acordo com os critérios CDC modificados (Garner et al., 1996), da seguinte forma:
"Significativo" - SNC isolado de recém-nascidos que apresentou três ou mais das seguintes características: fatores de risco para infecção, alterações clínicas ou hematológicas e terapia antibiótica adequada. Os isolados também foram considerados significativos em pacientes que apresentaram apenas duas dessas características e que morreram sem receber antibióticos adequados.
"Contaminante" - SNC isolado de recém-nascidos que apresentaram apenas fatores de risco para infecção e / ou apenas um dos outros aspectos (alterações clínicas ou hematológicas ou terapia antibiótica adequada). Isolados de recém-nascidos que apresentaram os três aspectos, mas mostraram um curso satisfatório da infecção sem a administração de antibióticos adequados também foram consideradoscontaminantes. O isolamento de outro agente etiológico de fluidos internos e corpos estranhos no momento do isolamento do SNC também foi usado como critério para a classificação da contaminação.
Estudo da produção de limo - A produção de limo foi analisada como descrito por Christensen et al. (1982).
Determinação da produção de hemolisina - A produção de hemolisinas e toxinas citolíticas foi determinada em placas contendo base de agar de sangue consistindo de 5% de sangue de coelho e 5% de sangue de ovelha incubados a 37 ° C durante 24 h. Um resultado positivo foi indicado pela formação de zonas de hemólise em torno das colônias isoladas.
Determinação da lipase e da lecitinase - A atividade lipolítica (Jessen et al., 1959) foi determinada em placas contendo base de agar no sangue enriquecida com 0,01% de CaCl2 . 2H2O e 1% de Tween 80. Um resultado positivo foi definido como a formação de opacidade ao redor as colônias após incubação a 37 ° C durante 18 h, seguido de incubação durante 24 h à temperatura ambiente. A produção de lecitinase (Owens 1974) foi estudada no meio de Baird-Parker. Um resultado positivo foi indicado pela formação de um halo opaco em torno das colônias.
A determinação de DNAse e TNAse - Nuclease (DNAse) e a termonuclease (TNAse) foram determinadas pela técnica de difusão de ágar de O-DNA de azul de toluidina metachromatic de acordo com Lachica et al. (1971). Os resultados positivos foram interpretados comparando os halos obtidos com a estirpe de referência de S. aureus(ATCC 25923), DNAse e TNAse positiva.
Os sobrenadantes de cultura obtidos pelo método de cultura do saco (Donnelly et al., 1967), como descrito abaixo, também foram testados para a produção de DNAse e TNAse.
Produção de toxinas - O perfil toxigênico dos isolados foi determinado usando o método de cultivo do saco da produção de toxina (Donnelly et al., 1967). Os sobrenadantes de cultura obtidos foram armazenados a -20 ° C até o momento da utilização.
Detecção de enterotoxinas e TSST-1 - Enterotoxinas e toxina de síndrome de choque tóxico 1 (TSST-1) foram detectadas pelo ensaio de aglutinação de látex passivo reverso (RPLA) como descrito por Shingaki et al. (1981). Os kits SET-RPLA-T900 e TST-RPLA-TD940 (Oxoid Diagnostic Reagents) foram utilizados para a detecção de enterotoxina A (SEA), enterotoxina B (SEB), enterotoxina C (SEC) e enterotoxina D (SED) e de TSST-1, respectivamente. O sobrenadante de cultura foi previamente tratado com soro de coelho normal a 5% (v / v) ou IgG de coelho purificado a 5% para evitar a ocorrência de reacções inespecíficas (Pereira et al., 1997). As amostras que apresentaram reações inespecíficas mesmo após esses procedimentos foram filtradas através de uma membrana Millipore (8  m) e, se necessário, diluídas 1:10 com tampão fosfato 0,02 M em NaCl a 0,9%, pH 7,4.
As seguintes cepas internacionais de referência do SNC foram utilizadas como controles: S. aureus (ATCC 13565, produtor de SEA), S. aureus (ATCC 14458, produtor SEB), S. aureus (ATCC 19095, produtor SEC) e S. aureus(ATCC 23235, produtor SED).
Análise estatística - Os dados foram analisados ​​pelo teste  2 ou o teste exato de Fisher, com n <20. O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi utilizado para a análise do peso ao nascer do nascimento e idade. O nível de significância foi definido em p <0,05 para todos os testes.
RESULTADOS
Organismos - Um total de 117 CNS foram isolados de diferentes materiais coletados de 107 recém-nascidos.Sessenta isolados foram obtidos a partir de hemoculturas coletadas entre 1990 e 1996, 41 isolados eram de corpos estranhos (30 de dicas de cateter, 10 de cânula dicas, 1 de dica de drenagem de tórax), 13 de secreções (2 secreções de drenagem, 5 secreções gástricas, 6 secreções traqueais) e três da urina, todos obtidos entre 1994 e junho de 1996.
Identificação do SNC - S. epidermidis foi a espécie do SNC mais freqüentemente isolada, correspondendo a 91 (77,8%) isolados. As restantes espécies foram distribuídas entre S. haemolyticus (7 isolados, 6%), S. lugdunensis(7 isolados, 6%), S. hominis (5 isolados, 4,3%), S. simulans (4 isolados, 3,4%), S. warneri (2 isolados, 1,7%) e S. xylosus (1 isolado, 0,8%).
Relevância clínica - Dos 60 isolados de cultura de sangue, 35 (58,3%) foram interpretados como significativos e 25 (41,7%) como contaminantes. Dos 41 CNS isolados de corpos estranhos, 21 (51,2%) foram considerados significativos, incluindo 14 isolados de pontas de cateter (66,7%), seis de dicas de cânula (28,6%) e um de dica de drenagem de caixa (4,7% ). Dos 13 isolados de secreções, quatro foram considerados significativos, incluindo um de secreção de drenagem torácica e três de secreção traqueal.
Dos 107 recém-nascidos, 54 tiveram infecção do SNC e 53 estavam livres de infecção. A Tabela I mostra que 27 (50%) dos recém-nascidos infectados apresentaram peso ao nascer <1500 g, significativamente diferente dos recém-nascidos sem infecção (20,8%). O peso médio do nascimento também mostrou diferença significativa entre o grupo infectado pelo SNC (1495 g) e o grupo livre de infecção (2270 g). A idade média no isolamento do SNC diferiu significativamente entre o grupo de infecção (10 dias de idade) e o grupo livre de infecção (4 dias de idade).A maioria dos recém-nascidos infectados pelo SNC (42, 77,8%) foi submetida a dois ou mais procedimentos invasivos, incluindo o uso de um cateter em 48 (88,9%), nutrição parenteral em 35 (64,8%) e ventilação mecânica em 33 (61,1% ).
Os resultados mostraram maior freqüência de S. epi-dermidis associada à infecção (86,7%) do que à contaminação (68,4%) (p <0,05). Não foram observadas diferenças significativas para as outras espécies.
O SNC clinicamente significativo foi isolado em uma proporção maior do sangue do que as secreções (p <0,05), mas não houve diferença estatisticamente significativa em relação aos corpos estranhos.
Produção de lima - A Fig. 1 mostra que 20 (17,1%) dos 117 isolados do SNC foram positivos para a produção de limo, incluindo 18,7% de cepas de S. epidermidis , 28,6% de cepas de S. lugdunensis , 20% de cepas de S. hominis . S. hae-molyticus , S. simulans , S. warneri ou cepas de S. xylosus foram negativas para a produção de limo.
A Tabela II mostra que 12 (23,1%) dos 52 isolados de S. epidermidis significativos foram produtores de limo em comparação com cinco (12,8%) dos 39 isolados de contaminantes, sem diferença significativa entre os grupos. A produção de limo não foi observada em nenhuma das outras espécies significativas. Entre as amostras de contaminantes, duas das quatro amostras de S. lug-dunensis e uma das cinco amostras de S. hominis produziram limo.
Produção de enzimas - A distribuição de isolados significativos de S. epidermidis de acordo com a produção de enzima é mostrada na Tabela II . A concentração de enzimas é importante para a identificação de produtores de DNAs e TNAse do SNC. A detecção direta de DNAse e TNAse em sobrenadantes de culturas durante a noite no caldo BHI revelou apenas a produção por uma estirpe de S. lugdunensis . No entanto, quando os sobrenadantes da cultura foram concentrados pelo método de cultura do saco (Donnelly et al., 1967), a produção foi observada em várias espécies.
Dos 52 isolados clinicamente significativos de S. epidermidis , sete produziram hemolisina, seis lipases, três DNAse e duas TNAse. Não houve diferença significativa na produção de enzimas entre os isolados de contaminantes de S. epidermidis e os isolados clinicamente significativos.
Os dois isolados de S. haemolyticus clinicamente significativos produziram hemolisina, uma produziu lipase e uma DNAse produzida ( Tabela II ). Entre os três isolados clinicamente significativos de S. lugdunensis , um produziu hemolisina, os três produziram DNAse e um produziu TNAse ( Tabela II ).
Produção de enterotoxinas e TSST-1 - A Fig. 2 mostra que 44 (37,6%) isolados produziram uma ou uma combinação de duas ou mais enterotoxinas. A distribuição dos produtores de toxinas do SNC de acordo com a relevância clínica é mostrada na TabelaIII . Dos 52 isolados clinicamente significativos de S. epidermidis , 18 (34,6%) produziram enterotoxinas, 14 delas produzindo apenas SEC, uma que concomitantemente produz SEA e SEB, duas produzindo SEB e SEC, e simultaneamente produzindo SEA, SEB e SEC. Não houve diferença significativa na produção de enterotoxinas entre isolados clínicos significativos e contaminantes de S. epidermidis .
A produção simultânea de SEA e SEB e SEB e SEC também foi observada em uma cepa clinicamente significativa de S. lugdunensis ( Tabela III ). A produção isolada de SEC foi observada em um isolado de cada contaminante S. haemolyticus , S. lugdunensis , S. hominis e S. simulans ( Tabela III ). A única estirpe de S. simulans considerada significativa também produziu SEC, enquanto que S. warneri e S. xylosus não produziram enterotoxinas. Nenhum dos 117 CNS estudados produziu SED ou TSST-1.
DISCUSSÃO
O SNC é importante microrganismos indígenas de seres humanos e emergiu nos últimos anos como agentes etiológicos em uma série de infecções (Hall et al., 1987, Kloos & Bannerman, 1995). Em um estudo realizado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Atlanta, GA) entre 1986 e 1994, envolvendo 99 hospitais, 13.179 casos de infecção em recém-nascidos foram confirmados, sendo o SNC os agentes mais freqüentemente isolados em infecções hospitalares (Gaynes et al., 1996). Na década de 1990, o SNC apareceu como a principal causa de sepse em unidades de terapia intensiva neonatal, com uma incidência de 33 a 55% entre crianças de muito baixo peso (<1500 g) (Kacica et al., 1994). A ocorrência de SNC em unidades de cuidados intensivos neonatais tem sido atribuída às maiores taxas de sobrevivência de recém-nascidos prematuros de baixo peso e a procedimentos como o uso de cateteres vasculares, nutrição parenteral, ventilação mecânica e estadias prolongadas (Fleer & Verhoef, 1984).
No presente estudo, S. epidermidis foi a espécie mais freqüentemente isolada (77,8%), de acordo com outros pesquisadores (Hall et al., 1987, Neumeister et al., 1995). Também foram as espécies mais freqüentemente isoladas em situações clinicamente significativas, como recém-nascidos com infecção (88,9%). A predominância de S. epidermidis entre as espécies do SNC que causam infecção em recém-nascidos foi reconhecida por outros pesquisadores, com sua freqüência variando de 60 a 90% (Hall et al., 1987, Neumeister et al., 1995).
Embora S. epidermidis seja o agente etiológico mais freqüente, outras espécies patogênicas do SNC foram isoladas de várias fontes clínicas (Kloos & Bannerman, 1995). No presente estudo, outras espécies foram associadas à infecção, incluindo duas cepas de S. haemo-lyticus , três cepas de S. lugdunensis e uma cepa de S. simulans , S. warneri e S. xylosus . Hall et al. (1987) isolaram três estirpes de S. haemolyticus , duas cepas de S. hominis , duas cepas de S. warneri e uma cepa de S. simulans de crianças com evidências clínicas e laboratoriais de sepse e também pneumonia.
Existem poucos relatos de infecção com S. lugdunensis em recém-nascidos, provavelmente porque esta espécie só foi descrita recentemente (Freney et al., 1988). No entanto, estudos em pacientes adultos mostraram que essa espécie é um patógeno oportunista e significativo (Fleurette et al., 1989, Lambe et al., 1990).
Os mecanismos pelos quais o SNC provoca infecções não foram completamente elucidados. No entanto, em situações oportunistas, esses microorganismos atravessam barreiras de proteção como a pele e a mucosa e colonizam locais adjacentes à flora normal. Vários autores enfatizaram a produção de exopolissacarídeo ou limo como marcador epidemiológico da infecção (Christensen et al., 1982, Hall et al., 1987, Vogel 2000). Por outro lado, outros pesquisadores não encontraram associação entre as cepas produtoras de limo e a ocorrência de infecções causadas por esses microorganismos (Christensen et al., 1983, Riley & Schneider 1992).
O presente estudo mostra que uma pequena proporção dos isolados que produzem esse exopolissacarídeo (22,2%) estão associados a processos infecciosos. Outros autores também não encontraram evidências de que o limo fosse um fator de virulência (Christensen et al., 1982). Riley e Schneider (1992) também sugeriram que a produção de limo não parece ser um importante fator de virulência de S. saprophyticus isolado de mulheres com infecção do trato urinário.
Vários experimentos usando modelos animais foram realizados para determinar a importância do limo como um fator de virulência. Baddour et al. (1984), em um estudo experimental sobre endocardite induzida por cateter em ratos, observou uma diferença na virulência entre S. epidermidis e S. hominis . Todos os animais inoculados com S. epidermidis desenvolveram endocardite em comparação com apenas 12,5% dos animais inoculados com S. hominis (p <0,001). Entretanto, os autores não encontraram associação entre a produção de limo e o desenvolvimento da endocardite, sugerindo que este polissacarídeo não é um determinante crítico da virulência.Além disso, Patrick et al. (1992), utilizando camundongos com implantes subcutâneos, observaram que as amostras produtoras de limo não aumentaram o risco de infecção. Os autores sugeriram que o tecido traumatizado, associado à presença de cateteres, pode ser uma condição suficiente para o desenvolvimento de infecções causadas pelo SNC e que outros fatores que não a colonização mediada pelo limo determinam a patogenicidade desses microrganismos.
No entanto, se a produção de limo promove a aderência às próteses, agindo como um fator de virulência, o controle de infecção torna-se mais difícil, pois protege as células do SNC de agentes antimicrobianos e os mecanismos de defesa natural do hospedeiro. Gray et al. (1984) relataram que a substância mucosa produzida pelo SNC pode interferir com a resposta imune mediada por células. Davenport et al. (1986) mostraram que apenas 32% das infecções causadas por SNCs produtoras de limo foram curadas por antibióticos, ao passo que uma taxa de sucesso de 100% foi alcançada para cepas não produtoras. Esses resultados sugerem que o controle de infecções causadas pelo SNC produtor de limo requer a remoção da prótese, bem como terapia antibiótica convencional.
A produção de limo também pode variar entre espécies diferentes. De acordo com Christensen et al. (1983), essa característica é mais freqüente em cepas de S. capitis , S. epidermidis , S. hominis e S. saprophyticus . Entre as espécies do SNC isoladas no presente estudo, observou-se a produção de limo em S. epidermidis , S. lugdunensise S. hominis . A produção de limo por S. lugdunensis também foi relatada por Fleurette et al. (1989).
O estudo da patogenicidade do SNC também mostrou que vários microrganismos são produzidos por estes microorganismos, incluindo enzimas e toxinas que podem desempenhar um papel na patogenicidade desses microrganismos (Gemmell, 1987). Outros autores observaram a produção de hemolisinas ou toxinas citolíticas pelo SNC. No presente estudo, as hemolisinas foram produzidas por isolados de S. epider-midis , S. haemolyticus , S. lugdunensis e S. warneri , mas não por estirpes de S. hominis , S. simulans e S. xylosus . Resultados semelhantes foram relatados por Kloos e Schleifer (1975), Fleurette et al. (1989), Lambe et ai. (1990), e Cunha et ai. (2004).
A produção de lipase, DNAse e TNAse por esses organismos também foi relatada. Lambe et al. (1990) verificaram que a maioria das cepas de S. epidermidis , S. warneri e S. hominis incluídas no estudo produziram lipase e DNAse. Na presente investigação, com exceção de S. hominis e S. xylosus , todas as espécies produziram lipase.No que diz respeito à produção de DNAse e TNAse, a produção dessas enzimas foi observada em cepas de S. epidermidis , S. lugdunensis e S. simulans , e produção de DNAse por S. haemolyticus . A produção de TNAse por S. lugdu-nensis também foi demonstrada por Fleurette et al. (1989). Gramoli e Wilkinson (1978) detectaram a produção de TNAse em algumas cepas de S. xylosus, S. simulans , S. capitis e S. Sciuri .
Entre as espécies incluídas no presente estudo, S. epidermidis foi o único que produziu todas essas exoenzimas, mas quando os isolados envolvidos na etiologia das infecções foram comparados com os isolados de contaminantes, não foi observada diferença significativa. Essas descobertas são semelhantes às relatadas por Nataro et al. (1994), e sugerem que as infecções causadas por esses microorganismos dependem não apenas de fatores de virulência, mas também das condições que predispõem o hospedeiro a infecção, incluindo fatores inatos para recém-nascidos e o uso de procedimentos invasivos. A análise de fatores de risco em recém-nascidos indicou que um peso ao nascer <1500 g, a presença de cateteres de corpos estranhos, ventilação mecânica, nutrição parenteral etc. - e a não remoção de corpos estranhos foram fatores significativamente predisponentes à infecção pelo SNC.
No presente estudo, a produção concomitante de SEA + SEB e SEB + SEC e a produção isolada de SEC foram observadas nestes organismos. A produção de SEC também foi detectada em uma estirpe de S. haemolyticus , uma cepa de S. hominis e uma cepa de S. simulans , mas a produção de SED e TSST-1 não foi observada em nenhum dos SNC estudados.
Valle et al. (1991) encontraram uma capacidade toxigênica em 45 (16,5%) de SNC isolado de cabras, incluindo S. epidermidis , S. haemolyticus , S. warneri e S. xylosus , que produziram simultaneamente TSST-1 e TSST-1 + SEC. Crass e Bergdoll (1986) relataram a produção isolada de SEA e SEC, ou em combinação com TSST-1, por SNC isolado de pacientes com síndrome de choque tóxico ou outras infecções. No entanto, a produção de TSST-1 pelo CNS foi questionada por outros pesquisadores que não confirmaram esses achados (Parsonnet et al., 1987, Kreiswirth et al., 1987).
Embora ainda exista muita controvérsia sobre a produção dessas toxinas pelo SNC, os resultados presentes e os relatados por outros autores demonstram que sua capacidade tóxica não pode ser ignorada. De acordo com Bergdoll e Chesney (1991), estes microorganismos foram associados à etiologia de infecções graves por estafilococos e não há motivos para considerá-los tóxicos.
O papel exato dos produtos de estafilococos extracelulares na patogenicidade de uma infecção sistêmica ainda não está claro. Enterotoxinas e TSST-1 receberam atenção renovada por pesquisadores devido às suas propriedades "superantigênicas". Como "superantígenos", as enterotoxinas se ligam diretamente ao complexo de histocompatibilidade principal da classe II, sem o processo típico de antígenos normais, resultando na estimulação de muitas células T e, portanto, uma sobreprodução de citoquinas, como a interleucina-1 (IL-1) , IL-2, interferão gama e fator de necrose tumoral alfa (Marrack & Kappler, 1990). A evidência atual indica que os eventos fisiológicos que ocorrem na sepse neonatal são mediados por citocinas ativadas em resposta à presença de componentes bacterianos (Kilpatrick e Harris, 1998). O fato de que essas toxinas são superantígenas e que a liberação de mediadores imunológicos aumenta a resposta inflamatória observada durante a patogênese da sepse e o choque neonatal sugere que enterotoxinas e TSST-1 podem desempenhar um papel importante na progressão de infecções causadas por cepas de SNS toxigênicas.
As divergências existentes em relação à toxigenicidade do SNC enfatizam a necessidade de novos estudos usando técnicas genotípicas sensíveis e confiáveis ​​para confirmar a capacidade desses estafilococos para produzir toxinas.
Nosso estudo revelou a presença de um ou mais fatores de virulência em 77,8% das cepas do SNC isoladas, sugerindo que os fatores de virulência do SNC fornecem uma vantagem seletiva para a colonização cutânea de recém-nascidos hospitalizados. Os recém-nascidos com muito baixo peso ao nascer submetidos a procedimentos invasivos mostram maior risco de infecção subsequente com essas cepas.
REFERÊNCIAS
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Fatores de virulência associados com Staphylococcus Negativos de Coagulase isolados de infecções humanas
KR Soumya , 1 Suja Philip , 1 Sheela Sugathan , 2 Jyothis Mathew , 1 e EK Radhakrishnan  1
Introdução
Os estafilococos negativos de coagulase (CoNS) são bactérias comensais da pele, narinas anteriores, canais auditivos e mucosas respiratórias e gastrointestinais de humanos e animais (Piette e Verschraegen 2009 ).No entanto, as infecções graves que ameaçam a vida causadas por CoNS mudaram seu status de contaminantes clinicamente insignificantes para possíveis agentes patogênicos (Prasad et al., 2012 ). O CoNS pode formar biofilmes nas superfícies de dispositivos médicos e pode ser introduzido no corpo através de procedimentos médicos que envolvem a inserção do dispositivo. Os CoNS atuam como agentes patogênicos oportunistas causando infecções nosocomiais entre pacientes imunocomprometidos, imunossuprimidos, de longa duração hospitalizados e criticamente doentes (Chu et al., 2008 ). Entre vários CoNS, Staphylococcus epidermidis é a principal causa de infecções associadas a cateteres, feridas cirúrgicas, peritonite, osteomielite e endoftalmite (Upadhyayula et al., 2012 ). Outros membros de CoNS, como S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. hominis , S. warneri , S. capitis , S. simulans , S. cohnii , S. xylosus e S. saccharolyticus também são responsáveis por agentes patogênicos oportunistas ( Mack et al., 2006 ).
CoNS é conhecido por ter a capacidade de formar icaADBC codificado polissacarídeo adesina intercelular (PIA) e ica bioquímica independentemente quimicamente diversificada. O biofilme proporciona vantagens de sobrevivência ao organismo, tornando as células menos acessíveis ao sistema de defesa do hospedeiro e também prejudicando a ação dos antibióticos. A capacidade de formar biofilme é o fator de virulência mais importante da CoNS que facilita sua aderência e colonização em materiais artificiais. A formação de biofilme é um processo de quatro etapas envolvendo apego, acumulação, maturação e desprendimento. O anexo inicial é mediado através de várias proteínas ancoradas na parede celular, como Bhp, AtlE e Fbe, bem como a adesina intercelular. O estágio acumulativo caracteriza-se pela produção de adesina intercelular polissacarídica codificada com icaADBC (PIA). Vários relatórios sobre a formação de biofilmes independentes da PIA em CoNS também mostraram o envolvimento de duas principais proteínas associadas à superfície celular, a saber, Aap e Embp. A proteína associada à acumulação (Aap) é um membro da família de proteínas tipo Bap e a proteína de ligação à matriz extracelular (Embp) medeia a ligação bacteriana à fibronectina e também participa no acúmulo de biofilme (Bowden et al., 2005 ). Um estudo recente sobre biofilmes de S. epidermidis mediados por PIA, Aap e Embp identificou características estruturais distintas associadas à organização das adesões intercelulares. A PIA forma uma matriz extracelular e, assim, incorpora células de S. epidermidis em uma malha de fibras resultando em grandes aglomerados celulares. Aap forma calhas de fibrilas proteicas que são estritamente localizadas na superfície celular. Considerando que a Embp está envolvida na aderência das superfícies bacterianas e também encontrada no espaço intercelular como matriz proteica extracelular. Um biofilme maduro também incorpora íons metálicos e macromoléculas como proteínas, DNA, lipídios e substâncias orgânicas, para formar uma estrutura tridimensional e altamente ordenada.
O CoNS também é beneficiado pela presença de resistência múltipla aos medicamentos como vantagem adicional. Várias espécies de Staphylococcus são consideradas como tendo a resistência à meticilina adquirida através da transferência horizontal de genes. Uma vez que os estafilococos resistentes à meticilina (MRS) são geralmente resistentes a outros antibióticos, como beta-lactamas, aminoglicosídeos e macrólidos, é difícil tratar as infecções causadas por CoNS (Duran et al., 2012 ). Os CoNS possuem elementos mecânicos de cromossomo de cassete estafilocócico(SCC) que possuem genes para resistência à meticilina e também para outros antibióticos. Todos esses fatores exigem o monitoramento periódico da resistência a múltiplos fármacos da CoNS. Embora a incidência de infecções por Staphylococcus Negativos de Coagulase esteja aumentando, a informação epidemiológica relacionada à aquisição e disseminação desses organismos entre populações é muito limitada. Estudos sobre caracterização e prevalência de CoNS ajudarão a compreender a distribuição de espécies e os mecanismos de resistência antimicrobiana de CoNS associados a humanos. Isto será muito importante para desenvolver novas estratégias terapêuticas para a prevenção e tratamento eficaz das infecções por CoNS. Assim, o presente estudo foi realizado para analisar a distribuição das espécies e as propriedades de resistência a antibióticos da CoNS de várias amostras clínicas. Além disso, também foi analisada a distribuição de genes associados ao biofilme e a composição do biofilme na formação de biofilmes CoNS.
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materiais e métodos
Coleção de amostras para o estudo
Um total de 173 isolados de diferentes amostras clínicas, incluindo exsudados, urina, sangue, dicas de cateter endotraqueal e escarro, foram coletados de um hospital de cuidados terciários no distrito de Ernakulam, em Kerala, na Índia. Uma amostra por paciente foi incluída no estudo.
Caracterização bioquímica dos isolados
As colônias observadas como estafilococos com coagulase negativa com base na morfologia da colônia, na coloração de grama e no teste de coagulase do tubo foram colhidas e subcultivadas em TSA inclinadas e mantidas como culturas de estoque puro. Os isolados foram inicialmente identificados e caracterizados como gênero Staphylococcus pelo teste de catalase. A espécie Staphylococcus foi diferenciada do Micrococcus com base na produção de ácido a partir da glicose no meio base de Hugh e Leifson e resistência à bacitracina (8 mcg). Todos os isolados clínicos suspeitos de CoNS foram identificados até o nível da espécie usando os testes bioquímicos. Os testes utilizados foram Manitol Salt Agar, Urease, Ornithine Decarboxylase, Nitrate Reduction, Phosphatase e Hemolysis. A produção de ácido a partir de sacarose, trealose, maltose, lactose, manose, arabinose e xilose e susceptibilidade a novobiocina (5 mcg) (Iorio et al., 2007 ) também foram analisados.
Teste de susceptibilidade a antibióticos
O teste de sensibilidade aos antibióticos dos isolados foi realizado em Mueller-Hinton Agar comercialmente preparado (HiMedia, Mumbai) por método de difusão de disco de acordo com as diretrizes do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais. Os discos antibióticos utilizados foram ampicilina (25 mcg), cloranfenicol (30 mcg), ciprofloxacina (30 mcg), eritromicina (15 mcg), ácido fusídico (30 mcg), gentamicina (10 mcg), levofloxacina (5 mcg), meticilina ( 5 mcg), penicilina (10 mcg), rifampicina (15 mcg), tetraciclina (30 mcg) e vancomicina (15 mcg) (HiMedia, Mumbai). Cultivaram-se culturas de CoNS de uma semana a outra em MHA. Usando fórceps estéril, cerca de cinco discos antibióticos foram colocados na superfície de agar de cada placa. Após a incubação, a zona de inibição foi medida e a interpretação dos resultados foi feita de acordo com o gráfico fornecido pelo fabricante.
Ensaio de biofilme
Todos os CoNS isolados foram analisados ​​qualitativamente para a formação de lodo pelo cultivo em meio de Agar vermelho do Congo (CRA) (HiMedia, Mumbai). As placas inoculadas foram incubadas a 37 ° C durante 24 h. A análise quantitativa da produção de biofilmes foi realizada medindo a aderência bacteriana às placas de 96 poços de microtitulação de poliestireno (Himedia, Mumbai) usando o teste de violeta de cristal (Oliveira e Cunha 2010 ). Para isso, os isolados de CoNS foram cultivados durante a noite a 37 ° C em meio TSB (HiMedia, Mumbai). As culturas foram diluídas para 1: 200 usando meio de TSB fresco e 200 μL desta diluição foram transferidos para poços de microtitulação e incubados a 37 ° C durante 24 h.Após a incubação, os poços foram lavados quatro vezes com 200 μL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), secados ao ar e corados com violeta de cristal de 0,4% durante 5 min. Em seguida, a placa foi enxaguada sob a água corrente da torneira e seca ao ar, e a absorvância foi determinada a 490 nm após a adição de 200 μL de etanol a 95% em cada poço (Bio-Rad, leitor de microplacas). Os isolados foram classificados em três categorias com base na densidade óptica (DO) como não aderentes (OD igual ou inferior a 0.111); fracamente aderente (OD superior a 0,111 ou igual ou inferior a 0,222) e fortemente aderente (OD maior que 0,222) de acordo com o método anteriormente descrito (El Farran et al., 2013 ). O experimento foi conduzido em triplicado.
Detecção por PCR de genes associados ao biofilme em CoNS
O isolamento de DNA genômico de dezessete isolados de Staphylococcus formadores de biofilmes (S) e vinte e quatro (M) moderados foi realizado utilizando o kit de minispina bacteriana DNA Genomic DNA (Chromous biotech, Banglore). Os isolados clínicos foram examinados para os genes icaAB , aap , bhp , atle , fbe e embp que estão envolvidos na formação e ligação do biofilme a superfícies bióticas e abióticas por PCR utilizando Sure Cycler 8800 (Agilent Technologies) (Iorio et al., 2011 ; Rohde et al., 2004 ). Os produtos de PCR amplificados foram analisados ​​em 1,5% de gel de agarose e foram visualizados usando UV-trans-iluminador. Além disso, os produtos de PCR selecionados foram sequenciados para confirmar a identidade do produto.
Determinação da heterogeneidade bioquímica do biofilme formado por CoNS
Os produtos isolados de CoNS produzindo biofilme foram inoculados em 5 mL de meio TSB e incubados a 37 ° C durante 24 h. As culturas bacterianas foram diluídas para 1: 200 usando meio de TSB fresco e 200 μL da diluição foram transferidos para placas de cultura de tecidos de 96 poços (HiMedia, Mumbai) e incubados a 37 ° C durante 12 h. Os biofilmes maduros formados foram lavados três vezes com solução salina tamponada com fosfato e foram tratados com 200 μL de NaOH 4 40 mM (HiMedia, Mumbai), 0,1 mg mL -1 de proteinase K (Genei) em Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), com NaCl 100 mM ou 0,5 mM mL- 1DNase I (Sigma) em MgCl2 5 mM durante 24 h a 37 ° C. O controle negativo sem tratamentos contendo apenas células bacterianas lavadas com PBS também foi incluído no experimento. Após a incubação, os poços foram lavados três vezes com PBS, corados com solução violeta de cristal a 0,4% (p / v) e OD medida a 490 nm utilizando um Varioskan (Thermo Fisher Scientific) (Verdayes et al., 2013 ). Os ensaios foram repetidos quatro vezes, mantendo os triplicados para teste e controle e os valores médios de absorvência do biofilme foram analisados.
Observações estruturais do biofilme usando HR-TEM
A formação de biofilme foi confirmada por HR-TEM para isolados de S. epidermidis (S7) e S. haemolyticus (S9) fortes para o biofilme. A partir de 16 h de culturas incubadas estáticas, foram transferidas alíquotas de 1 mL e os agregados de biofilme foram coletados por centrifugação curta seguido de lavagem e ressuspensão em PBS. Uma película fina da amostra foi revestida na grade de cobre revestido de carbono (JEOL-TEM) e foi observada para a produção de biofilmes (Archer et al., 2011 ).
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Resultados
Identificação e análise da diversidade de espécies de espécies de CoNS
Entre 173 amostras clínicas processadas, 152 isolados foram identificados como CoNS. Com base em testes bioquímicos e susceptibilidade à novobiocina, os isolados de CoNS foram especificados. Neste estudo, S. epidermidis (59%) foi isolado como a espécie predominante de CoNS. O próximo grande grupo observado foi S. haemolyticus com uma distribuição de 19% e 6% dos isolados clínicos de CoNS foram identificados como S. hominis . Os isolados de CoNS também continham S. saprophyticus (5,2%), S. capitez subsp capitis (5,2%), S. capitis subsp urealyticus (1,3%), S. sciuri (1,3%) e 0,65% de S. cohniie S . kloosii (Tabela 1 ).
tabela 1
Distribuição percentual de CoNS isolada de várias amostras clínicas
Teste de susceptibilidade ao antibiótico
A análise de antibiograma de isolados clínicos de CoNS mostrou resistência máxima de 83% em relação à ampicilina seguida de meticilina (70%). Nenhum dos isolados foi suscetível a todos os antibióticos utilizados neste estudo e 93% dos isolados clínicos foram susceptíveis a vancomicina. Muito interessante, oito S. epidermidis e três isolados de S. haemolyticus encontraram resistência à vancomicina. A maior percentagem de resistência à meticilina foi demonstrada por S. haemolyticus (97%), seguido de S. epidermidis (71%) e S. capitis subsps urealyticus (67%). S. capitis subsps capitis apresentou resistência a meticilina a 50%, isto foi de 38% para S. saprophyticus e 33% de S. hominis resistentes à meticilina também foram detectados. O S. Sciuri isolado da amostra de escarro também encontrou resistência à meticilina. Excepto dois isolados de S. epidermidis , todos os outros isolados de CoNS resistentes a vancomicina também encontraram resistência à meticilina. Verificou-se que as resistências de drogas múltiplas são elevadas para os isolados de CoNS (Fig. 1 ).
Figura 1
Perfil de sensibilidade ao antibiótico de amostras clínicas. Onde, R , IR e S indicam o número de isolados CoNS resistentes, intermediários e sensíveis
Ensaio de biofilme
O rastreio à base de ágar do Congo vermelho para a produção de limo resultou na identificação de 133 isolados (87,5%) de 152 CoNS para ter essa propriedade. Os isolados de limo-positivo formaram colônias avermelhadas com consistência áspera, seca e cristalina em CRA, enquanto que as cepas negativas de limo desenvolveram colônias vermelhas-rosadas e lisas. A análise quantitativa da formação de biofilmes pelo ensaio da placa de microtitulação identificou 11% dos isolados como produtores fortes de biofilme e 16% como formadores moderados de biofilme (Tabela 2 ).
mesa 2
Resultados da análise qualitativa e quantitativa da formação de biofilmes por CoNS selecionados no estudo
Prevalência de genes associados ao biofilme
Dezessete fortes e vinte e quatro microfilmes moderados formando CoNS foram selecionados para a presença de genes associados ao biofilme ( ica AB, aap, atl E , fbe, bhp e embp ). Entre estes, nove isolados formadores de biofilmes fortes e quatorze moderados tiveram genes associados a biofilme únicos ou múltiplos. Em detalhe, dois biofilmes fortes formando S. epidermidis , um S. haemolyticus e biofilmes moderados formando isolados de três S. epidermidis e um S. haemolyticus possuía o gene icaAB . No biofilme forte que formou CoNS , o gene embp apresentou uma distribuição de 70% seguida de ATLE(30%), fbe (20%) e aap (10%). Nenhum dos formadores fortes de biofilme foi positivo para o gene bhp .80% do biofilme moderado que forma CoNS possuía o gene aap . Os formadores de biofilme moderados também apresentaram alta distribuição de gene embp (47%) seguido de fbe (40%) e atlE (33%). Três formadores de biofilmes fortes e sete isolados moderados encontraram mais de um gene associado ao biofilme. Nenhum dos isolados foi considerado positivo para todos os seis genes investigados. Três entre os 9 CoNS fortes e oito entre os 14 moderados CoNS foram acoplados com múltiplos genes associados ao biofilme. Exceto em S7 e M5, todos os outros ica AB + S. epidermidis foram encontrados com a presença de genes fbe , atlE e embp . S. haemolyticus M3 foi encontrado com genes aap / fbe / atlE / embp , M12 com aap / embp e M4 com gene embp . Os isolados de S. haemolyticus M2, M6, M7 e dois isolados M1 e M10 de S. saprophyticus contiveram apenas o gene Aap (Fig. 2 , 3,3 , 4,4 ,, 5,5 , 6,6). 7,7 ; Tabela 3 ).
Figura 2
Amplificação por PCR de ica AB a 564 pb. M marcador, controle Cnegativo. As linhas 1 a 7 indicam S3, S7, S9, M5, M8, M9 e M10, respectivamente
Fig. 3
Amplificação por PCR do gene fbe a 495 pb. M marcador, controle C.um Lanes 1 e 2 mostram isolar não: S3 e S8, b Lanes 1 - 6 indicam M3, M6, M9, M10, M12 e M14
Fig. 4
PCR para detecção de gene bhp a 1583 pb. M marcador, controle C. A pista 1 indica a amostra positiva bhp M9
Fig. 5
Amplificação por PCR de genes embp a 455 pb. M marcador, controle C. A Lanes no 1 - 8 mostra os isolados S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 e S8, b As pistas 1-7 indicam os isolados não: M3, M5, M9, M10, M12, M13 e M15, respectivamente
Fig. 6
Resultado de PCR do gene aap a 466 pb. M marcador, controle C. As pistas 1-13 indicam amostras não: S8, M1, M2, M3, M6, M7, M8, M10, M11, M12, M13, M14 e M15, respectivamente
Fig. 7
Resultados de PCR da amplificação do gene atl E a 682 pb. Mmarcador, controle C. As pistas nº 1-8 indicam os isolados S3, S7, S8, M3, M6, M9, M10 e M12, respectivamente
Tabela 3
Comparação entre genótipos e composição do biofilme
Associação entre genótipos e composição do biofilme
O gene associado a biofilme múltiplo que abrigou S. epidermidis isolou S3 com genótipo ica AB / fbe / atlE / embp , S7 com ica AB / atlE / embp , M11 com ica AB / aap / fbe / atlE / embp e M5 com ica AB / AAP / fbe / atlE foram identificados como tendo biofilme quimicamente heterogêneo composto de carboidratos, proteínas e eDNA de acordo com seus genótipos. Além disso, o isolado de S. epidermidis M8 do gene BHP que abrigava ica AB / fbe / atlE / embp genes mostraram susceptibilidade para todos os três tratamentos utilizados. O biofilme de S. haemolyticus M9 que tinha amplificado ica AB / aap / fbe / atlE / embp genes foi encontrado para ser composto de carboidratos e proteínas, enquanto S. haemolyticus S9 que continha apenas ica AB gene mostrou um diversificado carboidrato-proteína-eDNA biofilme.Curiosamente, o biofilme de alguns dos isolados que possuíam o gene aap / fbe / atlE / embp e embpsozinho foi composto de carboidratos-proteínas-biofilmes de eDNA que eram diferentes dos genótipos identificados (Tabela 3 ).
Análise de formação de biofilme usando HR-TEM
Foi realizada a análise TEM de formação de biofilme forte S7 ( S. epidermidis , ica AB / embp / atl E) e S9 ( S. haemolyticus , ica AB). Para ambos os isolados, observou-se a matriz extracelular amorfa (ECM). As estruturas aglomeradas semelhantes a lodo presentes na superfície da célula bacteriana e entre as células podem ser a indicação da presença de PIA. O ECM grosso e as estruturas estendidas localizadas interconectadas da superfície celular foram observadas em S. epidermidis, o que pode ser devido à expressão do biofilme de proteína independente ica (Fig. 8 ).
Fig. 8
Análise HR-TEM da formação de biofilmes de S. epidermidis e S. S. hemolyticus
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Discussão
Os estudos sobre a diversidade de espécies, a resistência aos antibióticos e os fatores de virulência da CoNS são de grande importância devido ao seu papel emergente como agentes patogênicos. Como a distribuição de várias espécies de CoNS na população humana pode variar, a identificação de espécies de várias amostras clínicas é muito importante. Neste estudo, com base na identificação fenotípica, S. epidermidis encontrou-se a principal espécie de CoNS isolada. Embora S. epidermidis seja um membro ubíquo da flora normal, seu papel emergente como patógenos nosocomiais que causam sepse pós-operatória, infecções relacionadas a dispositivos de implantes médicos em pacientes imunocomprometidos, etc. exigem estudos sobre seus fatores de virulência e resistência a antibióticos (Piette e Verschraegen 2009). A identificação de S. epidermidis como principal CoNS no presente estudo prova isso. S. haemolyticus(19%) que foi identificado como a segunda espécie comum é um agente infeccioso clínico bem conhecido de CoNS . S. haemolyticus é comumente associado a infecções de septicemia, feridas, ossos e articulações, e relatórios recentes sobre a sua diminuição de susceptibilidade à vancomicina e também a outros antibióticos glicopéptidos geram muita preocupação com as estratégias de tratamento atuais (Sujatha e Praharaj 2012 ). S. hominis, que geralmente causam infecçõessangüíneas, também é conhecido por ter sua presença em amostras clínicas na freqüência similar à obtida no estudo (Goyal et al., 2006 ). S. saprophyticus são comumente associados à infecção do trato urinário em seres humanos e estes geralmente são isolados como segundo CoNS comum de amostras clínicas, mas, neste estudo, sua distribuição foi de apenas 5,2%. A prevalência de diferentes espécies de CoNS pode variar com a amostra clínica. No presente estudo, amostras de exsudados apresentaram prevalência de S. epidermidis 63%, seguido por S. haemolyticus 19%, enquanto que, para amostras de sangue, 63% de S. epidermidis e 8% de S. haemolyticusestavam presentes. As amostras de urina apresentaram maior freqüência de isolamento para S. haemolyticus (50%).
As cepas de CoNS com múltiplas resistências aos antibióticos estão se tornando um grande problema nas infecções nosocomiais. Entre 152 isolados estudados, 126 eram resistentes à ampicilina. No estudo atual, 70% dos isolados encontraram resistência à meticilina. Os isolados nosocomiais geralmente têm até 80% de resistência à meticilina e, além disso, também estão associados à resistência a múltiplos medicamentos.O uso consistente de vancomicina nos hospitais tem risco de surgimento de cepas resistentes (Schwalbe et al., 1987 ). Uma vez que a vancomicina é a droga de escolha para o tratamento de várias infecções por CoNS, 7% de isolados resistentes a vancomicina observados no presente estudo são muito significativos.Isso indica a dificuldade de uso da vancomicina para o tratamento e também o potencial para disseminar esses fatores de resistência para outras bactérias. Além disso, dez isolados encontraram resistência tanto para a vancomicina quanto para a meticilina no ensaio de difusão do disco, que indicam a evolução do potencial de CoNS resistente a múltiplos fármacos entre os isolados clínicos estudados. Como a resistência à vancomicina está se espalhando por todo o mundo, essas observações são muito importantes. Embora a terapia combinada multidrogas com rifampicina-vancomicina e ácido rifampicina-fusídico possa ser efetiva contra cepas resistentes a vancomicina, a evolução dos mecanismos de resistência no CoNS deve ser periodicamente analisada.
Estudos recentes mostram a presença de fatores de inserção muito notáveis ​​e diversos e mecanismos de formação de biofilmes em CoNS. Isso facilita a colonização e sobrevivência de CoNS na superfície de dispositivos médicos in vivo após a inserção do dispositivo. A freqüência de 87% da produção de limo identificada neste estudo é comparável ao relatório anterior de 83% da produção de limo em CoNS isolada de infecções associadas ao cateter (Cafiso et al., 2004 ). No entanto, pela análise quantitativa da produção de biofilmes, apenas 11% da CoNS foram identificados como fortemente positivos. Muito interessante, 96% das cepas resistentes à meticilina isoladas neste estudo também foram positivas para a produção de limo e essa associação já foi sugerida (Mack et al., 2002 ).
Dos 17 fortes e 24 biofilmes moderados formando CoNS rastreados genotípicamente, apenas nove fortes e quatorze CoNS moderados foram encontrados para ser positivos para genes de biofilme simples ou múltiplos. Quando cultivados no TSB, a maioria dos CoNS mostrou a relação esperada entre seus genótipos e composições de biofilme. O resto dos isolados pode ter um tipo de biofilme mais diversificado.A existência de biofilmes de carboidratos, proteínas e eDNA ou suas combinações já foi descrita em muitos estudos (Fredheim et al., 2009 ; Verdayes et al., 2013 ). Além disso, as proteínas multifuncionais em Staphylococci foram encontradas para tornar o biofilme mais diversificado. Em outro estudo, a heterogeneidade do biofilme e sua relação com os genótipos foram detalhadas usando a análise CLSM (Schommer et al., 2011 ). A existência de biofilme indeterminado devido ao produto alterado ou modificado de proteínas e carboidratos com substituintes orgânicos e inorgânicos ou mesmo formada por outras biomoléculas também foi sugerida (Verdayes et al., 2013 ). Os genes envolvidos na produção de biofilmes foram sugeridos como principais determinantes de virulência relevantes para cepas de CoNS clinicamente significativas. Além disso, diferentes estudos relataram a associação significativa de ica locus e mec A com cepas infecciosas de S. epidermidis do que as cepas contaminantes (Frebourg et al., 2000 ).Em um estudo anterior sobre CoNS de fontes clínicas semelhantes, foi encontrada uma distribuição comparável de espécies de CoNS. Este estudo também demonstrou a presença de potenciais fatores de virulência como cápsulas, limo, biofilme, esterase, sideróforo, DNase, resistência antibiótica múltipla e genes associados ao biofilme em CoNS (Suja et al., 2011 ).
Estudos epidemiológicos do operô ica em S. epidermidis a partir de cateter associado ao biofilme e infecções nas próteses articulares mostraram ter uma distribuição de 33-52%. No entanto, outras evidências sugerem a existência de expressão in vivo de mecanismos independentes de PIA que resultam na arquitetura complexa de biofilme (Schommer et al., 2011 ). Nossa pesquisa mostrou uma maior porcentagem de fatores de inserção e fatores de biofilme proteináceos em CoNS, especialmente em S. epidermidis . Estes indicam que os biofilmes são formados através da expressão paralela de diversos mecanismos. Verificou-se que 17% dos isolados positivos de ensaio TCP continham genes icaAB e múltiplos genes de biofilme também eram comuns entre esses isolados. Um resultado semelhante para icaoperon foi relatado para cepas clínicas de S. epidermidis (Qin et al., 2007 ). A coexistência de genes icaindependentes com o operão icaADBC também foi encontrada em S. epidermidis . Uma vez que S. haemolyticus relatou ter o maior nível de resistência aos antibióticos entre os CoNS, a assistência de múltiplos genes de biofilme entre eles parece ser bastante alarmante. Existem relatos sobre PIA que formam S. saprophyticus , enquanto este estudo também expôs a possibilidade de abrigar ica genes independentes entre essas espécies de CoNS. Além disso, alguns dos genótipos de CoNS testados mostraram variação na composição do biofilme. Na análise de TEM de dois isolados que abrigavam o gene ica AB, eles mostraram formação de ECM. Em S. epidermidis, observou-se uma camada espessa semelhante. As estruturas semelhantes a roos que emergem da parede celular interligando-se a outras células bacterianas também foram observadas e isso pode ser devido a fatores proteináceos (Takahashi et al., 2015 ).
Os estafilococos negativos de coagulase são agentes patogénicos resistentes a múltiplos fármacos e, portanto, estudos sobre a distribuição de espécies locais, a sensibilidade aos antibióticos e a prevalência de genes associados ao biofilme são muito importantes. Os isolados de CoNS do estudo atual mostraram resistência antibiótica múltipla semelhante aos outros relatórios globais. A coexistência de múltiplos antibióticos de resistência e genes de biofilme entre muitos isolados pode resultar em condições intratáveis.Estudos sobre a prevalência de genes de biofilme ica dependentes e ica independentes e a heterogeneidade química do biofilme ajudam a compreender seu papel e interação uns com os outros e são necessários para identificar novas metas para desenvolver abordagens terapêuticas. São necessários mais estudos para definir os papéis dos diferentes componentes dos biofilmes indeterminados e sua regulação. A resistência à vancomicina demonstrada por alguns membros pode ter sérios impactos devido à possibilidade de espalhar isso para outras cepas bacterianas. Assim, estratégias apropriadas devem ser adotadas para o controle e prevenção de infecções, e isso requer monitoramento próximo e inspeções periódicas desses potenciais agentes patogênicos nosocomiais resistentes a múltiplos fármacos.
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Reconhecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Governo da Índia. Nós agradecemos sinceramente ao Dean e às equipes delaboratório da MOSC Medical College, Kolenchery, Kerala. Também agradecemos ao DBT-MSUB por fornecer instalações de instrumentação.
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Conformidade com os padrões éticos
Conflito de interesses
Os autores declararam que não há conflitos de interesse.
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