Sequenciamento+do+DNA

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Estudando o Genoma Sequenciamento do DNA
 Definição: Processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. 
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Métodos de sequenciamento:
Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. 
Frederick Sanger (Rendcombe, Gloucestershire, 13 de Agosto de 1918) é um bioquímico inglês.
Fez Bacharelado em ciências naturais (1939) e doutoramento em 1943
Sanger descobriu a sequência completa de aminoácidos de insulina, em 1955, provando que as proteínas têm estruturas definidas
Recebeu o Nobel de Química de 1958, por ter determinado a estrutura molecular da insulina. Conjuntamente com Walter Gilbert, recebeu novamente o Nobel de Química de 1980, por estudos sobre o DNA.
1977- Técnica de sequenciamento de DNA -método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia
Princípio da técnica: Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo
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Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detectá-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” .
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A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ; um dos mais utilizado é o dATP α³²P (fig 2a). Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs) . 
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Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de análise para cada reação. O gel é “transferido” para um suporte de nitrocelulose (filtro). Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada: que serviu de “molde”. Levando estas observações em consideração, é possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel. 
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Terminadores de cadeia:
Dideoxinucleotídeos
Nucleotídeos normais
Terminadores de cadeia
Se o OH não está presente a sequencia é terminada
Misturando com cuidado os dideoxinucleotídeos terminadores podemos determinar a sequencia do DNA
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Azidotimidina (AZT) é uma droga usada no tratamento da AIDS.
AZT, também chamado zidovudina é basorvido pelas células aonde é convertido em trifosfato. A transcriptase reversa do HIV prefere o AZT trifosfato do que o nucleotídeo normal (dTTP). Como o AZT não possui o grupamento 3′ -OH, a síntese do DNA pela transcriptase reversa é paradaquando o AZT é incorporado na fita crescente. Felizmente, as DNA polimerases das células do hospedeiro preferem o dTTP, assim os efeitos colaterais da droga não são tão severos como seria de se esperar. 
A lamivudina, que também é um análogo dos dideoxinucleosídios, sofre fosforilação intracelular, dando origem ao metabólito ativo, trifosfato de lamivudina, que assim como a zidovudina age inibindo a atividade da transcriptase reversa.
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Método de sequenciamento de Sanger
Reagentes para um sequenciamento:
1) DNA de fita simples (molde a ser sequenciado)
2) Primer (1 só)
3) todos os nucleotídeos normais (dNTPs) misturados com um ddNTP-terminador de cadeia
4) DNA polimerase
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Primer para a replicação
Fita a ser sequenciada
Preparação de 4 misturas de reação; cada uma com um nucleotídeo terminador de cadeia
Separação dos produtos por eletroforese
Tentando compreender....sequenciamento de DNA pelo método Sanger
Leitura da sequencia como bandas complementares contendo fitas marcadas
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Sequenciamento Manual
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Géis de sequenciamento
Gel de poliacrilamida
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O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência. Como cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento . O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador (4c). Variáveis mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA
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Evolução: Anos 80 – seqüenciador semi-automático
• Substituição das técnicas de detecção por radioatividade pelo
uso de marcadores fluorescentes
• Radioisótopos – danosos à saúde, dificuldade de automação
• Fluorófos – sistema de detecção que permite a leitura automática das
seqüências
• Preparação do gel e aplicação das amostras
• Utilização ddNTPs fluorescentes lidos automaticamente durante a eletroforese
• Corantes fluorescentes – reações no mesmo poço no gel
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Procedimento:
O DNA a ser sequenciado é preparado como fita simples
Essa fita é misturada com:
1) Uma mistura com todos os nucleotídeos normais (desoxirribonucleotídeos) em excesso
dATP, dGTP, dTTP e dCTP
2) Uma mistura de todos os dideoxinucleotídeos, cada um em quantidades limitantes, marcado com uma cauda fluorescente com diferentes cores: ddATP, ddGTP, ddTTP e ddCTP
3) DNA polimeraseI
Eletroforese, usando um laser para ativar os dideoxinucleotideos fluorescentes e um detector para distinguir as cores
No final da incubação os fragmentos são separados por tamanho. A resolução é tão boa , que a diferença de 1 nucleotídeo é suficiente para separar um fragmento do outro. Cada um dos ddNTPs fluoresce uma cor diferente quando iluminado por um laser e um scanner automatico faz a impressão da sequencia
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ABI
Prism 310 Genetic Analyzer – Sequenciador Automático de DNA
MegaBACE 1000
Marca: Molecular Dynamics
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO
Seqüenciadores automáticos – avanço para a genômica, poucas centenas de pb
Seqüenciadores de capilares - duas vezes mais rápidos, completamente automatizados
Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecção através de fluorescência confocal excitada por laser
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Imagem obtida após o seqüenciamento de DNA. Cada pico colorido representa um nucleotídeo na seqüência do DNA.
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Um cromatograma da sequencia de DNA. O computador lê os picos coloridos como uma das 4 bases, traduzindo apenas quando o sinal é forte. 
'Y' representa uma base que é ambígua – tanto existem 2 sinais conflitantes ou não existe nenhum sinal quando se espera por um. As setas cinza mostram aonde o computador iria esperar ler uma base. <http://www2.perkin-elmer.com:80/ga/uu0901/770901.html>
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Projeto genoma Humano
Objetivos: Identificar os 20.000-25.000 genes do genoma humano do ponto de vista físico 
e funcional
Determinar os 3 bilhões de nucleotídeos do DNA humano
Estocar esta informação em bancos de dados
Melhorar as ferramentas de análise de dados
Transferir tecnologia 
Início em 0utubro de 1990, término em 2003 (13 anos); a expectativa era de 15 anos
Custo 3,8 bilhões de dólares
Fundado em 1990 pelo United States Department of Energy e U.S. National Institutes of Health. Além dos USA, o consórcio internacional compreendeu geneticistas do Reino Unido, França, Alemanha, Japão, China, e India.
Site do projeto: http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
Craig Venter (head of Celera Genomics), Ari Patrinos (director of DOE Human Genome Program and Biological and Environmental Research Program), and Francis Collins (director, NIH National Human Genome Research Institute). 
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Impactos na medicina
Diagnóstico genético 
Testes com base no DNA estão entre as primeiras aplicações comerciais das novas descobertas genéticas
Podem ser usados para diagnosticar e confirmar doenças, até mesmo em indivíduos assintomáticos; prover um prognóstico sobre o curso da doença; e , com variados graus de acurácia, predizer o risco de doenças futuras em indivíduos saudáveis ou de seus filhos
Testes Genéticos no mercado –ex. Distrofia muscular miotônica e de Duchenne. Fibrose cística, neurofibromatose do tipo1, doença de Huntington
Limitações: Os testes podem não detectar todas as mutações presentes na população (algumas nem foram descobertas)
Faltam ainda tratamentos efetivos ou medidas preventivas para diversas doenças
Tomar conhecimento do risco de uma doença futura pode produzir impactos emocionais e psicológicos significativos ; Pode por em risco determinados grupos da população
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Myriad Genetics holds the exclusive right to test for cancer-causing mutations on the BRCA1 and BRCA2 genes. Read more: http://www.forward.com/articles/112419/#ixzz1b3xaJPD7 
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Mais de 100,000 pessoas morrem a cada ano dos efeitos adversos a medicamentos que podem ser benefico aos outros. Outras 2,2 milhões experimentam sérias reações, enquanto outras não respondem de forma alguma. Variantes nos genes envolvidos no metabolismo de drogas, particularmente na família multigênica do citocromo p450, são o foco de pesquisas na área. 
Enzimas codificadas por estes genes são responsáveis pelo metabolismo da maioria das drogas usadas hoje, incluindo diversas para o tratatemnto de doenças psiquiátricas, neurológico e cardiovasculares. A função da enzima afeta as respostas dos pacientes a droga e a dose. Avanços futuros irão permitir o teste rápido do genótipo do paciente e guiar o tratemento para as drogas mais efetivas (e com menos efeitos colaterais)
Informações genômicas e tecnologias também tornarão o desenvolvimento de novas drogas mais rápido, barato e mais efetivo. A maioria das drogas de hoje é feita com base em 500 alvos moleculares; o conhecimento dos genes envolvidos nas doenças, vias de doenças e reposta a drogas irá levar a descoberta de milhares de novos alvos. 
Outras aplicações: detecção de patógenos, desenvolvimento de novas fontes de energia (biocombustíveis), monitoramento ambiental, estudos evolutivos, identificação por DNA (forense), melhoramento genético de plantas e animais, desenvolvimento de biopesticidas, novas vacinas,...
Farmacogenômica
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Métodos modernos de sequenciamento -454 (sequenciamento de última geração)
Um novo método de sequenciamento de DNA, usualmente chamado de pirosequenciamento, foi desenvolvido pela Roche Applied Sciences . Através deste método, pode-se sequenciar genomas de organismos diversos de uma maneira muito mais rápida e barata
Piroseqüenciamento – tempo real, seqüenciamento por síntese
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DNA genômico é fragmentado (400-600pb)
DNA é convertido à fita simples e ligado à adaptadores
Faz-se um PCR de emulsão
1 bead + 1 DNA por hibridização com o adaptador
As beads são encapsuladas em vesículas lipídicas
Cada bead contém 107 moléculas de DNA idênticas
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1 bead + 1 DNA por hibridização com o adaptador
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1.6 million well PicoTiterPlate(TM), which allows for the parallel sequencing of DNA segments separated in different wells.
The DNA-containing beads are then enriched and loaded onto the PicoTiterPlate(TM) for a massively parallel sequencing analysis of the attached DNA fragments
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A reação de sequenciamento é baseada na detecção do pirofosfato, que é formado no processo de acoplamento de um nucleotídeo a um primer de DNA existente pelaDNA polimerase.
 A enzima LUCIFERASE é usada para catalizar a hidrólise de uma molécula de pirofosfato em 2 orto-fosfatos e 1 fóton. Existem diversos passos, na qual os 4 nucleotídeos são individualmente ciclados dentro de uma câmera de fluxo que consiste na PicoTiterPlate(TM) com as beads e uma câmera CCD. Cada etapa de nucleotídeo é separada por uma etapa de lavagem. Este tipo de sequenciamento foi chamado também de sequenciamento por síntese, já que cada adição de um nucleotídeo a uma cadeia de oligonucleotídeos existente é monitorada pela emissão de luz. 
Pirossequenciamento
intensidade
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Etapa 1: Carregar as beads contendo o DNA
Etapa 2:Injetar os dNTPs, detectar o sinal de luz
Pirossequenciamento
O registro da quantidade de luz emitida em cada ciclo permite o assesso ao numero de nucleotídeos adicionados por ciclo. 400.000 reações são gravadas em uma placa 70x70 mm PicoTiterPlate(TM), resultando em20 a 40 Mb (milhões de bases) de alta qualidade.
 
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O 454 da Roche tem a abilidade de sequenciar 400 a 600 milhões de pares de bases por corrida com o tamanho de 400-500 pares de bases 
 http://www.roche-applied-science.com/publications/multimedia/genome_sequencer/flx_multimedia/wbt.htm
Filme:
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ION Torrent
O sequenciamento por Chips Semicondutores é a nova tecnologia da Life Technologies. Através da detecção da alteração do pH provocada pela liberação de íons hidrogênio (H+) durante a polimerização do DNA, o sistema Ion Torrent é capaz de determinar a sequência da molécula em estudo, transformando o sinal químico em sinal digital. A simplicidade do sistema, que elimina a necessidade de utilização de nucleotídeos modificados, de lasers, scanners e câmeras elimina inúmeras etapas propensas a erros e garante uma alta acurácea ao sistema (99,5% no dado bruto). A tecnologia atual permite a obtenção de até 100 M bases de dados em uma única corrida e consume não mais de 2 horas no equipamento. O sistema garante ainda uma cobertura homogênea da sequência em estudo, até mesmo em regiões difíceis de sequenciar, como regiões ricas em conteúdo GC e regiões de homopolímeros. 
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Análise de milhões de pares de bases, requer o use de clusters de computadores rodando em sistemas operacionais Unix e Linux
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Aplicações
Sequenciamento do genoma completo (sequenciamento de novo e resequenciamento)
Sequenciar
o genoma inteiro de um organismos, por exemplo, homens, cães, camundongos, vírus ou bactérias. 
Em junho de 2006, a 454 Life Sciences lançou um porjeto com o Max Planck Institute para Antropologia Evolutiva, para sequenciar o genoma do homem de Neanderthal. Em setembro de 2008 o genoma mitocondrial completo do Neandertal estava sequenciado, estabelecendo uma divergência com os humanos a 660,000 +/- 140,000 anos, e o genoma completo foi publicado em 2010, usando uma combinação do 
454 e Illumina
Mounted Neanderthal skeleton, American Museum of Natural History
Membros extintos do gênero homo, são classificados como subespécies dos homens modernos (Homo sapiens neanderthalensis)
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Sequenciamento do transcriptoma
Transcriptoma é o conjunto de transcritos de um determinado organismo
Compreende o conjunto de todas as moléculas de RNA incluindo o RNAm, RNAt, RNAr e todos os RNAs não codificadores produzidos por uma ou uma população de células
Pode variar com as condições ambientais (ao contrário do nosso genoma)
Como inclui todos os mRNAs transcritos na célula, o transcriptoma reflete os genes que estão sendo expressos em qualquer momento, com excessão do mRNA que será degradado (atenuação transcricional)
Estudar o transcriptoma nos permite descobrir novos genes, novas variantes (mutações), SNPs (polimorfismos de 1 único nucleotídeo)etc…
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Metagenômica
É o estudo dos metagenomas, material genético recuperado diretamente de amostras ambientais
Método independente de cultivo
O sequenciamento de amostras de DNA ambiental (geralemnte do gene do rRNA 16S) produz um perfil da diversidade microbiana presente na amostra
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