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Procedimentos iniciais em 
microbiologia clínica 
Colorações em microbiologia e 
semeaduras de amostras clínicas 
Quais os objetivos do laboratório de 
microbiologia clinica 
• Realizar exames diagnósticos para:
– Isolar e identificar os microrganismos 
– Auxiliar a conduta terapêutica com métodos de 
sensibilidade 
– Produzir informações epidemiológicas com vista 
ao conhecimento e controle das doenças 
infecciosas 
Quais os procedimentos realizados  no 
laboratório de microbiologia clínica 
• Fases
– Pré‐analítica 
• Coleta 
• Transporte 
– Analítica (EXAME DIRETO e CULTURA)
• Recebimento das amostras 
• Semeadura primária das amostras (técnicas)
• Temperatura de incubação 
• Atmosfera de incubação 
• Tempo de incubação 
– Pós analítica 
• Emissão do laudo 
• Armazenamento dos microrganismos isolados 
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Rotas para o diagnóstico das doenças 
infecciosas
Rota
imunológica
Rota 
microbiológica
Rota 
molecular
Paciente
(infecção 
suspeita)
Rota imunológica 
Amostra de
sangue ou de 
outra fonte (urina, secreções etc)
Pesquisa 
de antígeno
Pesquisa de 
anticorpos
ELISA, RIA, IB, CIE, 
Aglutinação, outras
Rota molecular  
Amostra de
sangue ou de 
outra fonte (urina, secreções etc)
Amostras clínicas diretamente Em isolados clínicos (identificação)
Pesquisa de elementos alvo do 
genoma do microrganismo 
Hibridização e/ou PCR
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Rota microbiológica 
Amostras biológicas 
Exame direto Cultura
A fresco 
Direto Campo escuro 
Colorações 
Observação de microrganismos
Aumento da 
Imagem
(Microscópio) Cultivo - Aumento do 
número de indivíduos
(olho nu)
Exame direto
• Microscopia 
– Método comum usado para a detecção direta de microrganismos em 
amostras clínicas 
– Pesquisa de células inflamatórias  relação quantidade/processo inflamatório.
• Comprovação da qualidade da amostra.
• Observação inicial de bactérias, leveduras, estruturas parasitárias ou inclusões virais 
– diagnóstico presuntivo
» tratamento precoce.
• Coloração de Gram 
• Coloração de Albert – Laybourn
• Coloração de Fontana de Tribondeau 
• Coloração de Ziehl-Neelsen 
• Exame à fresco 
• Exame em campo escuro 
• Exame com Tinta da China 
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Observação ao microscópio 
Critérios
• Tamanho
• Forma
• Arranjo
• Coloração
Tamanho
Bactérias varia entre 0,5 e 5 m
Unidade de medida: 
micrômetro (m)
1000 nm = 
1 m =
10-3 mm = 
10-6 m
Tamanho
Não é uniforme no 
entre as bactérias
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Observação ao Microscópio Óptico
Com objetiva de maior aumento: 
(Objetiva de Imersão)
Forma
Arranjo
Dependente do número de planos de divisão:
Um plano
Dois planos
Três planos
Vários planos
estrepto
tétrade
sarcina
estáfilo
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Coloração
algas 
Fixação para Coloração
Coloração de Gram 
• 1884, Hans Cristian Gram,
descobriu que as bactérias
podiam ser divididas em dois
grandes grupos, partindo da
capacidade que têm as células
coradas de resistirem ou não a
uma descoloração pelo álcool.
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Coloração de Gram 
• Classificar a bactéria 
– Base morfológica 
– Base tintorial
• Diagnóstico rápido e presuntivo
• Qualidade da amostra 
Coloração de Gram 
• Gram positivas ou Gram negativas
– Diferenças de composição da parede celular 
Parede celularParede celular
Principal constituinte é o 
peptidoglicano (mureína)
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Organização (montagem) 
do peptidoglicano:
Em Gram 
Negativo
Em Gram 
Positivo
Outros elementos
• Proteínas integrais (porinas)
• Ácido teicóico (em Gram +)
• Ácido micólico (em BAAR)
• Açúcares e glicolipídeos 
complexos (em BAAR) 
• Lipopolissacarídeo (em Gram -)
Parede 
celular
Parede 
celular
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BAAR
Parede celular
BAARGram -Gram +Característica
AusentePresenteAusenteMemb. externa
AusentePresenteAusenteEsp. periplásmico
Rígida/flexívelRígida/flex.RígidaEstrutura celular
N. digerívelEsferoplastoprotoplastoForma S/ peptidogl.
AusenteAusentePresenteÁc. teicóico
Ácido MicólicoLPSMuito poucoLipídeos
Muito poucoFinoEspessoPeptidoglicano
Menos 
sensível
+/- sensívelMais 
sensível
Sensib. a corantes 
e antibióticos
Coloração de Gram
EM TODOS OS PREPARADOS 
DEIXAR SECAR À TEMPERATURA 
AMBIENTE 
FIXAR EM CALOR BRANDO 
(45 a 60ºC) em chapa aquecedora
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Coloração de Gram
Avalia as diferenças na permeabilidade das membranas da célula bacteriana 
aos reagentes quimicos,
Primeiro - corante básico 
Cristal de Violeta 
Segundo - Mordente 
Iodo 
• aumenta a finidade da célula pelo corante primário
Terceiro - Agente descolorante 
Álcool e/ou Acetona
• remove o corante porque remove a membrana externa 
Quarto – corante básico 
Safranina ou Fucsina
Coloração de Gram
1 min
Lavar com água corrente 
retirando o excesso de corante
Lavar com água corrente
Álcool acetona ou álcool 
95% até que não escorra 
mais corante cristal de 
violeta 
30 s.
Safranina ou fucsina 
diluída 1/10 
Lavar com água corrente e 
secar ao ar ou em papel - filtro
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Coloração de Gram
• Modificada por Hucker, 1999
• Cristal  de violeta – 30 segundos
• Lugol – 30 segundos
• Contra corar com safranina ou fucsina básica 
0,1 a 0,2 %
Coloração de Gram
• Como reportar o resultado 
– Avaliar a amostra com objetiva de 10 X
– Analisar várias áreas do esfregaço e relatar a 
presença ou ausência de microrganismos, 
quantificando‐os e classificando‐os 
Coloração de Gram
• Como reportar o resultado 
– Cocos gram positivos aos pares 
– Cocos gram positivos em cadeias
– Cocos gram positivos agrupados em cachos 
– Bacilos gram positivos 
– Bacilos gram positivos ramificados 
– Bacilos gram positivos corineiformes ou difteroides
– Bacilos gram positivos tipo döderlein
– Diplococos gram negativos 
– Bacilos gram negativos 
– Cocobacilos gram variáveis
– Leveduras e/ou leveduras em filamentação 
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Coloração de Gram
Classificação numérica  Classificação descritiva  Número de bactérias 
observadas com aumento 
de 1000 X
0 Ausentes  0
1+ Raros  < 10 em todos os campos 
observados
2+ Alguns, poucos ou 
moderados 
10 a 30 em todos os 
campos observados 
3+ Muitos ou frequentes  > em um campo observado
Coloração de Gram 
• Amostras genitais – classificação de Nugent,  1991 
(simplificada)
Grau 1 – padrão normal Predomínio de lactobacilos e poucos
outros morfotipos bacterianos
identificáveis (Gardnerella vaginalis,
anaeróbios, microbiota Gram negativa,
cocos Gram positivos)
Grau 2 – padrão intermediário Redução de lactobacilos e aumento
de outros morfotipos
Grau 3 – vaginose bacteriana Ausência de lactobacilos e grande
aumento no número dos outros morfotipos 
Coloração de Gram
• Relatar a celularidade quando necessário 
– Amostras normalmente estéreis 
– Amostras de trato respiratório inferior
– Amostras de trato genital 
• Agregar valor ao exame microscópico
• Resultado negativo em bacterioscopia não 
significa ausência de microrganismos
– Sensibilidade da coloração 104 UFC/mL 
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Classificação dos achados no Gram
Bacilo gram
negativo 
Bacilos Cocobacilos Cocos 
retos
Enterobactérias e NF
Curvos 
Campylobacter
Helicobacter 
Vibrio
Exrtremidades 
afiladas 
Fusobacterium
Capnocytophaga
Haemophilus
Bordetella
Brucella
Bacterioides
Neissoeria
Moraxella
Veillonella
Acinetobacter
Classificação dos achados no Gram
Bacilo gram
positivos ou
gram variáveis 
Bacilos Cocobacilos Cocos 
retos
Lactobacillus
Erisipelothrix
Curtos 
Listeria
Esporulados 
Bacillus 
Clostridium 
Gardnerella 
(gram-variável)Neissoeria
Moraxella
Veillonella
Acinetobacter
Curvos
Mobiluncus
(gram-variável
Ramificados
Nocardia
Actinomyces
Streptomyces
Aos pares e
em cadeia
S. pneumonias
Enterococcus
Streptococcus
Cocos anaeróbios
Agrupados 
em cachos 
tétrade
Staphylococcus
Micrococcus
Streptococcus
Aerococccus
Cocos anaeróbios
Coloração de Ziehl‐Neelsen
• Coloração de BAAR
• Utilizada basicamente para micobactérias
• Parede constituída de ácidos micólicos
– Resistentes à descoloração por solução á álcool‐
ácido
• Usada para o diagnóstico inicial e eficácia 
terapêutica em pacientes com tuberculose 
pulmonar e na pesquisa de bacilo de Hansen
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Coloração de Ziehl‐Neelsen
• Histórico 
– Desenvolvida por Paul Ehrlich (1882) para a bactéria Mycobacterium 
tuberculosis. A maioria das bactérias são descoradas pelo alcool-ácido 
e as bactérias das familias Mycobacteriaceae, Nocardiaceae e 
Actinomycetales são ácido-resistentes. 
– A coloração ácido-resistente é também uma coloração diferencial que 
mede a resistência das células coradas à descoloração por ácidos. 
Esta propriedade está relacionada com o conteúdo lipídico das células.
– as paredes celulares dos microrganismos ácido-resistentes contêm 
ácido micólico que torna a parede celular impermeável à maioria dos 
corantes.
– Neste tipo de coloração as células são coradas com carbol-fucsina 
quente, descoradas com solução de álcool-ácido, e coradas com um 
segundo corante como exemplo o azul de metileno. As bactérias ácido 
resistentes retém a coloração do primeiro corante.
Coloração de Ziehl‐Neelsen
1. Fixar o esfregaço com calor 
2. Cobrir com Fucsina de Ziehl-Neelsen
2. Aquece a parte inferior da lâmina com 
chama de bico de Bunsen até a emissão de 
vapores e deixar em contato por 5 minutos
Fucsina penetra pelos poros dilatados da membrana 
bacteriana, ficando estas vermelhas
3. Lavar com água corrente
4. Cobrir o esfregaço com uma mistura de 
álcool + ácido por 1 minutos
5. Lavar com água corrente
As bactérias permanecem coradas, pois são resistententes
6. Cobrir o esfregaço com o corante de 
fundo (azul de metileno) e deixar em contato 
por 2 minutos
7. Lavar com água corrente
Leitura e  interpretação 
• Observar 100 campos microscópicos, no 
mínimo
• Priorizar aqueles com maior quantidade de leucócitos e 
células ciliadas
– Realizar leitura horizontal e mtoda a extensão do 
esfregaço
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Leitura e  interpretação 
• Em esfregaços negativos ou com menos de um 
bacilo observar até 300 campos
• Em esfregaços com 1 a 10 bacilos por campo 
observar 50 campos 
• Em esfregaços com mais de 10 bacilos por 
campo observar apenas 20 campos
• Amostras extrapulomonares são consideradas 
positivas em qualquer quantidade de bacilos
Guia para liberação de resultados em 
amostra de escarro
Coloração de Ziehl‐Neelsen 
(objetiva de 100 X)
Resultados 
0 Não foram observados bacilos álcool‐acido resistentes em 100 campos 
observados 
1 a 9 bacilos por 100 campos  Relatar a quantidade de bacilos observados 
10 a 99 bacilos por 100 campos  Positivo (+)
Média de 1 a 10 bacilos nos 50 
primeiros campos observados 
Positivo (++)
> 10 bacilos por campo, nos 
primeiros 20 campos observados 
Positivo (+++)
Guia para liberação de resultados em 
outras amostras 
Coloração de Ziehl‐Neelsen 
(objetiva de 100 X)
Resultados 
Ausência de bacilos  Negativo (Não foram observados bacilos álcool‐acido resistentes na 
amostra analisada)
Presença de bacilos em qualquer 
quantidade 
Positivo (Presença de bacilos álcool‐acido resistentes na amostra 
analisada)
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Guia para liberação de resultados em 
pesquisa de bacilos de Hansen 
Coloração de Ziehl‐Neelsen 
(objetiva de 100 X)
Resultados 
Ausência de bacilos em 100 campos 
examinados 
Índice baciloscópico  0
Presença de 1 a  10 bacilos em 100  campos 
examinados
1+
Presença de 1 a  10 bacilos em 10  campos 
examinados
2+
Presença de 1 a  10 bacilos em  média em cada 
campo examinado
3+
Presença de 10  a  100 bacilos em  média em 
cada campo examinado
4+
Presença de 100 a  1000 bacilos em  média em 
cada campo examinado
5+
Presença de mais de  1000 bacilos em  média 
em cada campo examinado
6+
Índice baciloscópico
• Média aritmética do número de cruzes por 
lâminas observadas 
– Deve ser relatado no laudo 
• Exemplo 
– Linfa de lóbulo de orelha esquerda = 2+
– Linfa de lóbulo de orelha direita = 3+ 
– Linfa de cotovelo direito =3 + 
– Linfa de cotovelo esquerdo = 2+
• Índice baciloscópico de 2,5
Coloração de Ziehl‐Neelsen
• Examinar a amostra com objetiva de 10 X a 
fim de selecionar as  áreas mais ricas em 
macrófagos e evitar aquelas com hemácias
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Coloração de Albert‐Laybourn
• Método de coloração diferencial  
recomendado para a pesquisa de granulações 
metacromáticas dealgumas espécies de 
Corynebacterium (C. diphtheriae)
– Granulações coram‐se em azul 
– Corpo da bactéria cora‐se em verde
• Diagnóstico presuntivo
Coloração de Albert‐Laybourn
• Amostras de secreção de orofaringe e 
nasofaringe
• Preparar o  esfregaço imediatamente após a 
coleta 
Coloração de Albert‐Laybourn
• Secar o esfregaço ao ar e fixar no calor 
• Cobrir o esfregaço com  a solução de Albert –
Laybourn e deixar por 5 minutos 
• Lavar a lâmina em água corrente
• Cobrir a lâmina com o lugol (duplamente 
concentrado) e deixar por 1 minuto 
• Secar ao ar 
• Ler em objetiva de imersão  (100 x)   
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Coloração de Albert‐Laybourn
• Resultados 
– Presença de bacilos com granulações 
metacromáticas sugestivos de Corynebacterium
spp
– Não foram vistos bacilos com granulações 
metacromáticas sugestivos de Corynebacterium
spp
Presença de inclusões de polifosfato (granulações metacromáticas) e 
aspecto de letras chinesas (1000X, coloração de Albert Laybourn)
http://www.textbookofbacteriology.net/diphtheria.html
Coloração de Fontana de Tribondeau
• Tem como objetivo a pesquisa de 
espiroquetídeos em material de lesão genital 
masculina  e feminina  ou raramente em 
outras áreas (mucosa oral, anal etc)
– Bactérias que se impregnam pela prata
• Nitrato de prata 
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Coloração de Fontana de Tribondeau
• Coleta da amostra 
– Realizar esfregaço também pra gram  e permitir a pesquisa 
de outros agentes de DST
• Limpar a lesão com gaze estéril 
• Escarificar a lesão com alça bacteriológica ou irritá‐la com éter 
• Adicionar uma gota de solução fisiológica estéril sobre a lesão e 
aguardar por um minuto
• Com alça bacteriológica estéril retirar o material seroso da 
profundidade da lesão e depositar em pontos (2 a 3) da lâmina.
• Secar ao ar e enviar ao laboratório  
Coloração de Fontana de Tribondeau
Presença de espiroquetas sugestivos de Treponema (1000X, coloração 
de Fontana de Tribondeau
Microscopia de campo escuro 
• Utilizada para a visualização de 
espiroquetídeos em diferentes amostras 
– Microscópio com condensador de campo escuro 
• Realizar a coleta com os mesmos cuidados 
– Depositar o material seroso na lâmina 
– Cobrir com uma lamínula 
– Vedar com parafina  ou esmalte
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Microscopia óptica comum Microscopia em campo escuro
Presença de espiroquetas em campo escuro (400X)
Exame  à fresco de amostras clínicas 
• Genital 
– Visualização de Trichomonas spp e leveduras 
• Pode ser realizado com outras amostras 
– Mucosa oral 
– Urina 
– Esfregaços de lesões 
– Pesquisa de fungos ou outros parasitas 
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Exame  à fresco de amostras clínicas 
• Recolher o material e depositar sobre uma 
lâmina de microscopia
• Cobrir com uma lamínula
• Observar em microscopia direta com aumento 
de 400 X  
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• Exame microscópico direto de cápsulas bacterianas.
• Ampla utilização na pesquisa de Cryptococcus neoformans levedura 
associada a meningite em pacientes imunocomprometidos.
• Impregnação do fundo da lâmina com grânulos de tinta  evidenciação 
do microrganismo.
COLORAÇÃO COM TINTA DA 
CHINA (NANQUIM)
Cultivo de amostras clínicas 
• Seleção dos meios de culturas
• Tipos de semeaduras 
• Atmosfera 
• Temperatura de incubação 
• Tempo de incubação 
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Cultivo de amostras clínicas
• Meios de cultura 
– Tipos 
• Quanto à característica física 
– Sólido, semi‐sólido e líquido 
• Quanto à composição química 
– Simples e complexo 
• Quando à função 
– Seletivo, diferencial, de transporte e de identificação
Cultivo de amostras clínicas 
• Examinar o meio de cultura quanto à:
– aparência 
– validade 
– ausência de contaminação 
• Identificar o meio a ser usado com os dados 
do paciente e da amostra clínica 
• Não ocultar as informações sobre o meio de 
cultura 
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Cultivo de amostras clínicas
• A semeadura primária é uma das etapas mais 
importante na rotina microbiológica 
– Técnicas de semeadura 
• Semeadura quantitativa com alça calibrada 
• Semadura por esgotamento 
– Usada para semiquantificação 
Técnica de semeadura quantitativa e 
técnica de esgotamento 
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Cultivo de amostras clínicas  
– Inocular primeiro meios menos seletivos
(exemplo)
Escarro
Ágar chocolate
Ágar sangue
Ágar MacConkey
Caldos
Cultivo de amostras clínicas  
• Atmosfera e temperatura de incubação  
Temperatura (± 2°C) Atmosfera  Finalidade 
35°C Ar ambiente  Crescimento da maioria dos 
microrganismos 
35°C 5 a 10 % de CO2 Idem, incluindo os fastidiosos ( 
S. pneumoniae, H. influnezae, 
N, meningitidis)
42°C Ar ambiente (se necessário 
microaerofilia colocar em 
gerador específico  que produz 
5 a 15 % de O2 e 10 % de CO2
Campylobacter spp 
30°C Ar ambiente  Fungos 
37°C Ar ambiente  Micobactérias 
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Incubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobiose
Análise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimento
Culturas puras
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Análise microscópicaAnálise microscópica
Coloração de GramColoração de Gram
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Coloração de Ziehl‐NielsenColoração de Ziehl‐Nielsen
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Outras técnicas de coloraçãoOutras técnicas de coloração
Cápsula
Imagem ao microscópio óptico comum