PCR E SEQUENCIAMENTO

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Reação Reação em Cadeia da 
Polimerase e Sequenciamento 
 Profª. Lidia Amorim 
Departamento de Biologia Celular e Molecular 
lidiauff@gmail.com 
Quem inventou a PCR? 
Kary Mullis 
prêmio Nobel em Química (1993) 
 
Cetus Corporation - 1980 
 
 Estudo publicado em 1985 onde a 
técnica amplificava o DNA 
 
 Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-
globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 
1350-54 
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. 
Methods Enzymol 155: 335-35 
PCR 
Etapas principais da PCR 
Desnaturação 
(94°C) 
Extensão 
(72°C) 
T
 
Forward Primer (senso) 
Reverse Primer (Antissenso) 
5’ 3’ 
3’ 5’ 
Anelamento 
(~50 = 65°C) 
5’ 3’ 
3’ 5’ 
Forward Primer Reverse Primer 
http://www.idtdna.com/pages/docs/educational-resources/the-polymerase-chain-reaction.pdf 
 
 
Animação PCR: http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.htm 
Etapas completas da Reação de PCR 
Desnaturação 
(94 0C, 5 min) 
CICLOS 
30-35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
L: 100 bp ladder 
1: Tempo de desnaturação 30 sec. 
2: Tempo de desnaturação 20 sec. 
3: Tempo de desnaturação 10 sec. 
4: Tempo de desnaturação 5 sec. 
5: Tempo de desnaturação 1 sec. 
 
Extensão Final 
(65-75 0C, 7-10 min) 
Anelamento 
(55 a 65 0C, 30 seg) 
Extensão 
(65-75 0C, 1-2 min) 
Desnaturação 
 (94 0C, 30 seg) 
Quais foram as limitações para o 
desenvolvimento da técnica de 
PCR? 
• Síntese de oligonucleotideos (primers) 
 
• Purificação de DNA polimerase 
• sintetizados quimicamente 
 
• possuem entre 15 a 25 bases (21pb aprox.) 
 
• prévio conhecimento da sequência alvo 
 
• ausência de sítios secundários de anelamento - 
sem similaridade com outras regiões do genoma 
CARACTERISTICAS 
PRIMERS 
• G+C > A+T -> (51 – 60 % de G+C) 
 
• Tm > 55 0C 
 
• Ta próxima entre os pares de primers 
 
• dímeros 
 
• grampos 
PRIMERS 
PRIMERS 
EVITAR 
• Temperatura na qual metade das fitas de DNA está na 
forma de fitas simples e a outra metade na forma de 
dupla hélice 
 
• Tm é dependente da composição do DNA, quanto 
maior a quantidade de G+C no DNA – maior o Tm, 
devido ao maior número de ligações de Hidrogênio 
 
• Tm = 2(A+T) + 4(G+C) 
 
Temperatura de melting – (Tm) 
• Possuir Tm maior que 55 0C – Tm = 4 x (G + C) + 2 x (A + T) 
Exemplo: 
5’ AGACTCAGAGAGAACCC 3’ = 4 G 5 C 7 A 1T = Tm 4x9 + 2x8 = 52 0C 
Temperatura de anelamento – (Ta) 
• Temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA 
molde 
 
• Pode ser calculada a partir da Tm 
 
• Ta = Tm primer diminuida de 4°C 
 
• Ta baixa = menor estringência - primer pareia em qualquer 
lugar 
 
• Ta alta = maior estringência – primer pode não parear 
Thermus 
aquaticus 
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, 
p. 289-297 Vol. 98, No. I 
 
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a 
Nonsporulating Extreme Thermophile 
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE 
 
Department of Microbiology, Indiana 
University, Bloomington, Indiana 47401 
 
Isolada no Parque Nacional de Yellowstone - 
California. 
T. Aquaticus são gram-negativas 
 
Temperatura ótima de crescimento é 70ºC, 
o máximo de 79ºC, e o minímo de 40º C. 
Taq polimerase 
Taq DNA Polimerase 
• Isolada de Thermus aquaticus 
• Clonada e expressa em E. Coli 
• Temperatura ótima de atuação é de 72 0C, sendo ainda estável a 94 0C 
• Não apresenta atividade exonuclease 3’ 5’ 
• Não apresenta capacidade revisora. Um erro a cada 2x104 enquanto que 
na bactéria 1 a cada 109 
• Estabilidade térmica (resultados em atividade reduzida a 50%) 
92,5 0C – 130 min, 95 0C – 40 min, 97,5 0C – 5 a 6 min 
• Após 50 ciclos (95 0C – 20 seg) – Atividade residual é de 65 % 
• Taxa de incorporação de nucleotídeos 
 75 0C – 150 nucleotídeos/seg/molécula 
 70 0C – 60 nucleotídeos/seg/molécula 
 55 0C – 24 nucleotídeos/seg/molécula 
 37 0C – 1,5 nucleotídeos/seg/molécula 
 22 0C – 0,25 nucleotídeos/seg/molécula 
• Isolada da Praia de Porto Levante, Ilha 
Vulcano (Itália) 
• Sedimento marinho anaeróbio (1986). 
• Alta eficiência em altas temperaturas (100ºC) 
• Maior afinidade pelo substrato 
• Capaz de amplificar sequências maiores 
 
 
Pfu Polimerase (Pyrococcus furiosus) 
Termocicladores 
1. Etapas Pré- PCR: 
• Coleta da Amostra 
• Extração do Ácido Nucleico 
 
2. PCR ou Ciclagem: 
• Preparo da Reação 
• Termociclagem 
 
3. Pós-PCR: 
• Análise em Gel 
 
Etapas necessárias na realização 
do PCR convencional 
PCR convencional 
PCR convencional 
Animação: http://www.dnalc.org/view/15921-Gel-electrophoresis.html 
PCR convencional 
 
Alguns tipos de PCR 
• RT (usa cDNA como molde) 
 
• Multiplex (usa mais de um par de primers) 
 
• Nested (a reação é realizada em duas etapas na 
segunda os primers anelam em região interna do 
amplicon) 
 
• Degenerado (primer com sequencia variável) 
RT-PCR 
 Quando a reação de PCR utiliza fita molde de DNA 
produzida a partir a ação da transcriptase-reversa a reação 
é chamada de “RT-PCR” 
A reação de transcrição reversa pode ser realizada utilizando : 
 
um primer específico 
Um primer oligo dT primer (ex da figura: um primer formado por varias bases T 
com o objetivo de anelar com a cauda poliA do mRNA ) 
primers randômicos (primer formado pela combinação de 6 bases formando 
primers randômicos) 
RNA AAAAAAAAAAAA 
TTTTTT 
oligo dT primer 
RNAs mensageiros (mRNA) possuem cauda poly A 
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/Reverse-
Transcription-and-cDNA-Synthesis/RNA-Priming-Strategies.html 
 
RT-PCR 
 A transcriptase-reversa sintetiza o cDNA 
O RNA é utilizado como molde para formar o DNA complementar (cDNA) pela enzima 
transcriptase reversa 
RNA AAAAAAAA 
TTTTTTTTT cDNA 
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/Reverse-
Transcription-and-cDNA-Synthesis/RNA-Priming-Strategies.html 
 
Multiplex PCR 
• PCR com dois ou mais 
conjuntos de primers, para 
amplificação de diferentes 
fragmentos de uma mesma 
amostra 
•Objetivos: 
• Identificação de vários 
vírus 
• Identificação de deleções 
em genes em doenças 
degenerativas (Distrofia 
muscular de Duchenne) 
• Teste de paternidade 
Nested PCR 
• É uma variação da PCR 
convencional, na qual são 
utilizados dois paraes de 
primers (ao invés de um) 
para amplificar um mesmo 
fragmento 
• Duas reações de PCR são 
realizadas: primeira com a 
fita parental, em seguida em 
uma segunda utilizando o 
produto de PCR 
• Aumenta a especificidade e 
capacidade de detecção! 
 
PCR Degenerado 
O que são primers degenerados? 
 
• Primers que possuem variações na sequência 
Exemplo: 
5´- TCGAATTCVCCYAAYTGRCCNT-3´ 
A+C+G =V 
C+T= Y 
A+C+G+T= N 
 
Objetivo: avaliar polimorfismo 
 
 
 
Quais são as aplicações da PCR? 
 Diagnóstico Pré-natal (doenças herdadas); 
 Diagnóstico de doenças infecciosas (bactérias, vírus, fungos, 
Protozoários); 
 Identificaçãode trasngênicos; 
 Diagnóstico e prognóstico de câncer (detecção de oncogenes e 
genes supressoresde câncer) 
 Expressão gênica semi-quantitativa 
 DNA fingerprint 
Aplicações 
 Teste de 
Identificação de 
indivíduos 
 
 Polimorfismo 
(variação DNA) 
http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm 
Diagnóstico molecular – gripe aviária 
Limitações da PCR convencional 
• Baixa sensibilidade; 
• Não automatizado; 
• Discriminação baseada no tamanho; 
• Resultados não expressos em numeros 
• A coloração do gel (Brometo de Etidio) não é 
homogenea e o corante é mutagênico; 
• Necessita de análise pos-PCR 
• Não quantitativo 
 
Amplificação na PCR 
 Em teoria a amostra alvo é dobrada a cada ciclo de PCR 
 
 Essa duplicação em cada ciclo ocorreria se houvesse 100% 
PCR de eficiencia (E=2) 
L
o
g
 d
o
 D
N
A
 a
lv
o
 
Número de ciclos 
Teoricamente 
Na prática a eficiência depende de uma gama 
de fatores 
L
o
g
 T
ar
g
et
 D
N
A
 
Cycle Number 
Eficiência teórica (E) = 2 
Eficiência Real (E) < 2 
Amplificação na PCR 
Fases na curva da reação de PCR 
Numero de ciclos 
Exponential (Geometric) Phase 
Plateau Phase 
Stochastic/ ‘lag’ phase 
L
o
g
 d
o
s 
al
v
o
s 
d
e 
D
N
A
 
Linear Phase 
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf 
Comparação dos resultados 
qPCR x cPCR 
L
o
g
 d
o
s 
al
v
o
s 
d
e 
D
N
A
 Agarose gel 
electrophoresis 
following PCR 
Número de ciclos 
 
http://www.idtdna.com/pages/docs/educational-resources/gel-electrophoresis.pdf 
 
cPCR qPCR 
 
∆
 F
lu
o
re
sc
en
ci
a 
Limiar 
CT CT 
Número de ciclos 
CT = O número de ciclos necessários para que o valor de fluorescêcia 
Cruze a linha limiar 
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf 
 PCR em tempo real detecta o sinal de fluorêscencia a 
cada ciclo, o qual vai aumentando até o platô. Por isso o 
nome “ tempo real “ 
∆
 F
lu
o
re
sc
en
ci
a 
CT CT 
X 
Y 
< 
Qual das amostras expressa mais 
o gene alvo? 
Resultado de um qPCR 
Observe as 
linhas que 
cruzam a linha 
amarela. 
Quanto maior 
o número de 
ciclos (valor 
de Ct) para 
cruzá-la 
menor a 
concentração 
da amostra 
PCR em tempo real/qPCR 
•Tipos: 
 
1. SYBR Green 
 
2. Sonda de 
•hidrólise 
Fonte: ww.invitrogen.com 
PCR em tempo real com 
SYBR® Green I dye (qPCR) 
O corante torna-se 
fluorescente (diamantes 
verdes) quando se liga a 
dupla fita de DNA 
http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=5ZEySHfCWAU 
PCR em tempo real com Sonda de 
hidrólise /TaqMan® (PCR-Q) 
O corante torna-se 
fluorescente quando é 
clivado da sonda pela 
atividade exonuclease da 
TAQ 
Exames realizados pelo método: 
 
1 - Detecção do DNA do vírus da Hepatite B qualitativo. 
2 - Quantificação do DNA do vírus da Hepatite B. 
3 - Detecção do RNA do vírus da Hepatite C qualitativo. 
4 - Quantificação do RNA do vírus da Hepatite C. 
5 - Micobacterium tuberculosis - pesquisa do DNA bacteriano. 
6 - Pesquisa de clamídia. 
7 - Detecção do Papilomavírus Humano HPV. 
8 - Detecção de citomegalovírus - CMV. 
9 - Quantificação do RNA do HIV (carga viral). 
10 - Detecção de Toxoplasma gondii. 
11 - Detecção de Helicobacter Pylori. 
12 - Detecção do RNA do vírus da hepatite C em tecido 
hepático. 
 
LABORATÓRIO DE PATOLOGIA E ANÁLISES CLÍNICAS 
Dr. VANDIQUE HENRIQUES COUTINHO 
 
Componentes da Reação de 
Sequenciamento 
 
 
Mix de dNTP dATP, dCTP, 
dGTP, dTTP 
Produto de PCR 
Purificado 
DNA Polimerase 
Tampão 
UM Primer (Oligonucleotídeos 
senso ou anti-senso) 
Tubos A C G T 
 ddATP ddCTP ddGTP ddTTP 
Resultado de Sequenciamento 
Fonte: Princípios de Bioquímica Lehninger, 2005 
 
Sequenciamento Automático 
 
Animação: http://www.dnalc.org/view/15923-Cycle-sequencing.html