Aula 15 Métodos imunológicos de diagnóstico

Prévia do material em texto

Caracterís)cas	
  dos	
  testes	
  
—  Grande	
  parte	
  dos	
  testes	
  são	
  in	
  vitro,	
  mas	
  existem	
  in	
  
vivo.	
  
—  Avaliação	
  qualitativa	
  e	
  quantitativa	
  da	
  resposta	
  
imune	
  do	
  hospedeiro	
  
—  Sensibilidade:	
  mede	
  a	
  capacidade	
  do	
  teste	
  em	
  
identificar	
  corretamente	
  a	
  doença	
  entre	
  aqueles	
  que	
  a	
  
possuem	
  
—  Especificidade:	
  mede	
  a	
  capacidade	
  do	
  teste	
  em	
  
excluir	
  corretamente	
  aqueles	
  que	
  não	
  possuem	
  a	
  
doença	
  
—  Fase	
  Eclipse	
  (HIV):	
  o	
  intervalo	
  de	
  tempo	
  entre	
  a	
  
infecção	
  pelo	
  HIV	
  e	
  a	
  primeira	
  detecção	
  de	
  um	
  ensaio	
  
virológico	
  ultrassensível	
  
http://sbac.org.br/consulta_processual/manual_tecnico_hiv.pdf 
http://sbac.org.br/consulta_processual/manual_tecnico_hiv.pdf 
Tipos	
  de	
  interações	
  Ag-­‐Ac	
  
—  Interações primárias: 
—  ligação direta do anticorpo ao seu antígeno 
—  Interações secundárias: 
—  quantidade de anticorpo presente ð mudanças no 
estado físico do antígeno. Ex.: precipitação de um 
antígeno solúvel 
Diagnós)co	
  imunológico	
  
—  Interação Antígeno (Ag)-Anticorpo (Ac): 
—  Anticorpo reconhece um epítopo específico 
—  Anticorpos: 
—  Monoclonais 
—  Policlonais 
—  Aplicações: 
—  Diagnóstico clínico 
—  Diagnóstico experimental 
Métodos	
  
—  Métodos: quantitativos, qualitativos e semi-
quantitativos 
—  Métodos com reagentes não marcados: 
—  Reação de precipitação 
—  Reação de aglutinação 
—  Métodos com reagentes marcados: enzimas, 
fluorocromos ou isótopos 
—  ELISA / RIA 
—  Imunofluorescência 
—  Immunoblotting 
—  Citometria de fluxo	
  
Reações	
  de	
  imunoprecipitação	
  
Ag solúvel + Ac solúvel 
Complexo Ag-Ac insolúvel 
= 
Reações	
  de	
  imunoprecipitação	
  
Voltarelli JC, 2008 
Complexos antígeno-anticorpo = base das reações de imunoprecipitação 
Pró-zona Pós-zona 
Necessário uma 
relação de 
equivalência 
entre 
as 
concentrações 
de antígeno e de 
anticorpo 
Testes	
  de	
  precipitação:	
  imunodifusão	
  	
  
— Ag:	
  orifício	
  central	
  
— Amostras	
  de	
  soro	
  
de	
  pacientes	
  a	
  
serem	
  testados:	
  
orifícios	
  laterais	
  
Reação de precipitação 
Imunodifusão radial simples: gel de agarose 
n  Orifício central: Ag 
n  Orifícios laterais: amostras de soro de pacientes e 
amostras padrões (positivas e negativas) 
Imunodifusão	
  radial	
  	
  
—  Método 
—  Anticorpo no gel 
—  Antígeno no poço 
—  Interpretação 
—  Diâmetro do anel 
—  Quantitativo 
—  Níveis de Acs 
Concentração (Ag) 
D
iâ
m
et
ro
 
Ag Ag Ag Ag 
Ac no gel 
Reações	
  de	
  aglu)nação	
  
—  Ex.:	
  Identificação	
  de	
  antígenos	
  eritrocitários	
  na	
  
tipagem	
  sanguínea;	
  outros	
  
—  Vantagens:	
  
—  Análise	
  visual	
  do	
  resultado	
  
—  Boa	
  especificidade	
  
—  Baixo	
  custo	
  
—  Desvantagens:	
  
—  Baixa	
  sensibilidade	
  
Aglutinação	
  direta	
  	
  
	
  
-­‐  Amostra	
  de	
  sangue	
  na	
  
placa	
  teste	
  
-­‐  Reagente	
  (anticorpo	
  
anti	
  A,	
  B	
  ou	
  D)	
  
-­‐  Controle	
  negativo	
  
-­‐	
  	
  Homogeneizar	
  
Aglutinação	
  direta	
  
	
  
Movimento	
  leve	
  (dois	
  minutos)	
  
	
  
	
  
	
  
Resultado	
  positivo:	
  aglutinação	
  
visível	
  (aglomeração	
  dos	
  
eritrócitos	
  na	
  placa	
  teste)	
  	
  
Reações	
  de	
  aglu)nação	
  
1.   Aglutinação	
  direta:	
  
—  Agregação	
  de	
  eritrócitos:	
  hemaglutinação	
  
Anticorpo 
Reações	
  de	
  aglu)nação	
  
Soro do paciente 
+ 
Hemácias de galinha 
(sensibilizadas – T.cruzi) 
NEGATIVO 
(Não há aglutinação) 
POSITIVO 
(Há aglutinação) 
Reações	
  de	
  aglu)nação	
  
2.   Aglutinação	
  indireta:	
  
—  Antígenos	
  adsorvidos	
  em	
  partículas	
  de	
  bentonite	
  ou	
  
esferas	
  de	
  látex;	
  
—  	
  Aplicação:	
  diagnóstico	
  de	
  doença	
  de	
  Chagas	
  e	
  sífilis	
  
+ 
Reações	
  de	
  aglu)nação	
  
Aglutinação	
  indireta:	
  
Diluições em série do anticorpo 
Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/323IMMUN/C2_AGAB 
Controle negativo 
 
Coombs	
  
—  Características básicas: 
—  Método sorológico: qualitativo ou semi-quantitativo: 
—  anticorpos (Ac) ou 
—  antígenos (Ag) (Inibição da Fixação do Complemento) 
—  Via clássica: complexo antígeno-anticorpo 
—  Qualitativo ou semi-quantitativo (diluição seriada 
da amostra ð máxima diluição (com reação 
positiva) 
Reação	
  de	
  fixação	
  do	
  complemento	
  
1)	
  Soro	
  do	
  paciente	
  inativado	
  	
  
2)	
  Hemáceas/hemolisina	
  	
  
3)	
  Complemento	
  
4)	
  Centrifugação	
  
	
  
caso	
  negativo:	
  hemácias	
  não	
  lisadas	
  	
  
caso	
  positivo:	
  proteínas	
  do	
  sistema	
  
complemento	
  se	
  ligarão	
  à	
  porção	
  Fc	
  
dos	
  Acs	
  ð	
  cascata:	
  lise	
  das	
  
hemáceas,	
  liberando	
  hemogoblina	
  	
  
Reação de fixação do complemento 
Reação	
  de	
  fixação	
  do	
  complemento	
  
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
ELISA:	
  Enzyme-­‐linked	
  immunosorbent	
  assay	
  	
  
—  Reação	
  enzimática	
  que	
  altera	
  a	
  cor	
  do	
  substrato	
  
—  Anticorpos	
  conjugados	
  com	
  enzimas	
  
—  Heterogênea	
  (múltiplas	
  fases)	
  
—  Aplicação:	
  
—  Identificação/quantificação	
  de	
  anticorpos	
  ou	
  antígenos	
  
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
ELISA:	
  
—  Vantagens:	
  
—  Técnica	
  sensível	
  
—  Grande	
  especificidade	
  
—  Visualização	
  direta	
  do	
  resultado	
  
—  Métodos	
  automatizados	
  
—  Desvantagens:	
  
—  Custo	
  elevado;	
  equipamentos	
  e	
  reagentes	
  
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
ELISA:	
  
—  Características:	
  
—  Enzimas:	
  
—  Fosfatase	
  alcalina	
  (Substrato:	
  p-­‐nitrofenilfosfato)	
  
—  Peroxidase	
  (Substrato:	
  Peróxido	
  de	
  hidrogênio)	
  
—  Substratos	
  cromogênicos:	
  
—  Nitro	
  blue	
  tetrazolium	
  (NBT)	
  
—  OPD	
  (ortofenilenodiamina)	
  e	
  TMB	
  (tetrametilbenzidina)	
  
—  O	
  comprimento	
  de	
  onda	
  para	
  leitura	
  esta	
  relacionado	
  com	
  o	
  
tipo	
  de	
  substrato:	
  
—  OPD	
  à	
  490	
  nm	
  
—  TMB	
  à	
  450	
  nm	
  
—  Placas de microtitulação (96 poços) 
—  Teste quantitativo ou qualitativo: Ag ou Ac 
—  Conjugados com enzimas 
—  Atividade enzimática proporcional: Ag ou Ac 
—  Ação da enzima converte: 
—  O substrato incolor em um produto colorido 
—  O substrato alterado pela enzima: mudança de cor 
de uma substância indicadora 
—  Principais tipos de ELISA: indireto, direto (sanduíche), 
competição e captura 
Elisa: 
Elisa	
  
Elisa:	
  Enzyme-­‐linked	
  immunosorbent	
  assay	
  	
  
Anticorpo
Antígeno
Remoção do 
antígeno ligado
Anticorpo 
secundário 
marcado
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
ELISA:	
  
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
ELISA:	
  
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  enzimá)cos	
  
ELISA:	
  
Eletroforese	
  
	
  Westernblo*ngImmunoblo*ng	
  
	
  
Eletroforese	
  
Western	
  Blot/Immunoblot:	
  
§  Separação	
  das	
  proteínas	
  por	
  tamanho	
  
§  Transferência	
  para	
  uma	
  membrana	
  de	
  
nitrocelulose	
  
§  Identificação	
  com	
  um	
  anticorpo	
  específico	
  
§  Aplicação:	
  
v  Amostra:	
  identificação	
  de	
  antígenos	
  ou	
  identificação	
  
de	
  anticorpos	
  
v  Importante	
  auxiliar	
  no	
  diagnóstico	
  de	
  doenças	
  
infecciosas	
  
v  Ex.:	
  Teste	
  para	
  detecção	
  de	
  partículas	
  virais	
  do	
  HIV	
  
v  Ex.:	
  	
  Testes	
  sorológico	
  para	
  confirmação	
  do	
  HIV	
  
Eletroforese	
  	
  	
  	
  Western	
  blo*ng	
  ou	
  
Immunoblot	
  
	
  	
  
1.  Preparo	
  da	
  amostra:	
  
–  Solubilização	
  com	
  SDS	
  e	
  2-­‐mercaptoetanol	
  
2.  Separação	
  da	
  amostra	
  em	
  gel	
  de	
  poliacrilamida	
  (SDS-­‐
PAGE)	
  
3.  Transferência	
  das	
  proteínas	
  separadas	
  para	
  um	
  filtro	
  de	
  
nitrocelulose	
  por	
  eletroforese	
  
4.  Bloqueio	
  do	
  filtro	
  de	
  nitrocelulose	
  
5.  Aplicação	
  do	
  anticorpo	
  primário	
  
6.  Aplicação	
  do	
  anticorpo	
  secundário	
  
7.  Revelação	
  
Eletroforese	
  
Cátodo (+)
Ânodo (-)
Mistura de 
antígenos 
proteicos
Migração 
eletroforética
1) Proteínas 
desnaturadas na 
presença de SDS
2) Antígenos proteicos 
separados por SDS-
PAGE
Western	
  blo*ng	
  
Cátodo (+)
Ânodo (-)
Membrana 
de 
nitrocelulose
4) Marcação dos frações Ag 
proteicas através de anticorpo 
conjugado
5) Revelação: exposição da membrana 
de nitrocelulose a película de raio X 
ou por coloração específica
3) Transferência eletroforética de proteínas 
para membrana de nitrocelulose
Western	
  blo*ng/Immunoblo*ng	
  
—  Eletroforese	
  de	
  
proteínas	
  
—  Identifica	
  antígenos	
  
(WB)	
  ou	
  anticorpos	
  
SDS-PAGENitrocelulose
Conjugado específico
Revelação: fração de interesse
http://sbac.org.br/consulta_processual/manual_tecnico_hiv.pdf 
Westernblo*ng-­‐HIV	
  
Teste	
  rápido	
  HIV	
  
—  http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/
61testes_rapidos.pdf	
  
—  http://www.fiocruz.br/ccs/cgi/cgilua.exe/sys/
start.htm?infoid=1541&sid=9	
  
http://sbac.org.br/consulta_processual/manual_tecnico_hiv.pdf 
Ensaios	
  com	
  marcadores	
  
imunofluorescentes	
  
—  Lâminas de microscopia 
—  Tipos: 
—  Direta: detecção de antígenos 
—  Indireta: detecção de antígenos e anticorpos 
—  Anticorpos ou antígenos conjugados: fluorocromo 
—  Microscópio UV (microscópio de fluorescência) 
—  Principais fluorocromos: 
—  fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) 
—  rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – 
TRICT) 
Imunofluorescência	
  	
  
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  direta	
  e	
  indireta	
  
—  Baseada	
  na	
  emissão	
  de	
  luz	
  por	
  moléculas	
  
denominadas	
  fluorocromos;	
  
—  Teste	
  qualitativo	
  ou	
  semi-­‐quantitativo;	
  
—  Detecção	
  de	
  antígenos	
  intracelulares	
  ou	
  extracelulares	
  
—  Aplicação:	
  
§  Diagnóstico	
  de	
  doenças	
  infecciosas:	
  ex.:	
  
§  Diagnóstico	
  da	
  infecção	
  chagásica	
  
§  Diagnóstico	
  de	
  Leishmaniose	
  
§  Diagnóstico	
  de	
  Toxoplasmose	
  
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  direta	
  e	
  indireta	
  
	
  
—  Vantagens:	
  
—  Sensibilidade	
  =	
  96%	
  a	
  100%	
  
—  Especificidade	
  =	
  99,8%	
  a	
  100%	
  
—  Reprodutibilidade	
  
—  De	
  simples	
  padronização	
  e	
  execução	
  
—  Desvantagens:	
  
—  Custo	
  elevado	
  
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  direta	
  e	
  indireta	
  
Microscópio de epifluorescência 
Emissão de luz UV 
Excitação da molécula do fluorocromo 
Emissão de luz 
Captação por filtros especiais 
Figure	
  A-­‐17	
  EmissãoExcitação
Imunofluorescência	
  	
  
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  direta	
  e	
  indireta	
  
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  indireta	
  
Isocianato de 
fluorosceína (FITC) 
(Laurenti, 2009) 
Formas promastigotas da Leishmania 
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  indireta	
  
Texas	
  Red	
  
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  indireta	
  
Alexas Fluor 
Oocistos para Cryptosporidium 
parvum 
Reação	
  de	
  imunofluorescência	
  direta	
  e	
  indireta	
  
RIFI – T. cruzi 
Fonte: Superintendência do controle de endemias 
AIDS	
  
—  Testes de triagem: 
—  ELISA (várias gerações, com diversos antígenos) 
—  Quimioluminescência 
—  Testes confirmatórios: 
—  imunofluorescência 
—  Western Blot 
—  PCR 
Dengue	
  
—  Diagnóstico laboratorial 
—  inibição de hemaglutinação 
—  fixação de complemento 
—  MAC-ELISA (captura de IgM) 
Raiva	
  
—  Agente etiológico - vírus RNA. Vírus da raiva 
humana, família Rhabdoviridae 
—  Diagnóstico laboratorial – 
—  Imunofluorescência: IgM sérica específica 
—  Dosagem de IgM em secreção lacrimal ou 
salivar 
Rubéola	
  
—  Agente etiológico - Vírus RNA, família Togaviridae 
—  Diagnóstico sorológico: detecção de anticorpos IgM 
específicos para rubéola 
—  imunofluorescência 
—  ensaio imunoenzimático (ELISA IgM) 
Sarampo	
  
—  Agente etiológico - É um vírus RNA. Vírus pertencente 
ao gênero Morbillivirus, família Paramyxoviridae 
—  Diagnóstico laboratorial 
-  ELISA (IgM e IgG) 
-  fixação do complemento 
-  inibição de hemaglutinação 
-  imunofluorescência indireta 
Bibliografia	
  
—  IMUNOLOGIA CELULAR E MOLECULAR - 6ª EDIÇÃO. 
Abbas, Abul K., Lichtman, Andrew H., PILLAI, SHIV - 
Editora Elsevier. 
—  IMUNOBIOLOGIA DE JANEWAY - 7ª EDIÇÃO. Kenneth 
Murphy, Paul Travers, Mark Walport. Editora Artmed. 
Bibliografia complementar: 
—  DOENÇAS	
  INFECCIOSAS	
  E	
  PARASITÁRIAS	
  :	
  ASPECTOS	
  CLÍNICOS,	
  DE	
  
VIGILÂNCIA	
  EPIDEMIOLÓGICA	
  E	
  DE	
  CONTROLE	
  -­‐	
  guia	
  de	
  bolso	
  /	
  
elaborado	
  por	
  Gerson	
  Oliveira	
  Pena	
  [et	
  al].	
  -­‐	
  Brasília:	
  Ministério	
  da	
  Saúde:	
  
Fundação	
  Nacional	
  de	
  Saúde,	
  1998.	
  
—  BASTOS,	
   O.	
   C.;	
   RANGEL,	
   H.	
   A.;	
   MAGALHÃES,	
   L.	
   A.;	
   PIEDRABUEN,	
   A.	
   E.	
  
Evolução	
  das	
  imunoglobunilas	
  envolvidas	
  na	
  resposta	
  imune	
  de	
  camundongos	
  
ao	
  Schistosoma.	
  Revista	
  de	
  Saúde	
  Pública,	
  São	
  Paulo,	
  	
  v.	
  18,	
  n.	
  2,	
  1984.	
  
—  LAURENTI,	
  M.	
  D.	
  Correlação	
  entre	
  o	
  diagnóstico	
  parasitológico	
  e	
  sorológico	
  
na	
  leishmaniose	
  visceral	
  americana	
  canina.	
  Bepa,	
  São	
  Paulo,	
  v.	
  6,	
  n.	
  67,	
  2009.	
  	
  
—  LOWELL,	
  C.	
  Métodos	
   laboratoriais	
  e	
  clínicos	
  para	
  a	
  detecção	
  de	
  antígenos	
  e	
  
anticorpos.	
  In:	
  PARSLOW,	
  T.	
  G.	
  et	
  al.	
  Imunologia	
  Média.	
  Guanabara	
  Koogan.	
  
Rio	
  de	
  Janeiro.	
  2001.	
  pp.	
  184-­‐201.	
  
—  VAZ,	
  A.	
  J.;	
  TAKEI,	
  K.;	
  BUENO,	
  E.	
  C.	
  Imunoensaios:	
  fundamentos	
  e	
  aplicações.	
  
Guanabara	
  Koogan.	
  Rio	
  de	
  janeiro.	
  2007.