Relatório 1 CCMB

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI
 CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU CURSO DE FARMÁCIA
TEMA 1: Teste de Esterilidade 
 Teste de bacteriostase e fungistase
Fernanda Rocha
Linicene Rosa do Nascimento
Divinópolis, MG
2018
INTRODUÇÃO
 Quando se fala em produção de medicamentos e seus insumos, correlatos, cosméticos e seus adjuvantes, têm importância fundamental o controle da contaminação para que não se afete a qualidade do produto e, principalmente, a segurança do paciente, sendo que produtos que contém contaminantes microbiológicos nem sempre apresentam alterações sensoriais evidentes (PINTO et al., 2010).
A esterilização é o processo no qual se verifica a destruição, inativação ou remoção de todas as formas viáveis de microrganismo, incluindo esporos, fungos, protozoários e vírus, mas não garantir a inativação de endotoxinas (BAIRD, 2004; Brasil, 2010).
O teste de esterilidade tem como um de seus objetivos, garantir que qualquer atividade bacteriostática ou fungistática inerente ao produto não tenha influência adversa sobre a confiabilidade do teste (BRASIL, 2010).
A realização do teste de validação para bacteriostase e fungistase deve ser feita quando o teste de esterilidade for realizado pela primeira vez para um produto e sempre que tiver modificações na formulação do produto e/ou nas condições experimentais do teste. Esta validação deve ocorrer antes do produto ser submetido ao teste de esterilidade (BRASIL, 2010).
Existem dois métodos nos quais se baseiam os procedimentos para o teste de esterilidade, que estão descritos a seguir: Filtração em membrana, onde se transfere o conteúdo do(s) frasco(s) teste em dispositivo de filtração e adiciona não mais que 100 UFC do microrganismo teste à última alíquota do fluido estéril utilizado para lavagem da membrana. Inoculação direta, onde o conteúdo do(s) frasco(s) teste sã transferidos para frascos contendo meios de cultura e adicionado 100 UFC do microrganismo teste aos meios (BRASIL, 2010).
A análise dos testes é feita pela presença ou ausência de crescimento microbiológico. Se ocorrer crescimento e este for compatível com o do controle positivo, mediante condições ideais para o teste; considera-se que a atividade antimicrobiana foi satisfatoriamente eliminada, e o teste pode ser prosseguido. Se não foi observado crescimento, ou o mesmo, não foi compatível com o observado no controle positivo, mediante condições ideais para o teste; considera-se que a atividade antimicrobiana não foi satisfatoriamente eliminada, então se deve propor modificações nas condições do teste para diminuir a atividade, e em seguida repetir o teste de validação (BRASIL, 2010).
No decorrer do período de incubação até o térmico, é preciso avaliar se houve evidências macroscópicas de crescimento microbiano, para isso devem-se realizar testes para averiguar se a amostra cumpre o requisito de esterilidade (BRASIL, 2010).
Algumas condições podem invalidar o teste de esterilidade, são elas: falha na revisão dos procedimentos analíticos utilizados durante o teste; falhas nos dados de monitoramento microbiológico da área de realização do teste; crescimento microbiano observado nos controles negativos, dentre outros (BRASIL, 2010).
Para realizar a amostragem devem-se utilizar quantidades determinadas pela monografia individual do produto ou conforme especificado na Farmacopeia 5ª edição. A quantidade mínima necessária para cada meio de cultura também é especificado na Farmacopeia. 
ESTUDO DE CASO
O teste de esterilidade por filtração por membrana está sendo desenvolvido para uma pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e sulfato de polimixina B, cuja composição é: cloridrato de oxitetraciclina, sulfato de polimixina B, óleo mineral e petrolato branco.
 O ensaio para testar a bacteriostase e fungistase do produto foi realizado segundo o procedimento: o produto foi disperso em miristato de isopropila (1%) com auxílio de aquecimento (40°C). Em seguida, a mistura foi filtrada através da membrana e três porções de 200 mL de Fluido de lavagem III foram utilizadas para lavar a membrana. Na última porção do Fluido de lavagem, foi adicionado 0,1 mL de suspensão de microrganismo teste contendo aproximadamente 100 células. A membrana foi inoculada nos tubos contendo os meios de cultura. Para obtenção dos tubos controle, o mesmo procedimento descrito anteriormente foi realizado, com exceção da adição do medicamento. Após o período de incubação, a turvação do meio de cultura dos tubos contendo a membrana na qual foi filtrado o medicamento foi comparada à turvação dos tubos controle. Os resultados obtidos estão apresentados nas tabelas abaixo.
QUESTÕES
3.1 Qual a importância da realização dos controles do ambiente? 
O controle do ambiente garante que os resultados obtidos pelo analista, para os testes de bacteriostase e fungistase, tanto do controle quanto amostral, sejam realizados por procedimentos e operações adequados para os testes, através do controle de partículas e fluxo de ar, adequação da paramentação e higiene do local e funcionários, isso tudo contribui para a diminuição das fontes de contaminação. (BRASIL, 2010)
3.2 Qual o objetivo do controle negativo da membrana?
Esse controle é realizado para confirmar a ausência de microorganismos na membrana, na qual será realizado o processo de filtração. Ele avalia também se o processo de esterilização foi eficiente para eliminar os microrganismos da membrana (BRASIL, 2010)
3.3 Qual o objetivo do controle negativo do fluido de membrana? 
O controle negativo é realizado para confirmar a ausência de crescimento microbiano nos fluidos e solventes utilizados. Conforme descrito na Farmacopéia 5ª ed., os fluidos utilizados não devem apresentar atividade antimicrobiana nas condições do teste.
3.4 Qual o objetivo de utilizar o miristato de isopropila no teste de esterilidade?
Óleos e soluções viscosas devem ser diluídos em solvente estéril adequado como, por exemplo, miristato de isoproprila, desde que demonstrado não possuir atividade antimicrobiana nas condições do teste. A utilização foi para dispersão do produto que tem caráter lipofílico em diluente aquoso. Entretanto, a utilização desse solvente deve ser efetuada com critério, uma vez que apresenta toxicidade para os microrganismos.( BRASIL , 2010; BRUM, 2009;)
3.5 Quais as características que o miristato de isopropila deve possuir para que possa ser empregado no teste de esterilidade?
O miristato de isoproprila é um solvente estéril, não deve possuir atividade antimicrobiana nas condições do teste. Ele deve ser esterilizado antes do uso, por filtração em membrana, e seu extrato aquoso deve apresentar pH não inferior a 6,5.
3.6 Avalie cada um dos controles realizados - justificar.
Controle do ambiente (contagem de partículas viáveis e totais suspensas no ar e controle de superfícies - de acordo com a especificação):
Neste caso, é verificado se o ambiente da área de realização do teste encontra-se adequado para a realização do teste, uma vez que, a probabilidade de contaminação durante o teste é reduzida.
Controle da membrana (negativo): 
Neste caso, é verificado se as membranas utilizadas no teste estão em condições consideradas adequadas para a realização do mesmo. 
Controle do fluido de lavagem (negativo):
Neste caso, observa-se se o fluido de lavagem, o qual será utilizado para realizar as lavagens da membrana esta em condições adequadas de esterilidade para tal processo na qual garanti a eficácia do fluido de lavagem pois não foi observado microrganismo.
Controle negativo dos meios de cultura (fluido tioglicolato e caldo caseína-soja - negativo):
Neste caso, é possível observar se todos meios de cultura apresentam-se isentos de microrganismos, ou seja, a condição de esterilidade deve ser mantida tanto no fluido tioglicolato quanto no caldo caseína-soja comprovando a eficiência da esterilidade.
Controle positivo dos meios decultura (fluido tioglicolato e caldo caseína-soja - positivo):
Neste caso, todos os meios de cultura ao serem contaminados apresentarão condições de crescimento aos microrganismos, o que inviabiliza obtenção de resultado falso-negativo durante a realização do teste.
3.7 Parecer em relação ao procedimento para execução do teste de esterilidade para pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e sulfato de polimixina B – justificar detalhadamente.
Olhando as tabelas com os resultados referentes à bacteriostase e fungistase para o meio caldo caseína-soja (tabela 2) podemos ver que no tubo 2 (amostra) o Bacillus subtilis teve o seu crescimento inibido diante da presença da pomada oftálmica, uma vez que, não foi verificada a presença de turvação ao comparar com o tubo 1 (controle). Nos resultados referentes à bacteriostase e fungistase no fluido tioglicolato (tabela 3) é possível observar que no tubo 2 (amostra) o Staphylococcus aureus e o Clostridium sporogenes não apresentaram crescimento diante da pomada oftálmica, o que é verificado devido à ausência de turvação.
Percebeu-se que a pomada oftálmica apresentou atividade antimicrobiana contra alguns dos microrganismos, sendo este, um fator capaz de interferir no resultado do teste de esterilidade. Diante das considerações abordadas é possível afirmar que o procedimento para execução do teste de esterilidade da pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e sulfato de polimixina B houve interferência da amostra, no caldo caseína –soja para o Bacillus subtilis ATCC 6633 e no fluido tioglicolato para os microorganismos Sthyloccus aureus ATCC 6538 e Clostridium sporogenes ATCC 1904, essas condições analíticas mostram que a amostra encontram-se inapropriadas para a realização do teste de esterilidade pois tem interferente. 
3.8 Como farmacêutico responsável pelo controle de qualidade microbiológico, qual seria sua sugestão para o analista quanto ao procedimento do teste de esterilidade para a pomada oftálmica de cloridrato de oxitetraciclina e sulfato de polimixina B – justificar detalhadamente.
Como farmacêutica, orientaria o analista a aplicar vários procedimentos que poderiam como por exemplo: fazer uma diluição da amostra ou identificar os possíveis interferentes e adicionar substâncias que neutralizem os componentes. Em seguida deve-se realizar o reteste de bacteriostase e fungistase com a amostra, se todos os tubos do reteste apresentarem turvação semelhante do controle, só então pode-se continuar a executar os teste de esterilidade.
REFERÊNCIAS
BAIRD RM. Sterility Assurance: Concepts, Methods and Problems. In Russell, Hugo & Ayliffe's Principles and Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization. 4 ed. Oxford: Blackwell Pub., 2004. p.526-539.
BATISTUZZO, J.A; ITAYA, M; ETO, Y. Formulário Médico-Farmacêutico. São Paulo/SP: Tecnopress, 4ª Ed. 2011.
BRASIL. Farmacopeia Brasileira. 5ª ed. Brasília: Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2010. v.1. 546p. 
BRUM, Ricardo Cristiano de Souza. Padronização e validação da técnica do Limulus Amebocyte Lysate (LAL) semi-quantitativa e quantitativa para o biofármaco alfainterferona 2b humana recombinante. p. 115 , 2009.
PINTO TJA; KANEKO TM; PINTO AF. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 3. Ed. São Paulo: Atheneu, 2010. 780p.