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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA, EMBRIOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR Práticas de Biologia Celular www.thermofisher.com Aluno:___________________________________________________________Matrícula:____________ 2018 2 APRESENTAÇÃO Este material foi elaborado pelos professores da disciplina de Biologia Celular com o objetivo de auxiliar os estudos dos alunos e também de servir como um roteiro para as aulas práticas. Este volume é composto de duas partes. Inicialmente encontram-se capítulos com breves resumos sobre os assuntos abordados nas aulas teóricas e que devem ser utilizados como um guia durante os estudos. No entanto, esses capítulos não são suficientes como única fonte de estudo, sendo indispensável a consulta e leitura dos livros texto indicados pelos professores. Na segunda parte dessa apostila encontram-se um conjunto de atividades práticas organizadas de acordo com o assunto. O conjunto dessas atividades visa complementar os temas trabalhados durante as aulas teóricas, fornecendo assim um conjunto de habilidades necessárias para o estudo da Biologia Celular. As atividades propostas devem ser desenvolvidas de acordo com a orientação dos professores em sala de aula. Aproveite as oportunidades oferecidas para discutir suas dúvidas com os colegas em sala de aula e principalmente com o professor. Não deixe de completar todas as atividades propostas. Bons Estudos! 3 ÍNDICE Sumário 1. DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPIA PARA O ESTUDO DA CÉLULA .................................. 4 2. MICROSCÓPIO DE LUZ .............................................................................................................................. 5 3. ORGANISMOS PROCARIONTES E EUCARIONTES .......................................................................... 7 4. BIOENERGÉTICA ...................................................................................................................................... 11 5. BIOMEMBRANAS ..................................................................................................................................... 13 6. CITOESQUELETO ..................................................................................................................................... 16 7. NÚCLEO ....................................................................................................................................................... 20 8. TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO .............................................................................................................. 24 9. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO .......................................................................................................... 28 10. COMPLEXO DE GOLGI.......................................................................................................................... 30 11. MITOCÔNDRIA ....................................................................................................................................... 33 12. CLOROPLASTO ....................................................................................................................................... 38 13 CICLO CELULAR E APOPTOSE........................................................................................................... 42 14 MITOSE ....................................................................................................................................................... 45 15. MEIOSE ...................................................................................................................................................... 46 PRÁTICAS ........................................................................................................................................................ 49 PRÁTICA 1 .................................................................................................................................................. 49 PRÁTICA 2 .................................................................................................................................................. 50 PRÁTICA 3 .................................................................................................................................................. 53 PRÁTICA 4 .................................................................................................................................................. 56 PRÁTICA 5 .................................................................................................................................................. 58 Prática 6 ....................................................................................................................................................... 61 Prática 7 ....................................................................................................................................................... 63 Prática 8 ....................................................................................................................................................... 66 PRÁTICA 9 .................................................................................................................................................. 68 PRÁTICA 10 ................................................................................................................................................ 70 PRÁTICA 11 ................................................................................................................................................ 72 4 1. DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPIA PARA O ESTUDO DA CÉLULA 1.1 Microscópio de luz A primeira ferramenta criada para o estudo das células foi o Microscópio de Luz que têm seu funcionamento baseado na análise de amostras biológicas finas o bastante para permitir que a luz passe através delas. No Microscópio de Luz encontramos um conjunto de lentes objetivas e oculares capazes de fornecer aumentos que variam normalmente entre 20 e 1000x. 1.2 Microscópio de fluorescência A microscopia de fluorescência é um tipo especial de microscopia de luz baseada na propriedade física de algumas substâncias absorverem luz em um comprimento de onda específico e emitirem luz em um comprimento de onda diferente (fluorescência). Micrografias de material observado sob microscopia de fluorescência são caracterizadas pelo fundo escuro nas fotografias. Isso se deve ao sistema de filtros especiais presentes nos microscópios de fluorescência. Muitos materiais biológicos são naturalmente fluorescentes, como a clorofila e o colágeno. Além disso, existe um grande número de compostos (fluorocromos), que quando ligados a compostos biológicos tornam-se fluorescentes. Outra aplicação muito utilizada para a microscopia de fluorescência é a conjugação de fluorocromos a anticorpos contra componentes específicos da célula, ou mesmo com sondas que localizam trechos específicos no genoma celular. 1.3 Microscopia eletrônica O desenvolvimento dos microscópios eletrônicos originou-se da observação de que um feixe de elétrons no vácuo se comporta da mesma forma que um feixe de luz. Os princípios gerais da microscopia eletrônica são os mesmos da microscopia de luz. A diferença, como o próprio nome sugere, é a utilização um feixe de elétrons no lugar da fonte luminosa e são utilizadas, lentes eletromagnéticas que modulam o comportamento do feixe de elétrons ao longo do trajeto para a formação da imagem. A diferença básica entre as microscopias de luz e a microscopia eletrônica é que, devido às propriedades ondulatórias dos elétrons, conseguimos obter aumentosmuito maiores na microscopia eletrônica e com resolução muito superior. 5 2. MICROSCÓPIO DE LUZ Passos para focalização/uso do microscópio óptico 1. Retirar a capa do microscópio. 2. Identificar as diferentes partes do microscópio. 3. Limpar a lâmina a ser examinada com lenço de papel macio. 4. Abaixar a mesa totalmente utilizando o parafuso macrométrico. Gire o revólver encaixando a objetiva de menor aumento (4x). 5. Colocar a lâmina sobre a platina (com a lamínula voltada para cima) e sobre a lente frontal do condensador, prendendo-a com a presilha do charriot. 6. Levantar a platina utilizando o macrométrico até a posição mais elevada. 7. Agora, observando pela ocular (ajuste a distância entre as oculares), utilizando o parafuso macrométrico, descer a platina lentamente até a imagem do material observado estar focalizado. 8. Explore o material movimentando os parafusos do “charriot”. Durante a exploração, utilize o parafuso micrométrico para ajustar o foco e a abertura do diafragma para deixar a intensidade luminosa em um ponto confortável para seus olhos. 9. Posicione o material a ser analisado no centro do campo de visão e encaixe a objetiva de 10x. Utilizando apenas o parafuso micrométrico ajuste o foco. 10. Escolha uma área para ser explorada e posicione no centro do campo de visão. Encaixe a objetiva de 40x e utilizando apenas o parafuso micrométrico ajuste o foco. 11. Quando desejar retirar a lâmina do microscópio, girar o revólver de modo a deixar em posição de observação a objetiva panorâmica (menor aumento – 4x). Abaixar a platina girando- se o parafuso macrométrico. Remover a lâmina com cuidado para que os dedos não toquem as lentes das objetivas e para que a lâmina não toque nas mesmas. Uso da OBJETIVA DE IMERSÃO (100x): a) Para focalizar com a objetiva de 100x, inicialmente focalize o objeto com a objetiva de 40x e em seguida coloque o revólver em posição intermediária (entre as objetivas de 40x e 100x); b) Coloque uma gota de óleo sobre a lâmina (no local onde está visível a luz) e então coloque a objetiva de imersão no eixo. c) A partir daí focalize mexendo apenas no micrométrico. d) Ao terminar, abaixar a platina, colocar a objetiva de pequeno aumento no eixo, retirar a lâmina. e) Limpar a objetiva (primeiro) e a lâmina (segundo) com um lenço de papel macio e seco. f) Não use o mesmo lenço para limpar as outras objetivas! 12. Ao terminar: a) Não esqueça a lâmina no microscópio; b) Desligar a fonte de luz; c) Colocar a capa no microscópio; d) Limpar as lâminas utilizadas e a mesa; e) Conferir a caixa de lâminas e entregá-la ao responsável. 6 7 3. ORGANISMOS PROCARIONTES E EUCARIONTES Quando analisamos e estudamos profundamente uma célula percebemos sua complexidade e que existe uma grande diversidade estrutural entre diferentes tipos celulares. Em um único organismo vivo, como nós humanos por exemplo, podemos encontrar diferentes tipos celulares que em nada se assemelham quando observados rapidamente. Nossas células possuem uma grande diversidade de organelas e estruturas organizadas em seu núcleo e citoplasma, cada uma exercendo uma determinada função. 3.1 Todos os seres vivos são formados por células. A partir desta constatação que é a base do nosso estudo nessa disciplina, precisamos expandir nosso conceito e perceber que mesmo os seres vivos mais simples como as bactérias também são formados por células. Precisamos, no entanto, estabelecer a diferença entre organismos Eucariotos e Procariotos. 3.2 Procariotos São micro-organismos constituídos por uma célula, sem núcleo celular e nenhum tipo de compartimentalização interna por membranas, estando ausentes várias outras organelas, como as mitocôndrias, o complexo de Golgi e o fuso mitótico. As bactérias constituem os menores seres vivos, com dimensões máximas tipicamente da ordem dos 0,5 a 1μm. Esse tamanho reduzido, acredita-se, deve-se ao fato de não possuírem compartimentos membranosos em seu interior. Esses micro-organismos possuem as estruturas celulares mais simples, porém, em termos bioquímicos, são os seres mais diversos e inventivos que existem na natureza. A maioria das bactérias reproduz-se rapidamente, por cissiparidade, também chamada de divisão simples ou bipartição. As bactérias podem ser encontradas numa ampla diversidade de nichos ecológicos, de lama quente de origem vulcânica ao interior de outros organismos vivos. Por apresentarem uma grande variedade de diferentes metabolismos, as bactérias podem ser divididas em: fototróficas, quando obtêm a energia na forma de luz para a fotossíntese; e quimiotróficas, quando obtêm energia pela oxidação de compostos químicos. 3.2.1 Estrutura Celular das Bactérias A estrutura celular bacteriana corresponde a de uma célula procariótica, sem organelas envolvidas por membranas, tais como mitocôndrias ou cloroplastos. Nessas células, geralmente, a única membrana presente é a membrana plasmática. Além disso, não possuem um núcleo rodeado por um envoltório nuclear e não têm o DNA organizado em verdadeiros cromossomos, como os das células eucariontes. A célula da bactéria é delimitada por uma membrana plasmática em torno da qual se encontra uma espessa e rígida camada, a parede bacteriana. Por fora da parede, pode ocorrer uma terceira camada, viscosa, que, em algumas espécies, é espessa, constituindo a cápsula. A membrana plasmática das bactérias é uma estrutura lipoprotéica que serve como barreira para os elementos presentes no meio circundante. Nela se situam as moléculas receptoras, as proteínas relacionadas com o transporte transmembrana e as moléculas da cadeia respiratória análogas à existente na membrana das mitocôndrias das células eucariontes. Às vezes, a membrana plasmática sofre invaginações, denominadas mesossomas, que nunca dela se libertam. Estudos demonstram que a função dos mesossomas está associada à produção de energia ou com a divisão dessas células. 8 A parede celular bacteriana é uma estrutura rígida que recobre a membrana citoplasmática, confere forma às bactérias e serve como proteção mecânica. Biologia Molecular da Célula; Alberts et al, 2010. O citoplasma das bactérias delimita um único compartimento que contém pequenos grânulos citoplasmáticos, os ribossomos. Os ribossomos são constituídos por rRNA e proteínas e possuem uma subunidade maior e outra menor. Os ribossomos estão contidos em polissomos e neles acontece a síntese proteica. O citoplasma também contém água, íons, outros tipos de RNAs, proteínas estruturais e enzimáticas, diversas moléculas pequenas etc. O nucleoide não é um verdadeiro núcleo, já que não está delimitado do resto da célula por membrana. O nucleoide é formado por um filamento circular de DNA, localizado próximo ou mesmo ligado à membrana plasmática. Consiste em uma única grande molécula de DNA com proteínas associadas. É possível, às vezes, evidenciar mais de um cromossomo numa bactéria em fase de crescimento, uma vez que a sua divisão precede a divisão celular. O cromossomo bacteriano contém todas as informações necessárias à sobrevivência da célula e é capaz de auto replicação. Algumas bactérias possuem, além do DNA no nucleoide, outros filamentos circulares de DNA, extra cromossômicos e muito pequenos, denominados de plasmídeos. Os plasmídeos são moléculas autônomas, isto é, são capazes de autoduplicação independente da replicação do cromossomo e podem existir em número variável no citoplasma bacteriano. São comumente trocados na “reprodução sexual” entre bactérias. Os plasmídeos têm genes para a própria replicação e genes que protegema célula contra os antibióticos. Todavia, não são essenciais para a vida da bactéria. Utilizando-se técnicas de engenharia genética, é possível isolar os plasmídeos, inserir-lhes fragmentos específicos de DNA (genes) e então transplantá-los a outras bactérias. 3.3 Eucariotos As células eucariontes serão o alvo principal dos nossos estudos, elas são muito maiores que as células procariontes, frequentemente tendo um volume celular, no mínimo, mil vezes maior. Dentre os organismos formados por células eucariontes podemos citar os animais, as plantas, os fungos e os protozoários – um grupo de micro-organismos unicelulares muito Acima: Esquema mostrando a morfologia de um procarioto típica com seus componentes celulares. Abaixo: Micrografia Eletrônica de uma bactéria semelhante à representada acima. 9 diverso. A organização interna das células eucariontes é complexa. Nela, duas partes estão morfologicamente bem definidas — o citoplasma e o núcleo. O núcleo constitui um compartimento limitado por um envoltório nuclear e o citoplasma é envolto pela membrana plasmática. No citoplasma, uma variedade de organelas envolvidas por membranas estão presentes, como retículo endoplasmático, complexo de Golgi, lisossomos, peroxissomos, cloroplastos e mitocôndrias. Esses sistemas de endomembranas formam compartimentos que separam os diversos processos metabólicos, graças ao direcionamento das moléculas absorvidas e às diferenças enzimáticas entre as membranas dos vários compartimentos. Preenchendo o espaço entre essas organelas, encontra-se a matriz citoplasmática ou citosol. Além disso, as células eucariontes têm outro nível de organização interna - o citoesqueleto, responsável pelos movimentos e pela forma das células. As células das plantas e dos fungos são revestidas por uma parede celular rígida. Já as células dos animais e protozoários não apresentam tal estrutura. Biologia Molecular da Célula, Alberts et al, 2010. Esquema de uma célula animal típica com suas organelas. Observe a maior complexidade estrutural em comparação com a bactéria representada anteriormente. 10 Princípios de Biologia Celular; Alberts et al. Micrografia Eletrônica de parte de uma célula animal típica com as principais organelas assinaladas. 11 4. Bioenergética Para estudarmos o funcionamento de uma célula ou de um ser vivo multicelular precisamos entender que todos estamos sujeitos às leis da física e precisamos compreender como essas leis são importantes para o funcionamento celular. Na verdade, podemos pensar numa célula como sendo um sistema fechado onde ocorrem milhares de reações químicas por segundo. A diferença entre uma célula e o meio externo que a rodeia é que a célula é capaz de gerar ordem através de reações químicas. Em uma célula existem dois tipos de reações possíveis: as Catabólicas e as Anabólicas. As reações catabólicas são aquelas que degradam alimentos em moléculas menores, gerando energia e componentes necessários em outras reações. As reações anabólicas utilizam energia para gerar novos componentes a partir de subunidades mais simples. Ou seja, em uma célula, essas reações são complementares e o conjunto de todas elas define o Metabolismo celular. Precisamos entender então, que todas as reações químicas devem obedecer a 2a Lei da Termodinâmica, que diz que a Entropia (desorganização) de um sistema deve sempre aumentar. Assim, podemos imaginar que as células são ilhas de organização em meio a um mar de desordem. Para aumentar sua organização interna sem desobedecer a 2ª Lei da Termodinâmica, as células geram calor que aumenta a desordem externa do meio. Fundamentos de Biologia Celular 1999 Essa figura ilustra uma célula organizando macromoléculas no seu interior. Nesse processo há geração de calor que leva à desorganização das moléculas do meio externo, obedecendo assim a 2a Lei da Termodinâmica. As reações químicas só ocorrem se forem energeticamente favoráveis. Mesmo as reações energeticamente favoráveis precisam de uma energia de ativação para iniciarem. Para as moléculas presentes no meio aquoso intracelular essa energia de ativação é fornecida pelo choque aleatório das moléculas. Para aumentar a energia de choque entre as moléculas e assim ultrapassar a barreira da energia de ativação, seria necessário aumentar consideravelmente a temperatura da célula, o que é incompatível com a vida. Para contornar essa situação, as células contam com catalizadores capazes de diminuir a energia de ativação necessária nas reações: as Enzimas. Fundamentos de Biologia Celular 1999 12 A barragem da figura acima à esquerda representa a energia de ativação necessária para uma reação química acontecer. Mesmo com o constante bombardeamento das ondas sobre a barragem (agitação térmica das moléculas) as bolinhas verdes não conseguem ultrapassar a barreira. Na figura da direita houve um rebaixamento da barreira (diminuição da energia de ativação) e agora há um fluxo constante de bolinhas (reação química) morro abaixo. Uma determinada substância no meio intracelular pode sofrer uma variedade de reações químicas diferentes que vão originar produtos distintos. As enzimas são bastante seletivas quanto aos reagentes e aos produtos e conseguem dessa forma guiar uma sequência de reações com o objetivo de originar um produto específico. Como já foi dito anteriormente, as reações químicas só ocorrem se obedecerem a 2a Lei da Termodinâmica, ou seja, se aumentarem a desordem do sistema. No entanto, sabemos que as células estão constantemente criando “ordem”, seja na forma de macromoléculas complexas ou de seres vivos multicelulares. Essa aparente contradição só é possível devido ao acoplamento de reações, onde a realização de uma reação extremamente exotérmica (favorável), está ligada à realização de uma reação energeticamente desfavorável. Fundamentos de Biologia Celular 1999 A figura acima é um exemplo comum que mostra como um evento energeticamente favorável (pedras caindo de um barranco), podem ser acopladas `a realização de uma atividade energeticamente desfavorável (elevação de um balde d’água). As células fazem extenso uso de carreadores de energia para viabilizar a realização de reações químicas energeticamente desfavoráveis. Carreadores de Energia são moléculas que possuem ligações químicas energéticas (portanto desfavoráveis). A molécula carreadora de energia mais amplamente utilizada pelas células é o ATP (adenosina 5’-trifosfato). O ATP é gerado em larga escala durante a fosforilação oxidativa que ocorre nas mitocôndrias das células. Como o próprio nome sugere, o ATP possui três grupos fosfato ligados em sequência uns com os outros, essas ligações são muito instáveis e quando desfeitas liberam grande quantidade de energia. Essa energia é aproveitada pelas células para proporcionar a realização de inúmeras reações que não ocorreriam espontaneamente. 13 5. BIOMEMBRANAS Imagine o que seria de um país sem fronteiras: um verdadeiro caos, sem controle das pessoas e produtos que entram ou saem. O mesmo ocorre com as células, ou seja, elas necessitam de “fronteiras”, que delimitam seu território, assim como um país ou um estado. A membrana celular ou membrana plasmática é a estrutura responsável por delimitar os espaços interno e externo de uma célula. Assim, o espaço interno é denominado como espaço intracelular (dentro da célula) e o externo, espaço extracelular (fora da célula). Assim, a célula consegue manter uma composição química extremamente diversa do meio que a rodeia graças a uma fina membrana denominada membrana plasmática. Asmembranas na célula tem natureza lipoprotéica, ou seja, são compostas por lipídios e proteínas. Estas membranas também contêm pequenas porções de glicídios (carboidratos) as quais estão associadas aos lipídeos e às proteínas formando as glicoproteínas e os glicolipídios, respectivamente. As membranas das organelas celulares (Retículo Endoplasmático, Mitocôndrias, Complexo de Golgi...) possuem composição química e, portanto, propriedades funcionais semelhantes `membrana plasmática. Assim, ao estudarmos as propriedades de uma membrana podemos generalizar as observações para as demais. A membrana plasmática controla a entrada e a saída de moléculas e íons, apresentando uma permeabilidade diferencial ou seletiva. Algumas moléculas conseguem passar livremente pela membrana celular, contudo, outras não conseguem, necessitando de proteínas inseridas na membrana para realizar o transporte através dessa membrana. A seleção de moléculas que passam pela bicamada lipídica está relacionada ao seu tamanho, polaridade e carga. a) Tamanho: moléculas pequenas passam livremente pela membrana. b) Polaridade: moléculas apolares têm mais facilidade de passar pela membrana. Isso se deve ao fato de a bicamada lipídica também ser apolar. c) Carga: moléculas que possuem cargas, mesmo as pequenas, como os íons, não conseguem passar pela membrana, devido à sua natureza polar. O conjunto desses fatores indica que as moléculas que possuem maior facilidade para atravessar a membrana devem ser pequenas, apolares e sem carga tais como o O2 (oxigênio) e o CO2 (gás carbônico). No entanto, pequenas moléculas polares, como a água e o etanol, também são capazes de atravessar livremente as membranas da célula. A Célula; Carvalho e Recco-Pimentel (2007) Representação esquemática de uma bicamada lipídica mostrando a permeabilidade da membrana em relação a cada um deles. Observe que moléculas muito grandes ou carregadas eletricamente não atravessam livremente a membrana 14 5.1 Tipos de transporte através da membrana celular Quando estudamos os tipos de transporte através da membrana podemos analisar e agrupar os tipos de transporte sob dois pontos de vista: 1) se há ou não gasto de energia (Transporte Passivo x Transporte Ativo); 2) de acordo com a característica da proteína transportadora e da direção do transporte (Uniporte, Simporte, Antiporte). 5.1.1 Transporte Passivo No transporte passivo as substâncias (solutos) se difundem através da membrana. Essa passagem do soluto pela membrana sempre ocorre do meio mais concentrado para o menos concentrado, ou seja, a favor de um gradiente de concentração. O transporte passivo pode ocorrer por difusão simples ou difusão facilitada. 5.1.2 Difusão simples Difusão simples ocorre quando o soluto não tem problemas de passagem pela membrana, em geral são substâncias pequenas e sem carga tais como água, oxigênio e gás carbônico. Na difusão simples o transporte ocorre sempre a favor do gradiente de concentração, sem o gasto de energia e as moléculas podem atravessar a membrana celular tanto através da bicamada lipídica quanto por meio das proteínas presentes na membrana (proteínas que formam poros na membrana). Quando a substância a ser transportada pela membrana é água utiliza-se o termo osmose. Há uma tendência de a água movimentar-se, preferencialmente, da solução menos concentrada de solutos (hipotônica) para solução mais concentrada de solutos (hipertônica). Assim, uma célula presente em um meio hipotônico, tende a intumescer devido à absorção de água por osmose, enquanto que, em meio hipertônico, tende a perder volume, devido ao movimento de saída de água. 5.1.3 Difusão facilitada Na difusão facilitada, assim como na difusão simples ocorre o movimento de uma substância de uma região de alta concentração para uma de baixa concentração sem o gasto de energia. Contudo, na difusão facilitada, a molécula a ser transportada liga-se a uma proteína carreadora, que será responsável por transportar a molécula através da membrana celular. Devido a essa característica essas proteínas são denominadas transportadoras ou permeases. Um exemplo de difusão facilitada é o transporte de água e glicose. Observe que a água pode passar pela membrana por difusão simples, contudo em algumas situações no organismo, há necessidade de movimentos rápidos de água como nos eritrócitos e células tubulares renais onde a água se difunde através de proteínas transportadoras denominadas aquaporinas da membrana plasmática. 5.1.4 Transporte ativo No transporte ativo ocorre o inverso, os solutos são transportados de uma região de baixa concentração para uma de alta concentração, isso significa dizer que o transporte é feito contra um gradiente de concentração de soluto. Nesse tipo de transporte, há consumo de energia na forma de ATP (adenosina trifosfato). A bomba de sódio/potássio (Na+/K+) é um exemplo de transporte ativo. 5.1.5 Uniporte, Simporte, Antiporte Quando o transporte é realizado através da membrana por meio de uma proteína transportadora, estamos falando sempre de proteínas especializadas no transporte de substâncias específicas. Caso essa proteína seja capaz de transportar apenas uma substância de forma unidirecional, estamos falando de um Uniporte (lembrando sempre que esse transporte pode ser passivo ou ativo dependendo se houve ou não gasto de energia). Porém existem casos de proteínas transportadoras que carregam duas moléculas diferentes através da membrana ao mesmo tempo, neste caso estamos falando de um co- 15 transportador. Os co-transportadores podem ser do tipo Simporte ou Antiporte. No Simporte, as duas substâncias são transportadas através da membrana em uma mesma direção, enquanto que no Antiporte as duas substâncias são transportadas em direções opostas. Novamente precisamos nos lembrar que esses tipos de transporte podem ser Ativos ou Passivos dependendo se houve gasto de energia ou não. Esquema ilustrando os três tipos de transporte facilitado descritos aqui. 16 6. CITOESQUELETO O citoesqueleto está presente em todas as células eucarióticas e ausente nas células procarióticas. As fibras e túbulos que compõe os diferentes elementos do citoesqueleto, são formados por proteínas (monômeros) que se organizam de forma mais estável ou menos estável, dependendo da situação. Os elementos que constituem o citoesqueleto são divididos em: microtúbulos, filamentos de actina (microfilamentos) e filamentos intermediários. Além destas estruturas, que têm a forma de filamentos, também são encontradas proteínas acessórias associadas a eles, que auxiliam nas funções desempenhadas pelo citoesqueleto. De forma geral, o citoesqueleto é responsável por: - Manter a forma das células; - Organizar as organelas no espaço intracelular; - Promover movimentos celulares envolvidos em processos de migração celular e emissão de pseudópodes; - Promover movimento de organelas no interior da célula. Além disso, o citoesqueleto desempenha funções importantes nos processos de adesão entre células e das células com o meio extracelular, na contração muscular e na estrutura e função de cílios e flagelos, como veremos a seguir. Assim, é fácil perceber que o citoesqueleto desempenha funções que vão muito além de ser apenas o “esqueleto da célula”. 6.1 Microtubulos Microtúbulos são encontrados distribuídos pela célula irradiando-se a partir do “Centro Organizador de Microtúbulos”(MTOC na sigla em inglês), esses microtúbulos são utilizados como “trilhos” sobre os quais proteínas motoras movimentam organelas e vesículas de secreção distribuindo-as no interior da célula.Biologia Molecular da Célula, Alberts et a, 2010l. Esquema geral mostrando a organização de microtúbulos, no interior de algumas células, partindo do centro organizador. Os microtúbulos, juntamente com suas proteínas acessórias também são os responsáveis pela sustentação e pelo movimento de especializações da membrana plasmática como os cílios e os flagelos. Nessas estruturas os microtúbulos encontram-se organizados formando um axonema. 17 Micrografias Eletrônicas mostrando o corte transversal de dois axonemas com seus diversos componentes: Microtúbulos, Proteínas de Ancoragem e Proteínas Motoras. As duas fotografias pertencem a espécies de insetos diferentes, por isso apresentam arranjos diferentes dos microtúbulos. 6.2 Filamentos de Actina Eles são encontrados logo abaixo da membrana plasmática, formando um córtex celular importante para a manutenção da estrutura e para os movimentos celulares, como aqueles que acontecem na endocitose, exocitose e fagocitose. Além disso, os microfilamentos desempenham papel importante na sustentação de microvilosidades e estereocílios, na contração muscular e na citocinese (separação do citoplasma na divisão) de células animais. 18 Biologia Molecular da Célula, Alberts et al. Esquema geral mostrando a organização cortical dos microfilamentos de actina em uma célula animal típica. Observe que esses filamentos formam o cerne central das microvilosidades. Micrografias eletrônicas de microvilosidades, mostrando o arcabouço de filamentos de actina no seu interior. Esquerda: Microvilosidades em corte transversal Direita: Microvilosidades em corte longitudidal Biologia Molecular da Célula, Alberts et al. 6.3 Filamentos Intermediários Os filamentos intermediários são formados por proteínas fibrosas que se agrupam para formar uma estrutura semelhante a uma corda com aproximadamente 10 nm de espessura. A estrutura formada é mais estável, resistente a tensão, que microtúbulos e microfilamentos, e não está diretamente envolvida em movimentos celulares. A constituição das proteínas varia conforme o tipo celular. Como os filamentos intermediários são mais estáveis, suas principais funções são manter a estrutura e conferir resistência mecânica à célula, além de fazer a integração entre os outros componentes do citoesqueleto e manter a posição de organelas, como o núcleo. 19 Biologia Molecular da Célula, Alberts et al. Representação esquemática mostrando a relação entre a rede de filamentos intermediários e os desmossomos. P. Brito Micrografia Eletrônica de um desmossomo mostrando uma grande quantidade de filamentos intermediários associados. 20 7. NÚCLEO A presença do núcleo é a principal característica que diferencia as células eucarióticas das procarióticas. No interior dessa organela encontramos o material genético das células (DNA), que associado com outras moléculas são os responsáveis pela regulação das atividades celulares e pela hereditariedade. Sempre que se observa ao microscópio uma célula de eucarioto, a estrutura que se destaca dentre as demais é o núcleo. Essa é sem dúvidas a maior e mais evidente organela celular. O núcleo normalmente é arredondado, com seu formato acompanhando a morfologia celular, ou seja, células alongadas possuem núcleos elípticos e células cúbicas possuem núcleos esféricos. No entanto, algumas células possuem núcleos polimórficos como neutrófilos, enquanto alguns tipos celulares, como as hemácias, são anucleados quando maduros. P. Brito Esquerda: Micrografia mostrando que a forma dos núcleos (seta) costuma acompanhar o formato celular. Direita: Micrografia de um Neutrófilo (célula de defesa do sangue), mostrando que alguns tipos celulares apresentam núcleo com morfologia complexa. O material genético (DNA) dos eucariotos encontra-se organizado no interior do núcleo celular. No entanto, seria uma simplificação dizer que o núcleo é composto apenas por DNA. Além de DNA, é possível se encontrar a cromatina (proteína + DNA), o nucléolo e o nucleoplasma. 7.1 DNA O DNA é um polímero formado por duas cadeias longas de polinucleotídeos. Um nucleotídeo é uma molécula formada por 1 açúcar de 5 carbonos (pentose) + 1 ou mais grupos fosfato + 1 base nitrogenada. No caso do DNA o açúcar é a Desoxirribose e as bases nitrogenadas podem ser de quatro tipos (adenina, timina, citosina, guanina). Na fita de DNA (polímero), as ligações químicas ocorrem envolvendo a pentose e o fosfato, formando um esqueleto ...açúcar-fosfato-açúcar-fosfato..., nessa conformação, a única diferença entre os nucleotídeos é a composição das bases nitrogenadas. Por isso, para simplificar, podemos distinguir os nucleotídeos apenas pelas letras iniciais das bases nitrogenadas (A, T, C, G). A sequência de bases nitrogenadas contém a informação sobre a constituição de aminoácidos de todas as proteínas de uma célula, controlando dessa forma todo o metabolismo celular. A sequência de todas as bases nitrogenadas contidas na célula de um indivíduo é chamada genoma. O DNA apresenta a tendência natural a formar uma fita dupla e quando duas fitas de DNA se combinam, as bases nitrogenadas (que ficam no interior da fita dupla) interagem formando pontes de hidrogênio entre si. Uma adenina (A) sempre se liga a uma timina (T) e uma citosina (C) sempre se liga a uma guanina (G). Ou seja, uma fita de DNA é complementar à outra. Assim, uma fita de DNA pode ser usada como molde para síntese da outra fita, explicando a base molecular da hereditariedade. Ou seja, a informação genética consegue ser duplicada com pequena margem de erro a cada ciclo de divisão celular. A fita dupla de DNA se enrola em uma dupla hélice, por isso quando representamos esquematicamente uma molécula 21 de DNA, a representamos sempre como uma “escada em espiral” em que os “degraus” são as bases nitrogenadas. Podemos numerar os átomos de carbono da Desoxirribose de acordo com as regras de nomenclatura química, assim os seus carbonos serão numerados de 1’ (lê-se “um linha”) a 5’. Dessa forma, a fita de DNA possui uma polaridade estrutural, sendo que as duas fitas de DNA são antiparalelas, ou seja, enquanto uma está no sentido 5’→3’, a outra está no sentido 3’→5’. Esquerda: Modelo simplificado em espiral do DNA mostrando as bases nitrogenadas complementares no seu interior. Direita: Modelo mais detalhado de um pequeno fragmento de DNA evidenciando as fitas antiparalelas. 7.2 Cromatina No núcleo das células, as moléculas de DNA encontram-se associadas com diferentes tipos de proteínas. Essas proteínas são como carretéis onde a linha (o DNA) se enrola. Portanto, a associação da molécula de DNA com suas proteínas correspondentes é denominada CROMATINA. Essas proteínas podem ser classificadas em dois grupos: as histonas e as proteínas não histonas. Histonas são proteínas básicas que formam um octâmero em forma de disco ao redor do qual o DNA se enrola. Com o tratamento correto é possível se observar com o auxílio de um microscópio eletrônico uma estrutura que se assemelha a um “colar de contas”. As proteínas não histonas associadas ao DNA ajudam, dentre outras coisas, na compactação da cromatina e também na regulação da expressão gênica. Durante a maior parte do ciclo de vida de uma célula, é possível se diferenciar com um microscópio de luz, duas regiões distintas na cromatina celular: Heterocromatina e Eucromatina. Heterocromatina é a região mais condensada da cromatina e representa aproximadamente 10% do material genético. Os genes que se encontram na heterocromatina são silenciados e não expressam seusprodutos. A heterocromatina apresenta-se condensada, independente da fase do ciclo celular. 22 A região de Eucromatina representa o restante do material genético, nela estão presentes genes com diferentes graus de expressão. A eucromatina apresenta-se descondensada na maioria das células, podendo aparecer sob a forma condensada em alguns tipos celulares ou fases específicas do desenvolvimento celular Existe uma relação entre o grau de condensação da cromatina e sua atividade gênica, ou seja, células com alta taxa metabólica e em síntese proteica, possuem cromatina descondensada devido à atividade de transcrição, que resulta na formação de diferentes tipos de RNA. Da mesma forma, células com baixa atividade metabólica apresentam pouca cromatina descondensada. 7.2 Nucléolo O nucléolo normalmente é a estrutura nuclear mais facilmente visualizada, mesmo sem coloração, in vivo, em microscópio de luz convencional, graças a seu alto índice de refração. Em alguns casos, os nucléolos não são vistos por estarem mascarados pela presença de cromatina densa. O nucléolo é uma região especializada do núcleo cuja função é produzir ribossomos. Seu tamanho e forma variam de acordo com o tipo celular e o estado funcional da célula. Normalmente é observado apenas um nucléolo por célula, mas isso não é uma regra e algumas células podem possuir mais de um nucléolo. P. Brito Micrografia de um ovócito de mamífero. Observe que o ovócito é muito maior que as demais células que o cercam e possui no seu centro um núcleo (N) com nucléolo (seta) bem evidente, indicando uma alta taxa metabólica. O nucléolo não é delimitado por membranas e é constituído por sítios de diferentes cromossomos que possuem os genes envolvidos na produção de ribossomos. Esses sítios chamados NOR (Regiões Organizadoras do Nucléolo) podem estar distribuídos em mais de um cromossomo e agrupam-se formando o nucléolo. No nucléolo também são encontradas muitas moléculas de rRNA (RNA ribossomal) além de ribonucleoproteínas que se associam ao rRNA para a constituição dos ribossomos. Durante a divisão celular o nucléolo sofre alterações morfológicas e desaparece, reorganizando- se novamente ao final do processo. 23 7.3 Envoltório Nuclear O envoltório nuclear define o limite do núcleo celular. Na literatura encontramos diferentes nomenclaturas para essa estrutura (Carioteca, Envelope Nuclear, Nucleolema...), no entanto, parece que o termo ENVOLTÓRIO NUCLEAR define melhor a complexidade morfológica e funcional dessa estrutura. O envoltório nuclear é formado por duas membranas concêntricas e contínuas, mas com composição proteica distinta. Biologia Molecular da Célula; Alberts et al, 2010. Esquema geral da organização do núcleo de uma célula eucariótica típica, com um nucléolo bem desenvolvido e algumas regiões de heterocromatina. Observe a continuidade da membrana externa do envoltório nuclear com o Retículo Endoplasmático. Observe também a presença de poros nucleares e da Lâmina basal justaposta ao envoltório nuclear. Membrana Nuclear Interna: Proteínas que atuam como local de ancoramento de cromatina e lâmina nuclear. Membrana Nuclear Externa: Contínua com a membrana do Retículo Endoplasmático e pode conter ribossomos aderidos a sua superfície. 7.3.1 Lâmina Nuclear A lâmina nuclear é uma estrutura variável de constituição proteica que se associa à face interna do envoltório nuclear. As proteínas que constituem a lâmina nuclear são chamadas laminas nucleares (lê-se lamínas) e pertencem à família dos filamentos intermediários do citoesqueleto. 24 8. Transcrição e Tradução 8.1 Transcrição As regiões do ácido desoxirribonucleico (DNA) que originam ácido ribonucleico (RNA) são denominados genes, assim, os produtos finais dos genes são moléculas de RNA as quais são responsáveis pela produção de proteínas. A transcrição (Tabela) é a síntese de uma molécula de RNA a partir da informação contida em um filamento molde de DNA. Diferentemente do DNA, a molécula de RNA é uma fita única composta pelos nucleotídeos citosina e guanina; adenina e uracila (observe que a uracila é encontrada no lugar da timina presente no DNA). Da mesma forma que no DNA, os nucleotídeos do RNA são unidos por ligações fosfodiéster. As enzimas responsáveis pela síntese dos RNAs são denominadas de RNA polimerases. Essas enzimas utilizam a complementaridade das ligações entre as bases nitrogenadas (A-U, C- G) para produzir uma fita de RNA complementar à fita molde de DNA. Todos os RNAs são sintetizados na direção 5’→3’. Existem três classes mais comuns de moléculas de RNA e as três são encontradas tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. São elas: RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência ou transportador (tRNA) e RNA mensageiro (mRNA). Cada uma possui papel específico no processo de tradução (tabela), que é a produção de proteínas a partir de um molde de RNA mensageiro. Processo Função Replicação Duplicação do DNA Transcrição Produção de RNA a partir de DNA Tradução Produção de Proteína a partir de RNA (RNA mensageiro) O filamento de DNA que é transcrito para RNA mensageiro é denominado filamento molde. O filamento complementar de DNA é denominado filamento não molde (lembre-se que os RNAs são sintetizados na direção 5’→3’. Exemplo: DNA - Filamento não molde: 5`CTGCCATAGGGC3` DNA - Filamento molde: 3’GACGGTATCCCG5’ RNA: 5`CUGCCAUAGGGC3` Após a sua síntese, as extremidades dos mRNA eucarióticos são modificadas de maneira específica. Todos os mRNA eucarióticos possuem um “quepe” de nucleotídeo guanina metilada na sua extremidade 5’. Na extremidade 3’ ocorre a adição de vários (30-100) resíduos de adenina formando uma cauda de poli A (figura abaixo) Molécula de RNA mensageiro com o CAP na região 5’ e a cauda poli-A na região 3’ (https://www.google.com.br/search?q=cap+e+cauda+poliA) Nos eucariontes os mRNA são sintetizados como grandes precursores, compostos de éxons (sequências codificadoras) e íntrons (sequências intervenientes ou não codificadoras) que precisam ser retirados em um processo denominado splicing, antes de se tornarem 25 funcionais. Esse processamento normalmente envolve a remoção dos íntrons e a ligação dos éxons na sequência do gene. Vale a pena lembrar que nas células eucariotas, todo o processo de transcrição e posterior processamento do pré-RNA mensageiro ocorre no núcleo da célula e o RNA mensageiro depois de pronto precisa ser exportado para o citoplasma. Já nos organismos procariotos essa divisão não existe, assim como não há processamento do RNA mensageiro. Outra diferença é que nos procariotos um mesmo RNA mensageiro pode conter sequências para várias proteínas. Ilustração comparativa entre os processos de Transcrição e Tradução em células Eucariotas e Procariotas O processo de transcrição dos RNAs pode ser dividido em três fases: iniciação, alongamento e terminação. Durante a iniciação ocorre a ligação de uma RNA polimerase a região do promotor no DNA que determina que aquele gene especificamente será transcrito. Quando um sinal de terminação é atingido ocorre a liberação do RNA e da enzima que poderá catalisar outros processos de transcrição. As moléculas de RNA transportador funcionam como adaptadores que levam os aminoácidos para local de síntese de proteínas. Já os RNA ribossômicos associam-se às proteínas ribossômicas para formar o ribossomo funcional que servirá de suporte e sítio catalítico para as moléculas de RNA mensageiro e RNA transportador interagirem e produzirem proteínas.8.2 Tradução O produto final da maioria dos genes é a proteína, contudo alguns genes podem ter como produto final o RNA (por exemplo os genes que produzem RNA transportador e RNA ribossômico). A síntese de proteínas ou tradução é a etapa final da transferência da informação genética. 26 São três os principais componentes da tradução: 1) o RNA mensageiro (RNAm) possui a informação de nucleotídeos necessária para a síntese de proteínas; 2) o RNA transportador (RNAt) responsável por carregar e auxiliar na adição dos aminoácidos que serão incorporados à proteína; 3) os ribossomos que contém RNA ribossômico e proteínas, com a função de servir de suporte para que os códons do RNA mensageiro se liguem aos anticódons do RNA transportador, permitindo a extensão da proteína (figura abaixo). Os nucleotídeos do RNAm sempre são lidos em grupos de três (códons) e as bases nitrogenadas desses nucleotídeos devem se ligar de forma complementar com as bases nitrogenadas do anticódon presente no RNAt. Dessa forma, garante-se que os aminoácidos corretos (trazidos pelo RNAt) sejam inseridos na proteína que está sendo produzida. O primeiro códon a ser lido sempre será o AUG que codifica para metionina (ou formil-metionina em procariotos). http://www.tudomaisumpouco.com/aulabio2.html Ligação do anticódon (presente na molécula de RNA transportador) aos códons (nucleotídeos presentes na molécula de RNA mensageiro). Cada código triplo possui informação para um determinado aminoácido. Assim, a mensagem genética está contida em um código triplo. Somente uma das quatro bases existentes no RNA (A, T, C e U) três a três pode gerar o número de combinações ou códons (64) necessários para codificar cada um dos 20 aminoácidos que podem ocorrer nas proteínas. Dessa forma, o ribossomo move-se ao longo de três bases por vez e não existe qualquer base interveniente entre os códons. O código é degenerado, porque mais de um códon podem codificar o mesmo aminoácido (veja tabela após as questões) e universal, porque é o mesmo seja em procariotos ou eucariotos. Três códons (UAA, UAG e UGA) não especificam aminoácido e são utilizados como sinais para interromper a síntese de uma proteína. O códon AUG, que especifica somente a metionina, tem um duplo papel: ele codifica a metionina em qualquer lugar em que ele se encontre no RNA e também marca o início da síntese proteica. 8.3 Ribossomos Nas células, a maquinaria responsável pela tradução, ou seja, leitura do RNAm, através dos anticódons do tRNA e a consequente união dos aminoácidos na cadeia peptídica, são os Ribossomos. Os ribossomos são formados por proteínas e RNA ribossômico (rRNA). Cada ribossomo é formado por duas subunidades, maior e menor, essas subunidades são formadas no nucléolo das células e exportadas separadamente para o citoplasma. As subunidades ribossomais só permanecem unidas durante a síntese proteica, quando o processo termina, elas voltam a se separar. Os ribossomos são responsáveis por posicionar adequadamente mRNA e tRNA e também de fornecer as condições para a formação das ligações peptídicas entre os aminoácidos. Dependendo do tipo de proteína que está sendo produzida, essa síntese pode ser realizada por ribossomos livres do citoplasma (originando proteínas solúveis do citoplasma). Caso a proteína que está sendo codificada por um mRNA seja uma proteína de exportação, ou que precisa ser 27 modificada em outras organelas da célula, o ribossomo que a está produzindo pode se aderir temporariamente à membrana do Retículo Endoplasmático Rugoso (assunto do próximo capítulo). 28 9. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO As células possuem um sistema de organelas membranosas (endomembranas) que atuam de maneira conjunta em uma via biossintética secretora. Fazem parte dessa via o Retículo Endoplasmático (RE), o Complexo de Golgi e as vesículas de secreção. O retículo endoplasmático é principalmente um local de síntese no interior da célula, ele é constituído por membranas que delimitam um espaço interno ou luz. Dois tipos de RE estão presentes na célula eucariótica: RE rugoso (RER) ou granular e RE liso (REL) ou agranular. O RER apresenta ribossomos em sua superfície, é contínuo com a membrana externa do núcleo e é composto por sacos achatados interconectados. O REL é formado por membranas sem ribossomos na superfície e formam uma rede de túbulos conectados. Existe uma continuidade física entre o RER e o REL, além que eles podem se converter um no outro de acordo com a necessidade da célula. As proteínas sintetizadas por ribossomos aderidos ao retículo endoplasmático rugoso são modificadas no complexo de Golgi e transportadas por meio de vesículas revestidas por membrana para vários destinos na célula, como a membrana plasmática, os lisossomos ou secretadas para o meio extracelular. Esse processo, onde uma vesícula transportadora é formada em uma organela e se funde em outra organela é denominado tráfego de vesículas. Ainda há outro caminho que pode acontecer nesse tráfego que é no sentido inverso da via secretora, ou seja, do meio extracelular para o intracelular em direção aos lisossomos. Essa via é denominada via endocítica. http://www.escuelapedia.com/reticulo-endoplasmatico/ Esquema mostrando a relação entre o REL e o RER. Observe que o retículo endoplasmático é contínuo com a membrana do Envoltório Nuclear. 9.1 Retículo Endoplasmático Liso O REL tem como funções a síntese de lipídios que compõem as membranas celulares, a síntese de hormônios esteroides em células endócrinas (gônadas e córtex da adrenal), a desintoxicação nas células hepáticas, a participação no metabolismo do glicogênio no fígado e atua no armazenamento e liberação controlada de íons cálcio. 29 9.2.1 Síntese Proteica e Retículo Endoplasmático Rugoso O processo de síntese proteica já foi tratado em um tópico anterior, o que precisamos entender aqui é que proteínas também podem ser sintetizadas por ribossomos aderidos à membrana do retículo endoplasmático. Todas as proteínas são codificadas por RNA mensageiros produzidos no núcleo das células e exportados para o citoplasma após seu devido processamento. Inicialmente todas as proteínas são produzidas por ribossomos livres no citoplasma da célula. As proteínas destinadas à exportação ou às outras organelas são então direcionadas para o Retículo Endoplasmático através de uma sequência sinalizadora. Uma vez que essa sequência é reconhecida, o ribossomo que está produzindo essa proteína fica temporariamente aderido à membrana do RE e a proteína sofre um processo de importação co-traducional, para o RE. Depois que a síntese proteica termina, o ribossomo torna-se livre novamente e não permanece aderido ao RE. Quando a proteína alcança a luz do RER (ou no caso das proteínas de membrana, permanece aderida à sua membrana) ela começa a sofrer algumas modificações mediadas pelas enzimas do RE. Dentre essas modificações podemos citar: 1) glicosilação, a adição de oligossacarídeos é completada no Complexo de Golgi, mas tem início ainda no RE; 2) formação de pontes dissulfeto entre os resíduos de cisteína; 3) correto dobramento das proteínas, auxiliado pelas proteínas chaperonas. A maioria das proteínas produzidas pelo RER não se destinam e essa organela e devem ser transportadas para seus destinos. As proteínas sintetizadas pelos ribossomos associados às membranas do RER são conduzidas aos seus destinos por meio de vesículas revestidas por membranas. Dependendo do tipo de proteína produzida, elas podem ter diferentes destinos: 1) secreção celular; 2) proteínas constituintes da membrana plasmática; 3) lisossomos; 4) proteínas residentes dosretículos ou do Complexo de Golgi. 9.2.2 Glicosilação Enquanto a proteína ainda está sendo sintetizada pelo ribossomo e translocada para a luz do RE, oligossacarídeos são acrescentados à mesma. Esses oligossacarídeos são idênticos, formados por 14 monossacarídeos (3 glicoses, 9 manoses e 2 N-acetilglicosamina) e são acrescentados em bloco (em uma única reação) nas proteínas. Eles se ligam ao grupo lateral amina (NH) das asparaginas que entram no RE, por isso são chamados de N-ligados. Ainda no RE esses oligossacarídeos são processados, retirando as 3 glicoses e 1 manose, posteriormente, no Complexo de Golgi, esse processamento é completado. 30 10. COMPLEXO DE GOLGI Grande parte das proteínas e lipídeos produzidos no RE tem como destino a superfície celular ou o meio extracelular. No entanto, antes que esses produtos possam ser exportados, eles precisam passar por uma etapa intermediária de processamento, modificação e endereçamento. Tais processos ocorrem no Complexo de Golgi (CG). Em células secretoras o Complexo de Golgi normalmente localiza-se entre o RE e a membrana plasmática. Biologia Molecular da Célula, Alberts et al, 2010. Estudos de microscopia eletrônica revelaram que o CG é constituído por de 4 a 8 cisternas achatadas sobrepostas. As membranas das cisternas possuem, além dos lipídios e fosfolipídios, enzimas envolvidas no processamento de proteínas, lipídios e polissacarídeos. Na luz das cisternas encontram-se principalmente mono e polissacarídeos, além das proteínas em trânsito que estão sendo processadas em cada cisterna. Cada uma dessas cisternas possui uma composição química e enzimática específica, e isso está associado ao funcionamento da organela já que as modificações nas moléculas que passam pelo CG ocorrem em sequência. A face do CG voltada para o núcleo é chamada cis e a face voltada para a membrana plasmática trans. Assim as cisternas podem ser classificadas como cis, média e trans, além disso, existem a rede cis e a rede trans, que são os compartimentos localizados nas extremidades do CG. Muitas das proteínas, lipídeos e proteínas de membrana provenientes do RE quando chegam ao CG sofrem importantes alterações estruturais, sendo a mais marcante delas a glicosilação (adição ou modificação de oligossacarídeos). A porção glicídica adicionada ajuda as proteínas a assumirem sua conformação tridimensional, além disso, estão envolvidas em processos de adesão e reconhecimento celular. Os glicídeos adicionados às proteínas podem ser adicionados ao grupo lateral amina (NH2) de resíduos de asparagina, oligossacarídeos N-ligados, ou a radicais hidroxila (OH) de resíduos de serina ou treonina, oligossacarídeos O-ligados. 10.1 Oligossacarídeos O-ligados Geralmente esses oligossacarídeos são sintetizados apenas no CG. Inicialmente um resíduo de N-acetilgalactosamina é adicionado ao radical OH lateral de uma serina ou uma treonina nas cisternas cis do CG. Depois, outros monossacarídeos são adicionados sem uma ordem determinada, originando estruturas variáveis, ramificadas e complexas. Em cada cisterna, novos monossacarídeos podem ser adicionados, caracterizando o processamento sequencial que ocorre nas cisternas do CG. 10.2 Oligossacarídeos N-ligados A síntese de oligossacarídeos N-ligados no CG, na verdade é a continuação do processamento do oligossacarídeo adicionado ao resíduo de asparagina ainda no RE. Esse oligossacarídeo começa a ser processado no RE onde alguns carboidratos são removidos. No CG, dois tipos de oligossacarídeos podem resultar do processamento: “oligossacarídeos ricos em manose” e “oligossacarídeos complexos”. 31 Os oligossacarídeos ricos em manose sofrem pouca alteração estrutural no CG. Nenhum monossacarídeo é adicionado, mas um ou mais resíduos de manose podem ser removidos na cisterna cis. Nos oligossacarídeos complexos algumas manoses podem ser removidas nas cisternas cis e média e em sequência uma variedade de monossacarídeos pode ser adicionada nos outros compartimentos. Dessa forma são originados oligossacarídeos complexos, variados e ramificados. A Célula; Carvalho e Recco-Pimentel, 2007 Esquema mostrando as possíveis modificações que um oligossacarídeo pode sofrer ao longo do CG para originar ou Oligossacarídeos Ricos em Manose, ou Oligossacarídeos Complexos. 10.3 Transporte e amadurecimento de substratos no CG Para que os substratos originados do RE possam entrar em contato com as diferentes enzimas presentes nas cisternas do CG, é preciso haver um trânsito dessas substâncias. Existem duas hipóteses que explicam esse trânsito, a hipótese do “Transporte de Vesículas” e hipótese da “Maturação das Cisternas”. 10.3.1 Transporte de Vesículas A hipótese do transporte por vesículas defende que as cisternas são relativamente estáveis com uma população específica de proteínas e enzimas. Vesículas membranosas com proteínas e lipídeos vindos do RE se fundem à rede cis do CG. A partir desse momento, quando esses componentes sofrerem as modificações típicas daquela cisterna, eles serão endereçados para a próxima cisterna, serão agrupados e uma nova vesícula será formada. Essa vesícula se funde na cisterna seguinte e o processo se repete até a rede trans do CG, caracterizando um transporte anterógrado. Esse processo envolve um mecanismo de endereçamento e seleção de produtos complexos, controlados por proteínas adaptadoras. Mesmo assim, alguns produtos podem ser transportados indevidamente e precisam voltar para a cisterna anterior, ou mesmo para o RE. Por esse motivo existe também um transporte retrógrado de vesículas que ajuda a manter a estabilidade do RE e do CG. 32 10.3.2 Maturação de Cisternas A hipótese da maturação das cisternas indica que os produtos permaneçam dentro das cisternas do Golgi e as cisternas vão amadurecendo com a modificação e alteração dos seus produtos. Assim, novas cisternas vão se formando na face cis, enquanto outras vão se desfazendo na face trans. Nesse modelo, o transporte das vesículas estaria envolvido no transporte das enzimas necessárias em cada etapa do amadurecimento das cisternas. Atualmente os dois modelos são aceitos como verdadeiros e podem acontecer simultaneamente em uma célula, dependendo da necessidade e do estado fisiológico da mesma. 10.4 Lisossomos Os lisossomos são organelas esféricas, de tamanho variável, delimitadas por membrana. Lisossomos são organelas responsáveis pela digestão intracelular, por isso acumulam cerca de 40 enzimas hidrolíticas no seu interior. Essas enzimas são capazes de degradar diferentes componentes, no entanto as membranas dos lisossomos possuem uma cobertura interna de carboidratos que evitam que a própria membrana seja digerida. Com o passar do tempo as células podem acumular resíduos que não foram digeridos pelos lisossomos no seu interior. 10.5 Formação dos Lisossomos Os lisossomos são originados a partir da rede trans do CG. Nesse local surgem pequenas vesículas contendo pré enzimas lisossomais. Essas enzimas ainda não se encontram no seu estado ativo. Quando essas vesículas se fundem a endossomos, originando endossomos tardios, inicia-se um processo de acidificação do interior do endossomo, graças a bombas de prótons presentes na membrana dos lisossomos. O pH dessas vesículas fica abaixo de 6 e as pré-enzimas lisossomais se desligam dos seus receptores e alcançam o estado ativo. Essa transição de endossomo tardio para lisossomo não apresenta alterações morfológicas visíveis, mas pode ser detectada a partir de técnicas de marcação específicas. 33 11. MITOCÔNDRIA Imagine uma cidadesem energia elétrica. Para gerar energia, uma cidade depende das usinas, que podem ser de diferentes tipos (hidroelétrica, termoelétrica, nuclear). E um organismo vivo, também depende de energia? Sim! Dependemos de energia para correr, trabalhar, ler, comer. Mas de onde vem a energia dos organismos vivos? Das organelas mitocôndria e cloroplasto. As mitocôndrias são organelas evolvidas na produção de energia a partir da degradação de alimentos (moléculas ricas em energia, como carboidratos e lipídeos), nas células eucarióticas para gerar ATP (Adenosina Trifosfato). A energia produzida nas mitocôndrias é utilizada pelas células por meio da quebra do ATP em ADP (Adenosina Difosfato) + Pi (fósforo inorgânico). Na quebra de cada mol de ATP são liberados cerca de 7,3 Kcal de energia. Novas moléculas de ATP são formadas nas mitocôndrias, ao se fosforilar (adicionar um grupamento fosfato) ao ADP, utilizando-se energia liberada nas reações de oxidação de compostos orgânicos. Quando as reações de oxidação produzem produtos finais apenas compostos inorgânicos (CO2 e H2O), a atividade é denominada respiração e a organela que participa dessa atividade é a mitocôndria. As mitocôndrias e cloroplastos possuem seu próprio genoma. Devido a essa característica alguns pesquisadores defendem a ideia de que eram organismos independentes e que foram englobados por outras células e mantiveram uma união favorável para ambas células. Esse pensamento originou a teoria da endossimbiose. 11.1 Estrutura das Mitocôndrias Em geral, as mitocôndrias possuem forma arredondada ou alongada e estão presentes no citoplasma das células eucarióticas no tamanho que varia de 0,5 a 1,0 µm. O número de mitocôndrias presentes no citoplasma varia de acordo com a necessidade energética das células. Assim, células com alta demanda de energia, como os espermatozoides, células musculares e células intestinais possuem de dezenas a milhares de mitocôndrias. Biologia Molecular da Célula; Alberts et al, 2010. Nessa representação esquemática observamos que as mitocôndrias normalmente se localizam nas regiões de grande demanda energética das células. As mitocôndrias são delimitadas por duas membranas de natureza lipoproteica (estrutura semelhante à das membranas plasmáticas das células): uma membrana externa e uma membrana interna. Essas duas membranas são separadas pelo espaço intermembranar ou espaço intermembrana. A membrana interna possui muitas invaginações que originam as cristas mitocondriais. A membrana interna delimita a matriz mitocondrial, onde encontra-se 34 o material genético das mitocôndrias (DNA e RNA), ribossomos e outras estruturas do metabolismo mitocondrial. Biologia Molecular da Célula; Alberts et al, 2010. Figura: Observe que as mitocôndrias se encontram no citoplasma celular. Sua estrutura, de fora para dentro, é composta por membrana externa, espaço intermembranas, membrana interna e matriz. Veja também a micrografia eletrônica que mostra a estrutura de uma mitocôndria. Na tabela abaixo estão descritos os detalhes estruturais encontrados em cada parte da mitocôndria. O entendimento da estrutura das mitocôndrias permitirá entender melhor o seu funcionamento. Estrutura Característica Membrana Mitocondrial Externa Não possui características especiais, exceto pela presença de uma proteína transmembrana a porina, responsável por formar um poro na membrana externa. A porina permite a passagem de moléculas de até 5.000 daltons, ou seja, o trânsito de íons e pequenas moléculas entre o citoplasma e o espaço intermembrana é livre devido a presença das porinas. Espaço Intermembranas Devido às porinas, sua composição iônica é muito semelhante à do citoplasma. Membrana Mitocondrial Interna É rica em proteínas que são responsáveis pela produção de energia na forma de ATP. É composta por 70% de proteínas e 30% de lipídios. Essa membrana projeta-se para a cavidade interna da mitocôndria formando as cristas mitocondriais. Matriz Mitocondrial A Matriz é o espaço interno da mitocôndria, composta por diferentes tipos de macromoléculas: DNA, RNA, proteínas, enzimas, ribossomos. É nesse espaço que ocorre as principais reações metabólicas das mitocôndrias, as quais veremos nesse capítulo. 11.2 – Funcionamento das mitocôndrias Nas células, as mitocôndrias produzem energia utilizando moléculas oriundas dos alimentos como glicose, lipídeos e proteínas. As reações de produção de energia ocorrem na matriz mitocondrial e são denominados metabolismo oxidativo. Para descrever o funcionamento das mitocôndrias utilizaremos como exemplo a produção de energia a partir da glicose. 35 Estágio 1: Glicólise A Glicólise é o estágio inicial do metabolismo oxidativo da glicose, ocorre no citoplasma da célula e não na mitocôndria. A glicose que entra na célula origina-se da alimentação ou dos estoques de glicogênio (polímero com muitas moléculas de glicose) do fígado ou do tecido muscular. No citoplasma celular a glicose, com seis (6) átomos de carbono (C6H12O6) origina duas (2) moléculas de Piruvato (C3H6O3) com três átomos de carbono cada uma. A glicólise ocorre em 10 passos com a ajuda de diferentes enzimas gerando no final duas (2) moléculas de Adenosina Trifosfato (ATP) (molécula energética) e duas (2) moléculas de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NADH) (molécula energética que capta dos elétrons. As moléculas de NADH são transportadas para a cadeia transportadora de elétrons presente na membrana mitocondrial interna). Estágio 2: Entrada do Piruvato na Mitocôndria e Formação do Acetil CoA O piruvato segue então para as mitocôndrias e para chegar à matriz mitocondrial ele passa facilmente pela membrana mitocondrial externa, mas necessita de proteínas carreadoras para atravessar a membrana interna. Na matriz mitocondrial a enzima piruvato desidrogenase realiza o processo de descarboxilação oxidativa, isto é quebra os três carbonos do piruvato em uma molécula de dois carbonos (Acetil) liberando uma molécula de gás carbônico (CO2). O acetil liga-se a coenzima A formando o Acetil CoA. Estágio 3 – O Acetil CoA entra no ciclo de Krebs A molécula de Acetil CoA entra então no ciclo de Krebs ou ciclo do ácido cítrico. A utilidade do ciclo de Krebs é adicionar os dois carbonos do Acetil a uma molécula de quatro carbonos (o oxaloacetato) formando uma molécula de 6 carbonos, o ácido cítrico (daí o nome ciclo do ácido cítrico). Desses seis carbonos, dois são retirados a cada volta do ciclo, liberando CO2 para a atmosfera. A energia liberada nesse processo é utilizada para reduzir a molécula de NAD formando NADH (transportadora de elétrons). No ciclo também é gerado uma molécula de Guanina trifosfato (GTP) que, da mesma forma que o ATP, é uma molécula energética utilizada pela célula e Flavina Adenina Dinucleotídeo (FADH2), análogo ao NADH, A oxidação dos ácidos graxos (oriundo dos lipídeos) também produz Acetil CoA que também entram no ciclo do ácido cítrico produzindo moléculas reduzidas de NADH e ATP. Etapa 4 – Cadeia transportadora de Elétrons. A energia liberada na quebra das ligações, desde glicose até a quebra de acetil-CoA no ciclo de Krebs, foi temporariamente armazenada na redução (ganho de elétrons) de NAD em NADH. Logo após a captura do elétron, a molécula de NADH se oxida com a ajuda da enzima NADH desidrogenase (presente na membrana interna da mitocôndria) liberando assim o elétron para a Cadeia Transportadora de Elétrons ou Cadeia Respiratória. A enzima NADH desidrogenase é a primeira de um grupo de proteínas presentes na membrana interna. A cadeiarespiratória é formada por três complexos proteicos de grande porte: (1) a NADH desidrogenase, (2) complexo citocromo b-c1 e (3) citocromo oxidase. Entre os complexos, há moléculas pequenas que realizam o transporte do elétron de um complexo proteico para outro, são elas: ubiquinona e citocromo C. 36 O elétron, que chega ao final da cadeia transportadora com baixa energia, é captado pelo oxigênio (O2) formando, juntamente com H +,uma molécula de água (O2 + 4 H + ↔ H2O ). Por isso dizemos que o oxigênio realiza o papel de aceptor final de elétrons. O elétron do NADH é atraído e pelos complexos proteicos com a ajuda da ubiquinona e citocromo C. Quando o elétron passa, os complexos, as proteínas jogam íons hidrogênio da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana formando um gradiente de prótons. A membrana interna é impermeável, e a única forma dos prótons voltarem para a matriz mitocondrial é passando pela proteína denominada ATP sintase, que também está presente na membrana mitocondrial interna. Quando os prótons acumulados no espaço intermembrana passam pela ATP sintase promovem a ligação de Adenosina Difosfato (ADP – que possui dois átomos de fosfato) ao fosfato inorgânico (Pi), formando o ATP. O produto final da quebra de cada glicose gera 36 moléculas de ATP (figura). . Observe que os prótons ao passarem pela enzima ATP sintase geram uma energia mecânica (como uma turbina). Essa energia mecânica é transformada em energia química na reação de ligação do ADP ao Pi (fósforo inorgânico). As células procarióticas não possuem mitocôndria produzem somente esses dois ATPs que vimos na glicólise em um processo denominado de Fermentação. Portanto as bactérias 37 fazem somente o processo fermentativo para a produção de sua energia. O produto da glicólise é o piruvato (3 carbonos) contudo, na maioria dos processos fermentativos o piruvato é oxidado a ácido lático (2 carbonos) ou a etanol (2 carbonos) sendo os responsáveis pela produção de iogurte e bebidas fermentadas como o vinho. 38 12. CLOROPLASTO Plastídeos são organelas características de células vegetais. Sua estrutura e função na célula variam de acordo com o tipo de plastídeo. A ausência ou presença de pigmentos é a base da classificação dos plastídeos que se dividem em: - Plastídeos Pigmentados: Cloroplastos – predomina o pigmento verde, a clorofila Cromoplastos – predomina o pigmento carotenoide - Plastídeos Não Pigmentados (leucoplastos) Amiloplastos – que armazenam o amido Elaioplastos – que armazenam gorduras e óleos Proteinoplastos – que armazenam proteínas Portanto, os cloroplastos são um tipo plastídio pigmentado encontrados em células vegetais. Essas organelas são a sede da fotossíntese e da formação do amido. 12.1 Estrutura dos Cloroplastos Os cloroplastos podem variar em forma e tamanho de acordo com a espécie vegetal. Podem ser esferoides, ovoides ou discoide. Nas plantas superiores, os cloroplastos possuem tamanho de 5 a 10 µm (micrômeros). Como nas mitocôndrias, os cloroplastos são envolvidos por dupla membrana: a membrana interna e externa com o espaço intermembrana entre as duas membranas. A membrana interna envolve um grande espaço denominado estroma, que é análogo à matriz mitocondrial, ou seja, o estroma contém enzimas, ribossomos, RNA e DNA. A membrana interna, diferentemente das mitocôndrias, não se invagina para formar cristas e não possui cadeia transportadora de elétrons. Além da membrana externa e interna, os cloroplastos possuem um terceiro tipo de membrana denominado membrana tilacoide que circunda um espaço interno denominado espaço tilacoide ou lúmen tilacoide formando a estrutura chamada tilacoide. Os espaços tilacoides se interconectam com forma um conjunto de sacos achatados e conectados definindo um terceiro compartimento interno nos cloroplastos. Esquema representativo da ultraestrutura de um cloroplasto. Veja que além da membrana externa e interna, os cloroplastos possuem um terceiro sistema de membranas internas as membranas tilacoides. Observem os três compartimentos internos dos cloroplastos: o espaço intermembrana (entre a membrana externa e interna); o estroma e o espaço tilacoide. Biologia Molecular da Célula; Alberts et al, 2010. 39 Eletromicrografia de um Cloroplasto. Biologia Molecular da Célula; Alberts et al, 2010. A tabela abaixo mostra as estruturas encontradas em cada parte dos cloroplastos os quais servirão para melhor entendimento do seu funcionamento. Estrutura Característica Membrana Externa Como nas mitocôndrias, a membrana externa é altamente permeável. Espaço Intermembranas Devido a permeabilidade da membrana externa, sua composição iônica é muito semelhante a do citoplasma. Membrana Interna É menos permeável que a membrana externa e possui diversas proteínas carreadoras. Estroma Análogo à Matriz mitocondrial é composta por diferentes tipos de macromoléculas: DNA, RNA, proteínas, enzimas. É nesse espaço que ocorre as principais reações metabólicas dos cloroplastos, os quais, veremos nesse capítulo. Membrana Tilacoide É o terceiro tipo de membrana encontrada nos cloroplastos, nela encontra-se integrado os fotossistemas as proteínas da cadeia transportadora de elétrons e outras enzimas como a ATP sintase. Espaço Tilacoide É o terceiro espaço, consistem em cisternas achatadas que se empilham formando os grana. Para esse espaço os prótons (H+) são bombeados, formando um gradiente de prótons responsável pela produção do ATP. O conjunto membrana Tilacoide e Espaço Tilacoide forma o Tilacoide. 40 12.2 Vamos falar sobre o funcionamento dos cloroplastos? Funcionamento dos cloroplastos e seus produtos. As reações que compõem a fotossíntese nos cloroplastos são didaticamente divididas em dois grupos: 1) Reações de transferência de elétrons (fase clara): para a produção de ATP utilizando água e luz solar; 2) As reações de fixação do carbono (fase escura): para a produção de moléculas orgânicas (como carboidratos) utilizando o ATP produzido na reação 1. I) Reações de transferência de elétrons As reações de transferência de elétrons dependem da captação de energia solar por moléculas, pigmentos fotossensíveis sendo as clorofilas e os carotenoides os principais. As moléculas de clorofila se agrupam em uma estrutura denominada fotossistema inseridos na membrana tilacoide. Os fotossistemas atuam captando energia luminosa por meio das moléculas de clorofila. A energia captada é repassada para a molécula vizinha até chegar ao Centro de Reação Fotoquímica, onde existem outras moléculas especiais de clorofila as quais, ao receber energia, liberam um elétron. O grupo de pigmentos de clorofila dispostos ao redor do Centro de Reação Fotoquímica é denominado Sistema Antena (pois se parece a uma antena do tipo parabólica. Os cloroplastos possuem dois tipos de fotossistema: o tipo I e o tipo II. De forma análoga às mitocôndrias, os elétrons de alta energia liberados do Centro de Reação Fotoquímica vão percorrer uma cadeia de transportadores presente na membrana tilacoide (lembre-se que nas mitocôndrias a cadeia de transportadores está presente na membrana mitocondrial interna). Durante o percurso dos elétrons, uma série de eventos ocorre. Mas antes de descrever os eventos decorrentes da passagem dos elétrons pela cadeia transportadora ficam duas perguntas: 1) a clorofila que perdeu o elétron no centro de reação fotoquímica fica sem esse elétron? Claro que não! Sua quantidade de elétrons deve voltar ao normal para que no próximo ciclo, ele possa novamente perder o elétron
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