Aula 7 Biologia molecular e clonagem

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SDE0010 – GENÉTICA 
Aula 7: Biologia molecular e clonagem 
GENÉTICA 
AULA 7: BIOLOGIA MOLECULAR E CLONAGEM 
Conteúdo desta aula 
FUNDAMENTOS DAS 
TECNOLOGIAS DO DNA 
 RECOMBINANTE 
1 
SOUTHERN BLOTTING 
3 
PRÓXIMOS 
PASSOS 
TÉCNICA DE ELETROFORESE 
EM GEL DE AGAROSE 
2 
NORTHERN BLOTTING 
4 
WESTERN BLOTTING 
5 
TRANSFORMAÇÃO 
 DE E. COLI 
6 
REAÇÃO EM CADEIA 
DA POLIMERASE (PCR) 
7 
REAL TIME RT-PCR 
9 
TRANSCRIÇÃO REVERSA 
 PCR (RT-PCR) 
8 
CLONAGEM E 
BIBLIOTECAS DE DNA 
10 
SEQUENCIAMENTO 
DO DNA 
11 
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Fundamentos das tecnologias do DNA recombinante 
A biologia molecular passou grandes avanços no Século XX, com o desenvolvimento de técnicas 
como a transformação genética de Escherichia coli, as técnicas de corte e união de moléculas de 
DNA e a reação de polimerase em cadeia. 
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Biologia Molecular e Clonagem 
Fundamentos das tecnologias do DNA recombinante 
Uma das técnicas mais importantes foi a clonagem. 
Para tanto, antes houve identificação e caracterização 
das enzimas de restrição, capazes de clivar o DNA em 
sequências específicas; das enzimas ligases, capazes de 
ligar fragmentos de DNA, e a descoberta do plasmídeo, 
que é um DNA circular de bactérias capaz de ser clivado 
e receber um inserto ou gene de outros seres. 
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Fundamentos das tecnologias do DNA recombinante 
Quando o plasmídeo ligado a um inserto (plasmídeo recombinante) é colocado em cultura de 
bactérias, ocorre autoduplicação. Como os insertos estão incorporados aos plasmídeos, dizemos 
que o inserto foi clonado, obtendo-se várias cópias. Além disso, há síntese de proteínas ou do 
produto gênico, que é codificado pelo inserto. É possível o isolamento dos novos plasmídeos e a 
retirada do inserto com o uso de enzima de restrição. Para assegurar que houve o corte e/ou a 
união das fitas, utiliza-se a técnica de eletroforese de DNA em gel de agarose. 
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Técnica de eletroforese em gel de agarose 
A técnica consiste na passagem de fragmentos de DNA 
em um gel de agarose ou poliacrilamida. O gel possui 
poros que filtram os fragmentos dependendo do seu 
tamanho ou peso molecular, ao serem submetidos a 
um campo elétrico. Como o DNA possui carga negativa, 
decorrente do fosfato de sua estrutura, ele tende a 
migrar para o polo positivo do campo elétrico. 
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Técnica de eletroforese em gel de agarose 
As bandas, constituídas por fragmentos de DNA com o mesmo tamanho, podem ser reveladas 
colocando-se o gel em contato com Brometo de Etídeo e, em seguida, expondo o gel à radiação 
ultravioleta (UV). 
Esta técnica pode ser usada também para a separação de proteínas, adicionando um detergente, o 
dodecil sulfato de sódio (SDS) que liga à proteínas conferindo carga negativa, e assim como ocorre 
com o DNA, as proteínas migram para o polo positivo. 
A eletroforese pode ser utilizado em uma grande variedade de testes. 
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Southern blotting 
Esta técnica corresponde à transferência dos 
fragmentos de DNA separados no gel de 
agarose para uma membrana de nylon ou de 
nitrocelulose. Para tanto, utiliza-se um tampão 
de transferência e coloca-se o gel em contato 
com material absorvente (papel) e a 
membrana. 
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Southern blotting 
Após transferência, faz-se a revelação utilizando pequenos segmentos de DNA (sondas) marcados 
radioativamente (preparados em laboratório) e que são complementares aos fragmentos 
transferidos do gel. Os fragmentos são detectados ao colocar a membrana em contato com filmes 
de raios X. Esta técnica pode ser utilizada em análises de DNA em algumas doenças como Prader 
Willi e Angelman. 
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Northern blotting 
É uma técnicas semelhante a Southern blotting, no entanto, permite a detecção de sequências de 
RNA em vez de DNA. Como o RNA não pode ser transferido para uma membrana de nitrocelulose, 
na técnica de Northern blotting utiliza-se um papel quimicamente preparado 
(aminobenziloximetil-celulose ou papel ABM), permitindo a transferência do RNA. 
A técnica permite observar o padrão de expressão de um determinado gene em diversos tecidos 
ou a expressão de genes em células tumorais. 
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A técnica de western blotting utiliza a transferência 
de proteínas que foram separadas em um gel de 
poliacrilamida para uma membrana de 
nitrocelulose ou nylon, na qual elas se ligam 
fortemente. Para detecção, utilizam-se anticorpos 
específicos que podem ser marcados 
radioativamente, ou com outro tipo de marcação. 
Western Blotting 
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Western Blotting 
O western blotting possui uma grande variedade de aplicações, como o teste confirmatório de 
HIV, em que ele é utilizado na detecção de anticorpos contra o vírus no soro de pacientes. Assim 
como testes definitivos para outras doenças, como a doença de Lyme, (doença bacteriana 
transmitida por carrapatos infectados), nos testes de mal da vaca louca (encefalite 
espongiforme bovina), em testes de confirmação de Hepatite B, e vários outros testes. 
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Transformação de E. coli 
É uma técnica usada para a amplificação de 
fragmentos de DNA, através da introdução de um 
plasmídeo com um inserto (gene) em uma célula 
bacteriana das linhagens de E. coli. À medida que 
a bactéria prolifera na cultura, os plasmídeos com 
insertos são replicados. O plasmídeo é passado 
para o interior da bactéria por choque térmico ou 
eletroporação. 
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Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
É uma técnica de amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA) a partir da extração do DNA a 
ser estudado e do uso de uma mistura que contém nucleotídeos (dNTPs – 
desoxirribonucleotídeos); primers (oligonucleotídeos ou iniciadores) que limitam o segmento do 
DNA que será amplificado, e a enzima Taq-polimerase, em solução tampão. Os nucleotídeos são 
usados na formação de novas cópias do segmento delimitado pelos primers. A enzima fará a 
extensão das cópias adicionando os nucleotídeos. 
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Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
A mistura é colocada no termociclador. 
Inicialmente a temperatura é elevada a 96oC para 
que haja separação da dupla cadeia de DNA. Em 
seguida, a temperatura é reduzida para 50oC a 
60oC permitindo o anelamento dos primers na fita 
molde de DNA. Por último, a temperatura é 
elevada a 72oC para a enzima Taq-polimerase 
sintetizar a nova molécula e então um novo ciclo 
ser iniciado. 
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Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
A técnica dePCR pode ser utilizada no 
diagnóstico de uma grande variedade de 
doenças, entre elas leucemia e linfomas, uma 
vez que essas doenças são decorrentes de 
modificações da estrutura do DNA. A técnica 
pode ser Utilizada na detecção e identificação 
de infecções bacterianas e virais. 
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Transcrição reversa PCR (RT-PCR) 
RT-PCR (do inglês reverse transcription-PCR) é utilizada quando se deseja verificar a expressão 
gênica, pois é a partir do RNAm que os ribossomos irão produzir as proteínas. 
Dessa forma, se um determinado conjunto de proteínas está presente em uma célula, haverá um 
conjunto de mRNA correspondente a estas proteínas. 
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Transcrição reversa PCR (RT-PCR) 
Como a amplificação se dá a partir de um RNA de 
fita simples, ao invés do DNA como na PCR comum, 
deve-se usar uma enzima que converta o RNA em 
DNA. Esta enzima é a transcriptase reversa, que 
sintetiza uma fita simples de DNA complementar 
ao mRNA, chamada de cDNA, que, então, pode ser 
submetida à PCR. 
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Transcrição reversa PCR (RT-PCR) 
Após amplificação de um segmento específico por PCR, é possível detectar a quantidade desse 
produto e estabelecer uma relação com a expressão gênica adequada. 
A técnica de RT-PCR pode ser utilizada no diagnóstico de doenças genéticas, como a síndrome de 
Lesch-Nyhan . Outra aplicação é na detecção de canceres, em que a análise de expressão de 
determinados mRNA funcionam como importantes marcadores tumorais. 
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Real time RT-PCR 
É uma técnica usada quando é importante quantificar o mRNA, como forma de avaliar a 
disponibilidade de mRNA para a produção de proteínas. Isso é feito com base na quantidade de 
ciclos de amplificação necessários para se obter um número de moléculas suficiente para ser 
detectado pelo aparelho a partir de uma quantidade inicial de mRNA. 
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Real time RT-PCR 
Esta técnica utiliza uma mistura de corantes que 
marcam fragmentos de DNA (sondas). Estas sondas 
fluorescem quando são aneladas à sequências alvo. 
O nível de fluorescência aumenta conforme o 
número de ciclos na PCR, e torna-se possível 
determinar o número de ciclos necessários para a 
formação de uma quantidade de produto detectável, 
chamado de valor Ct. 
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Real time RT-PCR 
Este valor, chamado de Ct, é relacionado posteriormente com a quantidade inicial da sequência-
alvo ou da quantidade inicial de RNAm. Esta técnica pode ser utilizada na detecção rápida de 
doenças infecciosas, de cânceres e anormalidades genéticas. Ela pode ser uma ferramenta muito 
importante na quantificação e determinação da linhagem, de vírus durante a infecção do vírus da 
Hepatite B, por exemplo. 
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Clonagem e bibliotecas de DNA 
Como já visto, a clonagem envolve a inserção de uma sequência de DNA que se deseja clonar em 
um vetor (plasmídeo). Em bactérias, os plasmídeos são replicados a medida que ocorre a divisão 
celular. A E. coli, divide-se a cada 20 minutos. Assim, após 30 gerações (10 horas), serão obtidos um 
milhão de descendentes ou células, cada qual terá uma cópia do segmento de DNA desejado. A 
clonagem possibilita análises da expressão do gene e de mutações. Também é possível 
possibilidade de obter produtos gênicos, através da clonagem de genes que codificam vitaminas, 
hormônios e antibióticos. 
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Clonagem e bibliotecas de DNA 
Não necessariamente é preciso limitar a clonagem a um pequeno segmento do DNA de um 
organismo. Todo o seu genoma pode ser clonado, basta ligar cada inserto em um plasmídeo e 
introduzi-lo na bactéria. Após divisão celular, a biblioteca estará montada com milhares de clones 
para cada fragmento do genoma, podendo ser guardados para o isolamento futuro de vários 
genes. Uma coleção de clones de DNA pode ser chamada de biblioteca de DNA. 
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Sequenciamento de DNA 
O sequenciamento de DNA corresponde à determinação da ordem dos nucleotídeos adenina (A), 
guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA. A técnica consiste basicamente na PCR, 
utilizando-se iniciadores (primers), que pareiam com sequências complementares, no entanto, 
adiciona-se nucleotídeos terminadores de cadeia. Por não possuírem OH nos carbonos 2’ e 
3’(didesoxi), estes não possibilitam a inserção do próximo nucleotídeo, bloqueando a 
polimerização. Logo, a síntese é bloqueada em uma determinada base conhecida. A amostra, 
então, é dividida em quatro reações. 
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Sequenciamento de DNA 
Em cada amostra há apenas um tipo de nucleotídeo 
terminador junto com os quatro nucleotídeos normais. 
Em seguida, os fragmentos são submetidos à 
eletroforese produzindo um padrão no gel que revela a 
sequência do DNA. Após surgimento do sequenciador 
automático, a determinação das sequências de DNA 
tornou-se rápida, permitindo a montagem de numerosas 
sequências. 
Assuntos da próxima aula: 
1. Padrão de herança monogênico; 
2. Heredograma e Herança autossômica 
e ligada ao cromossomo X; 
3. Padrões de herança autossômica 
recessiva; 
4. Padrões de herança autossômica 
dominante; 
5. Herança ligada ao 
cromossomo X.