5ª aula Validação 2 Métodos Analíticos e bio

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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS 
ANALÍTICOS E BIOANÁLICOS
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Qualidade
• Conceito subjetivo
• Contextualização: 
- na ótica do produto
- na ótica do cliente
- na ótica da produção
- na relação custo:benefício
• Fases:
- era da inspeção
- era do controle estatístico
- era da qualidade total
- ERA DA VALIDAÇÃO2
O CQM – destaca pelo nº e variedade de 
técnicas analíticas e bioanalítica.
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Validação de Métodos Analíticos e Validação de Métodos Analíticos e 
BioanalíticosBioanalíticos
↑ com desenvolvimento de 
novos produtos
Necessário ≠s Técnicas.
Validação Analítica/Bioanalítico Validação Analítica/Bioanalítico 
- Definição- Definição
“É o processo pelo qual é estabelecido, 
por estudos de laboratório, que as 
características executadas do 
método satisfazem os requisitos para 
as aplicações analíticas praticadas.”
United States Pharmacopeia/USP
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“É uma documentação exigida pela 
LEGISLAÇÃO para comprovação que 
determinado processo ou método é 
adequado.”
 RDC 
899/2003GUIA PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS E 
BIOANALÍTICOS - RDC Nº 27/2012 - MS
Validação Analítica/Bioanalítico Validação Analítica/Bioanalítico 
- Definição- Definição
Processo que busca assegurar a obtenção 
de resultados confiáveis, válidos pelo 
uso de determinado válidos, pelo uso de 
determinado método analítico. 
É um item essencial do PROGRAMA DE 
SEGURANÇA DE QUALIDADE.”
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 Objetivo
 Atender exigências legais.
 Comprovar desempenho do método nas condições de uso.
 Obter reais características de performance do método.
 ... em outras palavras:
(é o processo de demonstração de que um método analítico “funciona”).
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Por quê Validar um Método Por quê Validar um Método 
Analítica/BioanalíticoAnalítica/Bioanalítico??
Validação de Métodos Validação de Métodos 
Analítica/BioanalíticoAnalítica/Bioanalítico
Métodos normalizadosMétodos normalizados
 (farmacopéicos) já são métodos validados e 
não é necessário proceder ao processo 
completo de validação desde que não 
ocorram alterações significativas dos 
mesmos e quando o produto em questão é 
o indicado na monografia. 
 A conformidade dos métodos usados deve 
ser verificada sob condições reais de uso. 
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Etapas pré-Validação Etapas pré-Validação 
Analítica/BioanalíticoAnalítica/Bioanalítico
 1. Investimento em Laboratório;
 2. Investimento em Equipamentos;
 3. Capacitação de Pessoal;
 4. Validação.
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ETAPAS CRÍTICAS DO 
PROCEDIMENTO ANALÍTICO e BIO
 Amostragem
 Preparo da amostra (61% do tempo 
gasto em um método e 30% das causas 
de erros)
 Quantificação
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RE nº 899, de 29 de maio de 2003
RDC n.º 27, de 17 de maio de 2012
VALIDAÇÃO10
Passos para a ValidaçãoPassos para a Validação
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1. Classificação do método de análise;
2. Conhecer a legislação;
3. Estabelecer e identificar os parâmetros de 
validação a serem empregados ao método 
analítico;
4. Determinar os critérios de aceitação;
5. Desenvolver e executar o protocolo de 
validação;
6. Emitir relatório da validação e completar a 
documentação.
Passos para a ValidaçãoPassos para a Validação
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1. Delineamento experimental
2. Padronização analítica
3. CQ dos resultados
 No caso de metodologia analítica não descrita em não descrita em 
farmacopéias farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente 
reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será considerada 
validada, desde que sejam avaliados os parâmetros 
relacionados a seguir:
- Especificidade e Seletividade Especificidade e Seletividade 
- Linearidade  Linearidade  
- IntervaloIntervalo
- Precisão Precisão 
- Limite de detecção (sensibilidade) Limite de detecção (sensibilidade) 
- Limite de quantificação  Limite de quantificação  
- Exatidão Exatidão 
- Robustez Robustez 
Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003
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Parâmetros analíticos de Parâmetros analíticos de 
validaçãovalidação
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 Classificação dos Testes segundoClassificação dos Testes segundo
 sua finalidadesua finalidade
Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003
Parâmetros l ll lll lV
Quantitativo Ensaio 
limite
Especificidade SIM SIM SIM * SIM
Linearidade SIM SIM NÃO * NÃO
Precisão de 
Repetibilidade
SIM SIM NÃO SIM NÃO
Intermediária ** ** NÃO ** NÃO
Sensibilidade (LD) NÃO NÃO SIM * NÃO
Sensibilidade (LQ) NÃO SIM NÃO * NÃO
Exatidão SIM SIM * * NÃO
Robustez SIM SIM SIM NÃO NÃO
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 Ensaios necessários para VMAEnsaios necessários para VMA
•*Pode ser necessário, dependendo da natureza do teste especificado
•**se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão 
Especificidade/SeletividadeEspecificidade/Seletividade
 O termo especificidade, muitas vezes utilizado como sinônimo de 
seletividade, define a capacidade do método em detectar o analito de 
interesse na presença de outros componentes da matriz. Já a 
seletividade refere-se à capacidade de detecção de substâncias. 
 Quando um método é específico ?Quando um método é específico ? 
 É capaz de avaliar uma determinada substância em uma mistura 
complexa (impurezas, produtos de degradação ou compostos 
químicos relacionados), sem que estas interfiram no resultado.
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É a capacidade de medir exata e especificamente 
o fármaco na presença de outros constituintes da 
amostra.”
United States Pharmacopeia/USP
Métodos para especificidadeMétodos para especificidade
 Identificação
Testes devem ser capazes de discriminar entre compostos compostos 
de estruturas parecidas que podem estar presentesde estruturas parecidas que podem estar presentes; 
Deve ser aplicado a materiais estruturalmente similares 
ao analito para confirmar que a resposta positiva não é 
obtida.
 Doseamento e testes de impurezas
Para procedimentos cromatográficos e outras técnicas de 
separação. 
 Teor
Quantidade do analito
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 Concordância (C%):
 Depende de padrão
C% = Padrão x 100
 Amostra
Obs: Valores > 100% = interferentes contribuindo no 
sinal do analito.
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Métodos para especificidadeMétodos para especificidade
ExpressãoExpressão
Linearidade
 É a capacidade de uma metodologia analítica de 
demonstrar que os resultados obtidos são diretamente resultados obtidos são diretamente 
proporcionais à concentração do analito na amostraconcentração do analito na amostra, 
dentro de um intervalo especificado (80% a 120%).   
 Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela 
análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes.5 concentrações diferentes.
 Os Os resultadosresultados dos testes devem ser avaliados por dos testes devem ser avaliados por 
métodos estatísticos como pelo cálculo da métodos estatísticos como pelo cálculo da 
regressão linear pelo método dos quadrados regressão linear pelo método dos quadrados 
mínimos.mínimos.
 Critério de aceitação: a curva deve ser linear com r2 
(coeficiente de correlação) de pelo menos 0,99 .
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A avaliação da curva de calibração, recomendam o uso: 
 5 a 8 determinações que correspondem ao intervalo 
entre o valor superior e inferior da substância em 
exame, que atendam aos requisitos de precisão, 
exatidão e linearidade.
Pennickx et al., 1996; Shan et al., 1992; Hill et al., 1992; Metha, 
1898; Massart et al., 1998 e Hartmann et al., 1998. 
LinearidadeLinearidade
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LinearidadeLinearidade
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Julga-se satisfatória a linearidade do gráfico quando o 
coeficiente de correlação da reta obtida não é 
estatisticamente diferente da unidade.
No caso, considera-se: 
R = 1 Correlação perfeita 
0,91 < R < 0,99 Correlação fortíssima 
0,61 < R < 0,91 Correlação forte 
0,31 < R < 0,60 Correlação média 
0,01 < R < 0,30 Correlação fraca 
R = zero Correlação nula
ExatidãoExatidão Representa o grau de concordância/proximidade entre grau de concordância/proximidade entre 
os resultados obtidos e um valor aceitoos resultados obtidos e um valor aceito como 
referência.
Casos:
- aplicação do procedimento analítico na análise de um 
analito de pureza conhecida (ex.: padrão de 
referência);
- aplicação do procedimento analítico na análise de 
uma mistura sintética dos componentes do produto ou 
a produtos de degradação à qual foi adicionada 
quantidades conhecidas da substância a ser 
analisada;
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ExatidãoExatidão
Cálculo da % de recuperação: 
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• Representa o grau de concordânciaconcordância entre os resultados das 
análises individuais quando o procedimento é 
aplicado/repetido mais de uma vez em uma amostra 
homogênea, em idênticas condições de teste.
• Reflete a dispersão dos vários resultados individuais do 
doseamento em relação ao valor médio estando ou não 
próximos do valor verdadeiro.
PrecisãoPrecisão
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Estatisticamente aEstatisticamente a
*Repetibilidade
Expressa a precisão sob as mesmas condições operacionais dentro de um precisão sob as mesmas condições operacionais dentro de um 
mesmo ensaiomesmo ensaio. É também denominada precisão intra-ensaio: variação do 
resultado das medidas observada no mesmo ensaio.
Precisão intermediária
Expressa variações dentro do laboratório: dias diferentes, diferentes dias diferentes, diferentes 
analistas, equipamento diferenteanalistas, equipamento diferente, etc.. É também denominada precisão 
inter-ensaio: variação do resultado das medidas observada para a mesma 
amostra dosada em diferentes ensaios.
Reprodutibilidade
Expressa a precisão entre laboratórios precisão entre laboratórios (estudos colaborativos, usualmente 
aplicados para padronizar um procedimento analítico, de forma a 
permitir sua inclusão em farmacopéias).
A Precisão está associada:A Precisão está associada:
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Expressão da PrecisãoExpressão da Precisão
 O O Desvio Padrão, Coeficiente de Variação (CV) e os intervalos de confiança Desvio Padrão, Coeficiente de Variação (CV) e os intervalos de confiança 
 devem ser devem ser relatadosrelatados para cada tipo de precisão avaliada; para cada tipo de precisão avaliada;
 O desvio padrão relativo deve ser O desvio padrão relativo deve ser < 1,0% < 1,0% em análises realizadas no mesmo em análises realizadas no mesmo 
dia e dia e inferiores a 2% inferiores a 2% em análises realizadas em dias diferentes, por diferentes em análises realizadas em dias diferentes, por diferentes 
analistas e em equipamentos distintos.analistas e em equipamentos distintos.
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CV% = Desvio-Padrão x 100
 Média
 Em (a) os resultados 
são exatos porque, 
em média, estão 
próximos do valor 
verdadeiro, mas não 
são precisos porque 
há certa dispersão.
• Em (b) a situação 
ideal, resultados 
precisos e exatos.
• Em (c) temos a pior 
situação, isto é, 
resultados nem 
precisos nem 
exatos
• Em (d) os 
resultados são 
precisos porque 
estão próximos 
entre si, mas não 
são exatos porque 
estão distantes do 
valor verdadeiro.
Exatidão Exatidão ee Precisão Precisão
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Precisão e Exatidão
Exatidão Ruim
Precisão Boa
Exatidão Boa
Precisão Boa
Exatidão Ruim
Precisão Ruim
Exatidão Boa
Precisão Ruim
Limite de detecçãoLimite de detecção
 É a menor quantidade de um analito em uma 
amostra que pode ser detectado, porém não 
quantificado, sob as condições estabelecidas.
Limite de quantificaçãoLimite de quantificação
 É a menor quantidade do analito que pode ser 
determinada com precisão e exatidão aceitáveis, 
sob as condições estabelecidas.
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SensibilidadeSensibilidade
Robustez/ResistênciaRobustez/Resistência
 Capacidade que um método apresenta Capacidade que um método apresenta em 
se manter inalterado e fornecer resultados fornecer resultados 
seguros seguros quando sujeito a pequenas pequenas 
modificações modificações em seus parâmetros.
- Fatores:
- a mudança da coluna
- fluxo da fase móvel em HPLC
- mudança dos analistas
- pH
- Temperatura
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IMPORTANTE!IMPORTANTE!
 Um método analítico deve:
- ser exato para fornecer resultado real,
- ser preciso para fornecer em um menor 
número de análises este resultado real,
- ser seletivo para que a exatidão não 
desvie com os potenciais interferentes,
- ser sensível ou capaz de determinar 
concentrações baixas, as menores 
possíveis,
- responder de forma linear, ao longo de 
ampla faixa de concentração.
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Validação x POPValidação x POP
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Definição de POP
 Procedimento Operacional Padrão
 Segundo a RDC 134 (2001), “POP’s são 
procedimentos escritos e autorizados que dão 
instruções detalhadas para a realização de 
operações específicas na produção de produto 
farmacêutico e outras atividades de natureza 
geral”
 Manual de qualidade da Empresa (BASE DA 
QUALIDADE)
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Objetivo principal do POP
 Cumprir BPFs
 Muito importante no CQ
 Segurança das análises.
 Segurança dos analistas.
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Estruturação dos POPsEstruturação dos POPs
 Cabeçário: 
 logomarca da empresa; 
 título do procedimento a ser descrito; 
 data de emissão do POP; 
 data de revisão: normalmente feita após 12 
meses; 
 número de páginas do POP descrito; e 
 edição: número de revisões já feitas
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Estruturação dos POPsEstruturação dos POPs
 Objetivo: deve descrever a que se destina o 
POP.
 Âmbito de Aplicação: define em qual setor 
será realizado o POP. 
 Responsabilidades: descreve as 
responsabilidades dos farmacêuticos e/ou 
funcionários que executarão o POP descrito.
 Documentos de Referência: define os 
materiais que servirão de consulta e apoio.
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Estruturação dos POPsEstruturação dos POPs
 Procedimento: descreve detalhadamente de forma 
numerada todas as etapas e procedimentos para a 
execução da atividade a ser realizada. 
 Manutenção preventiva: define quando deverá ser 
realizada a manutenção dos equipamentos relacionados 
à execução do processo. 
 Roteiro para soluções de problemas: descreve quais 
problemas podem acontecer durante a realização da 
atividade, qual a causa e a possível solução a ser 
tomada. 
 O final da primeira página de cada POP deverá conter os 
nomes dos responsáveis pela elaboração, revisão e 
aprovação do POP
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Exemplos de POPs de algumas das Exemplos de POPs de algumas das 
áreas teoricamente existentes nas áreas teoricamente existentes nas 
empresasempresas40
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Exemplos de POPs de algumas das Exemplos de POPs de algumas das 
áreas teoricamente existentes nas áreas teoricamente existentes nas 
empresasempresas
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