Seminário 2 metabolismo vegetal (ON metabolismo N)

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Como o óxido nitrico exógeno regula a assimilação de nitrogênio em plântulas de trigo sob diferentes níveis e fontes de nitrogênio
Disciplina: Metabolismo Vegetal
Discentes: Leticia Sousa
 Verônica Junqueira
Docente: DSc. Fernanda Farnese
Impact factor: 3,54
Qualis A1
Introdução
Nitrogen (N) is not only one of the essential macro-nutrients for plants but also a major limiting mineral element for plant growth and yield [1]. Improving the N use efficiency (NUE) in crops is fundamental for modern agriculture. The production of nitrogen fertilizers is expensive and time consuming, thus high NUE is essential for agriculture productivity. Meanwhile, excessive use of nitrogen will cause environmental pollution [2, 3]. 
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Eficiência do Uso do Nitrogênio (EUN)
Produtividade de grãos por unidade de N disponível no solo
Eficiência de absorção
Eficiência de utilização
For wheat and other grain crops, NUE is traditionally defined as the grain yield per unit of available N in the soil and is composed of two processes i.e. uptake efficiency and the utilization efficiency [4±6]. A number of physiological and environmental traits can affect the NUE in plants, including N source [7, 8], N concentration and the remobilization of N from senescent tissues [2].
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EUN
Processos Fisiológicos
Processos Ambientais
Concentração de N
Remobilização de N
Fonte de N
Amônio (NH4+)
Nitrato (NO3-)
Fontes de N
NO3-
NH4+
Partição de matéria seca entre as folhas e raízes
Arquitetura de raiz
Padrão da expressão gênica
Expansão e função foliar
Ammonium (NH4 +) and nitrate (NO3 −) are two major nitrogen sources for most plant species. The form of nitrogen available to plants can affect leaf expansion and function, gene expression pattern, root architecture, and partitioning of dry matter between leaves and roots [9±11]. With the exception of NH4 +-tolerant species, most plants prefer NO3 − over NH4 + as the primary nitrogen source even though more energy is needed for NO3− assimilation [12, 13]. 
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Fontes de N
Amônio (NH4+)
Nitrato (NO3-)
Nitrato de amônio NH4NO3
+ energia
NR / NiR
Com exceção das espécies tolerantes ao amônio, a maioria das plantas preferem o nitrato ao amônio como fonte primária de nitrogênio, embora mais energia seja necessária para a assimilação do nitrato.
Usar NH4+ como única fonte de N pode ser tóxico para plantas após a combinação com o NH4+ interno produzido através de processos metabólicos.
Estudos tem mostrado que os efeitos tóxicos do suprimento de amônio externo pode ser aliviado pela aplicação de amônio junto com nitrato como nitrato de amônio NH4NO3.
Os processos de absorção de nitrato pelas raízes e sua assimilação nas folhas envolvem o transporte de NO3 para as células das folhas e então o transporte do nitrito (NO2-). O produto da redução do nitrato, no citoplasma para os cloroplastos. Uma redução de dois passos catalisada pela nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR) leva a formação de N4 como produto final.
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Assimilação de N
NO3-
NO2-
NH4+
NH4+
Glutamina
Glutamato
NR
NiR
GS
GOGAT
Fd-GOGAT ou NADH-GOGAT
GS1  citosólica  assimilação de NH4+ e reciclagem
GS2  cloroplastídica  juntamente com a Fd-GOGAT são cruciais na re-assimilação do amônio produzido na fotorrespiração.
Os processos de absorção de nitrato pelas raízes e sua assimilação nas folhas envolvem o transporte de NO3 para as células das folhas e então o transporte do nitrito (NO2-). O produto da redução do nitrato, no citoplasma para os cloroplastos. Uma redução de dois passos catalisada pela nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR) leva a formação de N4 como produto final.
O íon amônio é assimilado a glutamina e então a glutamato pelas atividades das enzimas glutamina sintetase (GS) e ferredoxina/NADH-glutamato sintase (Fd-GOGAT ou NADH-GOGAT).
Existem duas isoformas da GS no genoma de plantas superiores, a glutamina sintetase citosólica (GS1) e a glutamina sintetase cloroplastídica (GS2)
A isoforma citosólica é importante para a assimilação de NH4+ tanto para a assimilação primária de N e sua reciclagem.
As enzimas GS2 plastídica e Fd-GOGAT tem sido reportadas por serem as enzimas cruciais na re-assimilação do amônio produzido na fotorrespiração.
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Pouco se sabe sobre o papel do ON na regulação da assimilação de N em resposta a diferentes fontes de nitrogênio
There are several possible processes leading to NO formation in plants, enzymatically or non-enzymatically from nitrite or from arginine by NO synthase (NOS) as in animals [20]. NR and NOS are two main enzymes involved in NO production in plants, although the presence of NOS in plants is still questionable [21]. Despite the importance of NO in plant signaling, little is known about the mechanisms of NO-regulated N assimilation in response to different nitrogen sources. Sintetizado pela ON sintase a partir do nitrito 
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Trigo
Trigo (Triticum aestivum L.), uma das culturas alimentícias mais importantes, é cultivado mundialmente;
Entender as respostas moleculares do trigo ao nitrogenio e ao suprimento de óxido nítrico e suas relações a indicadores fisiológicos pode proporcionar uma solução confiável para o aumento da EUN nesta cultura.
Neste estudo, as relações entre os níveis transcricionais de seis genes chaves na assimilação do nitrogênio (TaNR, TaNiR, TaGS1, TaGS2, TaFd-GOGAT e TaNADH-GOGAT) e o desempenho fisiológico de plântulas de trigo sob diferentes combinações de nitrogênio e SNP (nitroprussidio de sódio) foi avaliada em duas cultivares australianas de trigo com EUN contrastantes.
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Objetivo
TaNR, TaNiR, TaGS1, TaGS2
TaFd-GOGAT e TaNADH-GOGAT
CULTIVARES X FONTES E CONCENTRAÇÕES DE N X SNP
Desempenho fisiológico
Níveis transcricionais
Condições de crescimento das plantas e tratamento com Nitrogênio
Cultivares Westonia e Spitfire;
Significante diferença na EUN;
Spitfire   proteínas,  EUN;
Westonia  teor de proteínas e produtividade médios.
Plântulas foram cultivadas em solução nutritiva similar a Hoagland em casa de vegetação sob luz natural por 2 semanas.
Foram utilizados vasos de 3 kg com 5 plântulas por vaso.
Após esse período, as plantas foram irrigadas com solução nutritiva sem nitrogênio por uma semana.
As plantas tratadas com diferentes formas químicas de nitrogênio com 0, 20 ou 100 μM de SNP, foram irrigadas com solução nutritiva contendo 4 mM /40 mM KNO3 (nas plantas de NO3−), e 4mM /40 mM NH4Cl (nas plantas de NH4+), or 4 mM /40 mM NH4NO3 (nas plantas de NH4NO3) por 3 dias.
Material e métodos
Westonia 
Spitfire
Médio teor de proteínas e produtividade
 Proteínas;
 EUN;
 Produtividade.
≠ EUN
Plants treated with different chemical forms of nitrogen with 0, 20 or 100 μMof SNP, were irrigated with nutrient solution containing 4mM /40 mM KNO3 (NO3 − plants), 4mM /40 mM NH4Cl (NH4+ plants), or 4 mM /40 mM NH4NO3 (NH4NO3 plants) for 3 days. Plants were supplied with different combination of N and NO at the rate of 50 ml per pot daily, which was adopted from Balotf et al. [22]. To prevent ammonium oxidation by nitrifying bacteria, 8.0 μM dicyandiamide, a nitrification inhibitor, was added to each pot. Leaf tissues were harvested 24 hours after nitrogen treatments. Every harvest consisted of three independent biological replicates for each genotype and treatment.
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Cultivadas em casa de vegetação por duas semanas;
Irrigadas com solução nutritiva sem nitrogênio por uma semana.
Tratamentos
Westonia 
Spitfire
NH4Cl
KNO3
NH4NO3
4 mM
40 mM 
SNP
0 μM 
20 μM
100 μM
Por 3 dias
As plantas foram tratadas com diferentes concentrações e formas químicas de nitrogênio (NHCl, KNO3 e NH4NO3) com 0 (controle) 20 ou 100 μM de SNP por 3 dias.
Os tecidos foliares foram coletados 24 h após os tratamentos com nitrogênio.
A atividade da NR foi medida em 3 repetições biológicas.
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Análises
A expressão dos genes chaves foi feita atravees da extração do RNA e PCR em tempo real.
A atividade das enzimas
e o conteúdo de ON foi realizado seguindo metodologias padrão, macerando as folhas, adicionando tampão de extração, centrifugando e, para as enzimas, foi adicionado o substrato de cada uma delas. Então por exemplo,para a NR foi adicionado nitrato de potassio como doador de nitrato e para a GS foi adicionado glutamato como substrato. A leitura da absorância para a atividade e do conteudo de ON foi feita em espectrofotômetro,a 540 nm.
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Extração de RNA e qRT±PCR
As folhas foram congeladas em nitrogênio líquido, homogeneizadas em almofariz e pistilo e mantidas a -80 ºC até a utilização.
RNA total foi isolado usando RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) segundo o protocolo do fabricante.
Para a análise qRT±PCR, o RNA total foi tratado com DNase I (Qiagen).
qRT±PCRs foram realizados em um volume de 20 μl en um Qiagen RotorGeneQ High Resolution Melt Instrument (Qiagen) usando uma SensiFAST SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, USA). 
Os dados foram normalizados usando a média de dois genes de controle e a expressão foi calculada com a formula 2-ΔΔct
Os primers foram desenhados usando o software Allele ID 7 (Premier Biosoft Intl, Palo Alto, CA, USA) de acordo com o arquvo de alinhamento incluindo todas as sequencias do trigo e outras plantas relacionadas presente no banco de genes.
Os primers foram desenhados de acordo com a área conservada naquelas sequencias para amplificar todas as isoformas.
Os oligonucleotídeos usados estão listados na tabela 1. Para cada amostra as reações qRT-PCR foram realizadas duas vezes sob condições idênticas.
Material e métodos
Leaves materials were frozen in liquid nitrogen, homogenized in a mortar and pestle, and kept at −80ÊC until used. Total RNA was isolated using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) following the manufacturer's protocol. For qRT±PCR analysis, total RNA was treated with the DNase I (Qiagen). qRT±PCRs were carried out in 20 μl volume in a Qiagen RotorGeneQ High Resolution Melt Instrument (Qiagen) using a SensiFAST SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, USA). Data were normalized using the mean of two housekeeping genes and the expression was calculated with 2-ΔΔct formula [23]. Primers were designed using Allele ID 7 software (Premier Biosoft Intl, Palo Alto, CA, USA) according an alignment file including all of the sequences in wheat and other related plants present in the gene bank. The primers were designed according to the conserved area in those sequences in order to amplify all of the isoforms. The oligonucleotides used are listed in Table 1. For each sample, the subsequent qRT-PCR reactions were performed twice under identical conditions.
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Tabela 1 – Lista de Primers
Material e métodos
Atividade da NR
Tecidos foliares foram pesados e imersos em nitrogênio líquido;
2 mL de tampão de extração foram adicionados a 300 mg de pó de folha congelada e centrifugados por 15 min;
Alíquotas de 300 μl do sobrenadante foram adicionadas a 300 μl do meio de reação (5 mM KNO3, 0.2 mM NADH) e incubados por 15 min a 25 ºC.
A reação foi parada pela adição de acetato de zinco.
A mistura foi centrifugada e o sobrenadante foi utilizado para determinar a produção de nitrito apos a adição de 300 μL de reagente de Greiss.
A leitura da absorbância oi feita a 540 nm em espectrofotômetro.
A quantidade de NR requerida para a produção de 1 μmol de nitrito por minuto foi definida como uma unidade de NR.
Material e métodos
Atividade total da GS
300 mg de tecido de foliar foram mergulhadas em nitrogênio líquido e homogeneizados em 2 mL de tampão de extração
300 mg wheat leaf tissues was ground in liquid nitrogen and homogenized in 2 ml extraction buffer (1 mM EDTA, 50 mM Tris buffer, 10% [v/v] glycerol, and 5mM 2-merceptoethonal, pH 8.0). The homogenates were centrifuged at 14,000 g for 5 min and the supernatant was analyzed for total GS activity. One ml of the leaf extract were incubated with 2 ml reaction buffer (50 mM imidzole, 30 mM MgCl2, 25 mM hydroxylamine and 100 mM L-glutamate) at 37ÊC for 40 min. The reaction was terminated by adding an acidic FeCl3 solution, containing 80 mM FeCl3, 700 mM HCl, and 200 mM trichloroacetic acid. The product (formation of γ-glutamyl monohydroxamate) was measured spectrophotometrically by absorbance at 540 nm. One unit of enzyme was defined as amount of enzyme required to produce 1 μmol of glutamyl monohydroxamate per min [25].
Material e métodos
Conteúdo de ON
Nitric oxide content was determined using the method described by Zhou et al. [26] with slight modifications. 300 mg leaves were ground in a mortar and pestle in 2 ml 50 mM cool acetic acid buffer (pH 3.6, containing 4% zinc diacetate).
After centrifugation in a refrigerated (4ÊC) centrifuge at 8,000 g for 15 min, homogenate was filtered. After vortexing and filtering, 500 μl of the Greiss reagent was added to 500 μl of filtrate, kept at room temperature for 30 min and the solution absorbance was read at 540 nm. Sodium nitrite was used to calculate the NO content.
Material e métodos
Análise estatística
Média + DP (3 repetições);
DIC;
ANOVA;
Teste de Duncan (P < 5 %);
Software SPSS ver. 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Material e métodos


-
4 mM NHCl  ON  expressão da maioria dos genes nos dois cultivares.
 Expressão de GS1 em Spitfire
Crescendo sob baixo suprimento de kno3, a expressão máxima dos genes NR, NiR, NADHGOGAT, Fd-GOGAT e GS2 da cv. Spitfire ocorreu em 100 μMSNP 
100 μMSNP with 4mM NH4NO3, caused an increase in the expression of NR, NiR, GS1, GS2 and Fd-GOGAT, while the expression of NADH-GOGAT was not affected by the SNP application in cv. Spitfire.
Expressão de Fd-GOGAT e NADH-GOGAT em Westonia não foi afetada
The GS1 expression was maximum in control plants and decreased in 20 μMSNP (Table 2). Application of SNP did not affect most genes' expression in Westonia cultivar under low KNO3 with the exception of GS1. The expression of GS1 showed an increase in 100 μMSNP with 4mM KNO3 (Table 2). 
When cv. Westonia was grown in 4mM NH4NO3, the SNP did not affect the expression of NiR, Fd-GOGAT and GS2 while the mRNA expression levels of NR and NADH-GOGAT decreased in 20 μMSNP. The GS1 expression increased in both 20 and 100 μMSNP under low NH4NO3 in cv. Westonia (Table 2).
Efeito de baixo nitrogênio (4 mM) na expressão do mRNA
SNP como doador de ON aumentou a expressão do gene da rota de assimilação do nitrogênio sob baixo suprimento de N
Efeito da aplicação exogena de ON:
4 mM NHCl  ON  expressão da maioria dos genes nos dois cultivares.
 Expressão de GS1 em Spitfire
Expressão de Fd-GOGAT e NADH-GOGAT em Westonia não foi afetada
Crescendo sob baixo suprimento de kno3, a expressão máxima dos genes NR, NiR, NADHGOGAT, Fd-GOGAT and GS2 of cv. Spitfire ocorreu em 100 μMSNP
The GS1 expression was maximum in control plants and decreased in 20 μMSNP (Table 2). Application of SNP did not affect most genes' expression in Westonia cultivar under low KNO3 with the exception of GS1. The expression of GS1 showed an increase in 100 μMSNP with 4mM KNO3 (Table 2). 100 μMSNP with 4mM NH4NO3, caused an increase in the expression of NR, NiR, GS1, GS2 and Fd-GOGAT, while the expression of NADH-GOGAT was not affected by the SNP application in cv. Spitfire.
When cv. Westonia was grown in 4mM NH4NO3, the SNP did not affect the expression of NiR, Fd-GOGAT and GS2 while the mRNA expression levels of NR and NADH-GOGAT decreased in 20 μMSNP. The GS1 expression increased in both 20 and 100 μMSNP under low NH4NO3 in cv. Westonia (Table 2).
21
In NHCl treated plants, NO did not affect the expression of NR, GS1, Fd-GOGAT and NADH-GOGAT, while NiR showed a decreased expression in the presence of 100 μMSNP in cv. Spitfire. 
Application of SNP in KNO3 treated plants did not affect the expression levels of GS2, Fd-GOGAT and NADH-GOGAT in cv. Spitfire; however it increased the expression of NiR and GS1 and decreased the expression of NR.
When treated with NH4NO3, SNP plus 40 mM nitrogen treatment in cv. Spitfire caused an increase in the
expression of NR, NiR and Fd-GOGAT genes but did not affect the NADH-GOGAT, GS1 and GS2 expression.
In cv. Westonia, NO caused an increase in the expression of GS1 and a decrease of the NADH-GOGAT expression while the expression of the other genes was not affected by NO (Table 3).
In cv. Westonia SNP application caused a decrease in the expression of NR and GS2 while the expression of other genes was not affected (Table 3).
Application of SNP in cv. Westonia with 40 mM NH4NO3 caused a decreased expression of NR, NiR and NADH-GOGAT while the expression of Fd-GOGAT, GS1 and GS2 was not affected (Table 3).
Efeito de alto nitrogênio (40 mM) na expressão do mRNA


-
Aplicação de SNP com alta concentração de nitrogênio aumentou a expressão da assimilação do N em Spitfire mas não em Westonia
When treated with NH4NO3, SNP plus 40 mM nitrogen treatment in cv. Spitfire caused an increase in the expression of NR, NiR and Fd-GOGAT genes but did not affect the NADH-GOGAT, GS1 and GS2 expression. Application of SNP in cv. Westonia with 40 mM NH4NO3 caused a decreased expression of NR, NiR and NADH-GOGAT while the expression of Fd-GOGAT, GS1 and GS2 was not affected (Table 3).
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NH4Cl
KNO3 
NH4NO3 
NH4Cl
NH4NO3 
KNO3 
In all three nitrogen sources the activity of NR in cv. Spitfire was significantly higher than the activity of NR in cv. Westonia (Fig 1).
SNP did not affect NR activity 
However, at 40 mM KNO3, SNP did not affect NR activity in cv. Westonia while it decreased NR activity in cv. Spitfire (Fig 1B).
Both cultivars showed an increase in the activity of NR in 4mM KNO3 plus SNP. 
In NH4NO3, the two cultivars showed different responses to SNP application.
In both low and high nitrogen supplies, SNP increased the activity of NR in cv. Spitfire but not in cv. Westonia (Fig 1C). 
Spitfire x Westonia
Efeito do ON e fontes de N na atividade da NR
Fig 1. Effects of NO and nitrogen sources on NR activity. Wheat seedlings (cvs Spitfire and Westonia) were grown in glasshouse for two weeks. Then, plants were irrigated with nitrogen-free nutrient solution for a week. Plants treated with different concentrations (left = 4mM and right = 40 mM) and different chemical forms of nitrogen (A = NHCl, B = KNO3 and C = NH4NO3) with 0 (as a control), 20 or 100 μMof SNP for 3 days. Leaf tissues were harvested 24 hours after nitrogen treatments. NR activity was measured on three biological repeats. Different letters mean significantly different at 5% levels as calculated by Duncan multiple test.
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At the 4 mM NH4Cl level, 100 μM SNP showed maximum activity of GS in their leaves. At the 40 mM NHCl level, cv Spitfire showed the highest GS activity with 20 μMSNP. 
Overall, 100 μMSNP was the best treatment for maximum GS activity of cv. Westonia in plants growing in 4 mM and 40 mM NHCl
The activity of GS was not affected by SNP application in low and high KNO3 treatments in cv. Westonia while in cv. Spitfire 20 μMSNP caused a significant increase in GS activity in 40 mM KNO3 treatments
In plants treated with NH4NO3, SNP application increased the activity of GS in low and high nitrogen treatments in cv. Spitfire.
In low NH4NO3, 100 μMSNP caused a significant increase in the activity of GS in cv. Westonia in 40 mM NH4NO3, SNP application did not affect its GS activity
KNO3 
NH4NO3 
NH4NO3 
KNO3 
NH4Cl
NH4Cl
Efeito do ON e fontes de N na atividade da GS
Fig 2. Effects of NO and nitrogen sources on GS activity. Wheat seedlings (cvs Spitfire and Westonia) were grown in glasshouse for two weeks. Then, plants were irrigated with nitrogen-free nutrient solution for a week. Plants treated with different concentrations (left = 4mM and right = 40 mM) and different chemical forms of nitrogen (A = NHCl, B = KNO3 and C = NH4NO3) with 0 (as a control), 20 or 100 μMof SNP for 3 days. Leaf tissues were harvested 24 hours after nitrogen treatments. GS activity was measured on three biological repeats. Different letters meaning significantly different at 5% levels as calculated by Duncan multiple test.
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In plants treated with 4 mM NHCl, SNP treatment increased the NO accumulation in both cultivars as compared with control. 
Maximum NO accumulation in cv. Spitfire growing in low level of KNO3 was observed when treated with 20 and 100 μMSNP 
In plants treated with NH4NO3, the application of SNP increased NO accumulation in both low and high nitrogen levels in cv. Spitfire but not in cv. Westonia (Fig 3C).
However, in the high NHCl treated plants, SNP did not affect the internal NO in both cultivars (Fig 3A).
while in high KNO3 treatments SNP application caused a decrease in the activity of GS. In cv. Westonia NO did not affect GS activity in both low and high KNO3 treated plants (Fig 3B).
NH4Cl
KNO3 
NH4NO3 
NH4Cl
NH4NO3 
KNO3 
Efeito do ON e fontes de N no conteúdo de ON
Fig 3. Effects of NO and nitrogen sources on NO content. Wheat seedlings (cvs Spitfire and Westonia) were grown in glasshouse for two weeks. Then, plants were irrigated with nitrogen-free nutrient solution for a week. Plants treated with different concentrations (left = 4mM and right = 40 mM) and different chemical forms of nitrogen (A = NHCl, B = KNO3 and C = NH4NO3) with 0 (as a control), 20 or 100 μMof SNP for 3 days. Leaf tissues were harvested 24 hours after nitrogen treatments. NO content was measured on three biological repeats. Different letters meaning significantly different at 5% levels as calculated by Duncan multiple test.
25
Expressão Gênica
Estudos anteriores indicaram que os níveis de expressão de diferentes genes chaves para o metabolismo do nitrogênio são afetados por diferentes fontes de nitrogênio, como NO3 − ou NH4 +.
Além disso, tem sido mostrado que o óxido nítrico gerado pela nitrato redutase influencia a rota de metabolismo do nitrogênio.
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Atividade de Enzimas
Spitfire x Westonia;
Westonia 
Spitfire
Médio teor de proteínas e produtividade
 Proteínas;  EUN;
 Produtividade.
Neste estudo, para explorar a potencial aplicação destas descobertas, nós examinamos a expressão e a atividade de enzimas chaves do metabolismo do nitrogênio em resposta a diferentes combinações de nitrogênio e SNP
A cv. Spitfire é conhecida como de alta produtividade com grãos grandes e alto teor de proteína. Em nosso estudo, usamos também a cv. Westonia, como uma referência, que é um cultivar comum de trigo na Austrália, com desempenho médio, incluindo produtividade e outros caracteres.
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Atividade da NR
NO3-
NH4+
Produto final da via!
SNP   expressão / atividade da NR sob baixo NH4Cl
ON alivia a toxicidade do NH4+ sob baixo teor de N
Efeito protetor do ON  antioxidante
A atividade da NR aumenta com a aplicação de nitrato e diminui com o aumento da concentração de amônio.
A nitrato redutase é a enzima mais importante da via de assimilação do NO3- nas plantas e sua expressão e atividade aumentam na aplicação de nitrato, enquanto o NH4+ como produto final na via de redução do nitrato reduz sua atividade e expressão.
Os resultados apresentados aqui indicam que a aplicação de SNP aumenta a expressão / atividade de NR em plântulas de trigo sob tratamentos com baixo NH4Cl.
O tratamento com NO alivia a toxicidade de NH4+ em mudas de trigo sob tratamentos com baixo teor de nitrogênio (Tabela 2). Este efeito protetor do NO contra a toxicidade do NH4+ pode estar relacionado à sua capacidade de reagir com algumas ROS produzidas nessas condições, fazendo com que o NO atue como um rompedor de corrente e mostre suas propriedades antioxidantes propostas [32].
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Sinalização para ativação de enzimas antioxidantes
Ajuda a planta a sobreviver sob condições de estresse
Reage com oxigênio ativo e radicais lipídicos
Afeta o metabolismo das plantas
Dependente da concentração
Pode interromper a propagação da oxidação lipídica
Pesquisas prévias...
O Além disso, foi relatado que o NO pode reagir com radicais de alcoxilo lipídico (LO_) e peroxilo (LOO_), levando à conclusão de que o NO
poderia interromper a propagação da oxidação lipídica mediada por radicais de forma direta [33].
Assim, NO pode ajudar as plantas a sobreviver sob condições estressantes através de sua ação como molécula de sinalização para ativar enzimas antioxidantes e reagir diretamente com oxigênio ativo e radicais lipídicos.
No entanto, também provou-se que o NO afeta o metabolismo das plantas em um padrão dependente da concentração [34, 35].
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Via da NR
 Capacidade de absorção de N
 Iniciação da raiz lateral
 Taxa de absorção de N inorgânico
Estrutura da raiz
Transportador de NO3- (NRT)
 absorção NO3- 
Também estudos recentes mostraram que o NO gerado pela via NR desempenha um papel fundamental na melhoria da capacidade de aquisição de N, aumentando a iniciação da raiz lateral (LR) e as taxas de absorção de N inorgânico [19].
Portanto, é possível que NO provoque alterações tanto na estrutura raiz como no transportador de nitrato (NRT) nas células da raiz, resultando em um aumento na absorção de NO3- do solo. O nitrato atua como um sinal para desencadear uma série de eventos moleculares e fisiológicos que levam à resposta geral de uma planta à disponibilidade de N.
30
 Níveis de NO3- 
 Expressão da NR
NR
A NR é conhecida como uma enzima induzível e sua expressão corresponde ao aumento nos níveis de NO3- presente.
Em nosso estudo, a aplicação de SNP em plantas que crescem sob baixas doses de N pode aumentar o conteúdo interno de N das plantas e causar um aumento na expressão / atividade das enzimas da via de assimilação do nitrogênio.
O regulamento de NR e GS pode ocorrer nos níveis de transcrição, tradução, localização subcelular, montagem de subunidades e modificação pós-tradução da proteína e seu volume de negócios.
31
Nossos resultados mostraram claramente que os efeitos do NO sobre as atividades das enzimas NR e GS dependem das formas e concentrações N disponíveis, das concentrações de NO e dos genótipos de trigo (Figs 1 e 2). Como mencionado acima, com pouca disponibilidade de N, NO provoca um aumento no nitrogênio interno, afetando a ramificação radicular e, possivelmente, os transportadores de nitrogênio.
Em alta concentração de N fornecido, o NO poderia inibir o desencadeamento da fosforilação e 14-3-3 de ligação e / ou estar envolvido em uma regulação alternativa da enzima com a formação de S-nitrosotióis (SNO) como resultado da adição de NO para tióis de cisteína [43]. Verificou-se que, nas plantas de tabaco, a região N-terminal de NR está envolvida na inibição completa durante a transição luz / escuridão independente das proteínas 14-3-3 e sua fosforilação.
32
Neste trabalho...
Conclusão
NO  papel importante na regulação transcricional e pós transcricional das enzimas da assimilação do N;
Efeitos observados em baixas concentrações de N;
Em altas concentrações N, o NO não tem efeito sobre as enzimas.
Obrigada!