Portfólio de imunologia

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

BIOMEDICINA
JOSEANE DA SILVA RIBEIRO
MÉTODOS SOROLÓGICOS
FEIRA DE SANTANA
2018
JOSEANE DA SILVA RIBEIRO
MÉTODOS SOROLÓGICOS
Trabalho apresentado à disciplina de Imunologia Clínica, do curso de graduação em Biomedicina da Faculdade de Tecnologia e Ciências – FTC. Orientado pela professora: Débora Rocha. 
FEIRA DE SANTANA
2018
SUMÁRIO
1. Introdução...............................................................................................................	5
2. Precipitação............................................................................................................	6
2.1 Imunodifusão..............................................................................................	6
2.2 Imunodifusão Radial...................................................................................	6
2.3 Imunodifusão Dupla....................................................................................	6
2.4 Imunoeletroforese.......................................................................................	7
2.4.1 Eletroforese em Gel......................................................................	7
3. Reação de Aglutinação............................................................................................	8
3.1 Aglutinação Direta........................................................................................	9
3.1.1 Tipagem Sanguínea ABO..............................................................	9
3.1.2 Determinação de Fator Rh/DU Fraco............................................. 10
3.1.3 Determinação de Formas Fracas do Antígeno D (DU)................... 12
3.2 Inibição da Aglutinação................................................................................ 12
3.2.1 Beta-HCG LÁTEX........................................................................... 12
3.3 Aglutinação Indireta..................................................................................... 13
3.3.1 LÁTEX........................................................................................... 14
3.3.2 Proteína C Reativa (PCR).............................................................. 15
3.3.3 Antiestreptolisina O (ASLO).......................................................... 17
3.3.4 Coombs Direto.............................................................................. 18
3.3.5 Coombs Indireto............................................................................ 19
3.4 Hemaglutinação Passiva............................................................................ 20
3.4.1 Teste de Chagas........................................................................... 21
3.5 Testes de Floculação.................................................................................. 22
3.5.1 VDRL............................................................................................. 23
4. Imunoensaios Enzimáticos..................................................................................... 24
4.1 Elisa........................................................................................................... 24
4.2 Imunofluorescência ................................................................................... 25
4.2.1 Imunofluorescência Direta............................................................ 26
4.2.2 Imunofluorescência Indireta.......................................................... 26
4.2.3 Fta-ABS......................................................................................... 27
4.2.4 FAN – Fator Antinuclear……........…………………………….…... 29
4.3 Cintometria de Fluxo………...............…….....………………………….…… 33
4.4 Radioimunoensaio (RIA – Radio Imuno Assay)........................................ 34
4.5 Western Blotting......................................................................................... 35
4.5.1 HIV – Westren Blotting…………………………………….……..…. 35
5. Sorologias…………………………………………………………………………………. 38
5.1 Hepatites…………………………………………………………………………. 38
5.1.1 Hepatite “A”………………….……………………………………...…. 39
5.1.2 Anti-HVA IgM.................................................................................. 39
5.1.3 Anti-HVA IgG.................................................................................. 39
5.1.4 Hepatite “B”.................................................................................... 39
5.1.5 HBsAg (Antígeno de Superfície do HBV)........................................ 39
5.1.6 Anti-HBc (Anticorpos IgG contra Antígeno do Núcleo do HBV)...... 41
5.1.7 Anti-HBc IgM.................................................................................. 41
5.1.8 Anti-HBs (Anticorpos contra antígeno de superfície do HBV)......... 42
5.1.9 Teste Anti-HBs................................................................................ 42
5.1.10 HBeAg (Antígeno “e” do HBV)...................................................... 44
5.1.11 Anti-HBe (Anticorpos contra o antígeno “e” do HBV).................... 44
5.1.12 Hepatite “C”.................................................................................. 44
5.1.13 Anti-HCV ( Anticorpos contra o vírus HCV)................................... 44
5.1.14 HCV-RNA (RNA do HCV)............................................................. 45
5.2 Alergias........................................................................................................ 45
5.2.1 Teste PRICK ou de Puntura............................................................ 45 
5.2.2 Teste de Contato............................................................................ 45
5.2.3 Teste Intradérmico......................................................................... 46
5.2.4 Exame de Sangue.......................................................................... 46
6. Imunocromatografia.................................................................................................. 46
6.1 HCV.............................................................................................................. 47
6.2 Sífilis............................................................................................................. 48
6.3 HIV 3ª Geração............................................................................................ 49
6.4 HCG............................................................................................................. 51
1 INTRODUÇÃO
A imunologia Clínica é um ramo da Análises Clínicas que investiga as doenças infecciosas, bem como a confirmação de patologias, mostrando possíveis mudanças no organismo do paciente.
Será abordado neste portfólio os exames imunológicos como por exemplo a dosagem de FR-Látex, PCR, VDRL, BHCG, ASO, HIV, entre outros. 
O tratamento das doenças começa no laboratório de Análises Clínicas, pois, é lá que são realizados os exames e através dos resultados o clínico é orientado, guiado no diagnóstico das possíveis patogenicidades. O clínico ao analisar os resultados, identifica a causa da doença e traça estratégias para o melhor controle ou eliminação dos diferentes patógenos, associando a atividade imunológica a uma provável patologia.
Sabendo que nenhum diagnóstico é confirmado baseado em resultados isolados, simultaneamente aos testes descritos anteriormente, existe uma gama de exames complementares e confirmatórios para cada patologias, dentre diversas outras que envolvem a resposta imunológica frente a uma homeostase. Os quais podem ser realizados no laboratório de Imunologia Clínica em conjunto com outros setores do laboratório.    
2 PRECIPITAÇÃO
A quantidade de precipitado formado quando se adiciona antígeno a uma concentração constante de anticorpo é caracterizada por uma curva parabólica, descrita por Heidelberger e Kendall em 1935. Essa quantidade
de precipitado depende de vários fatores físico-químicos e imunológicos, mas principalmente das concentrações relativas do antígeno e do anticorpo. Quando as quantidades do antígeno e do anticorpo são equivalentes, a precipitação é máxima, decresce quando há excesso de antígeno ou anticorpo. Precipitados já formados podem se dissolver quando expostos a excesso de um dos reagentes, devido à reversibilidade da ligação antígeno-anticorpo. O fenômeno ocorre quando há excesso de anticorpo e pode causar erros na interpretação dos resultados, tornando necessário realizar a titulação do anticorpo com quantidades fixas de antígeno para evitar tais erros. Podem precipitar na presença de anticorpos específicos, além de proteínas, carboidratos e complexos glicolipídicos.
2.1 Imunodifusão: 
Difusão de uma substância solúvel em um meio fluido. As técnicas de imunodifusão detectam a reação Ag-Ac por intermédio da formação de um precipitado.
2.2 Imunodifusão radial: Dosagem de Ag ou Ac – HALO DE PRECIPITAÇÃO.
Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
2.3 Imunodifusão dupla: Detecção de Ac – BARREIRA IMUNOESPECÍFICA.
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: 
Pode ser visualizada pós lavagem do gel, para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante.
2.4 IMUNOELETROFORESE: Avaliação de Ig – ELETROFORESE EM GEL (separação dos componentes) + IMUNODIFUSÃO (arco de precipitação).
Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. 
 As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. 
 Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação.
2.4.1 Eletroforese em gel
A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras. 
Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o quão grandes eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos. 
Visualização dos fragmentos de DNA
Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda. Cada banda contém muitos fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de DNA) não seria visível por si só em um gel.
Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos determinar os tamanhos aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel acima tem, aproximadamente, o tamanho de 700 pares de bases (bp).
3 REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO 
A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultados da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície.
A aglutinação específica faz parte de um processo dinâmico que ocorre em dois estágios. O primeiro estágio começa logo após a mistura das partículas recobertas pelo antígeno com os anticorpos e consiste na ligação das moléculas do anticorpo aos antígenos de superfície, por meio de ligações não covalentes, de acordo com a lei de ação das massas. O segundo estagio começa enquanto o primeiro continua e resulta das colisões que ocorrem entre as partículas, de modo que os anticorpos ligados a uma partícula se ligam a determinados antigênicos de outra; esses anticorpos estabelecem pontes entre partículas que, após vários entrelaçamentos, formam agregados visíveis a olho nu. Ambos os estágios começam praticamente ao mesmo tempo, porem a ligação do antígeno com o anticorpo se processa em poucos segundos, enquanto a formação de agregados demora muito mais tempo.
A aglutinação pode ocorrer tanto com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários etc.) quanto com partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita etc.), ou mesmo com células antigenicamente não relacionadas (hemácias, bactérias), às quais se adsorvem ou se fixam antígenos solúveis. No primeiro caso, a reação é dita aglutinação direta, e, no segundo, aglutinação indireta ou passiva.
Comparadas com a precipitação, as técnicas de aglutinação, embora semiquantitativas, são mais sensíveis e necessitam de uma quantidade de anticorpos 500 vezes menor, pois as partículas amplificam a reação.
As reações de aglutinação são empregadas para o diagnostico laboratorial de doenças autoimunes, doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos etc.
Os testes de aglutinação podem ser realizados em tubos ou placas. Se o soro apresentar elevado título de anticorpos aglutinantes, pode-se observar o fenômeno de prozona, obtendo-se falsos resultados negativos. Esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro.
3.1 Aglutinação direta: 
Ac + Ag = Complexo precipitado. Testes feitos em diluições crescentes, com antígenos na mesma concentração, onde os resultados são expressos em título anti-soro - a máxima diluição onde ocorre a reação.
Ex.: Tipagem sanguínea, Toxoplasmose, Salmoneloses, Tripanossomíase.
3.1.1 Tipagem sanguínea ABO
PRINCÍPIO
Consiste na determinação do grupo sanguíneo do sistema ABO e do fator Rh pela pesquisa dos aglutinogênios globulares, usando soro com anticorpos monoclonais.
TÉCNICA
Determinação ABO:
1º Passo: Em um tubo de ensaio preparar uma solução a 5% das hemácias a serem testadas (1.9 mL de solução salina a 0,9% + 100µL de sangue total);
2º Passo: Adicionar uma gota de reagente ANTI-A, ANTI-B a dois tubos identificados (Nº de OS + iniciais do paciente);
3º Passo: Adicionar uma gota da suspensão de hemácias, misturar bem o conteúdo;
4º Passo: Centrifugar por 1 minuto a 1000 RPMs;
5º Passo: Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e examinar a presença ou não de aglutinação;
6º Passo: Observar e anotar os resultados no caderno de registro e na ficha do paciente (OS).
INTERPRETAÇÃO 
Positivos: Excluindo limitações dos testes, a aglutinação dos glóbulos pelo reagente indica presença do antígeno correspondente. A aglutinação da amostra pelo reagente anti A, B indica a presença do antígeno A e ou B, caracterizando não se tratar do grupo O.
Negativos: Excluindo as limitações do teste, a ausência de aglutinação indica ausência do antígeno correspondente. 
3.1.2 Determinação fator Rh/du fraco
PRINCÍPIO
Consiste na determinação do grupo sanguíneo do sistema do fator Rh e DU fraco pela pesquisa dos aglutinogênios globulares, usando soro com anticorpos monoclonais. Destina-se a identificação de antígenos D(RHº) altamente imunógenos. Presença de antígenos anti D em um indivíduo pode acarretar em serias
reações hemolíticas e transfusionais.
TÉCNICA
1º Passo: Preparar suspensão das hemácias a serem testadas a 5% em solução fisiológica 0,9%. (diluição 1.9 mL de salina para 100 µL da amostra);
2º Passo: Colocar uma gota do soro anti-D em um tubo identificado (nº e iniciais do paciente);
3º Passo: Em um segundo tubo (controle) acrescentar adicionar uma gota de reagente controle Rh;
4º Passo: A cada tubo acrescentar uma gota de suspensão de hemácias e homogeneizar;
5º Passo: Centrifugar 1 minuto a 1.000 RPMs ou 15 segundos a 3.400 RPMs;
6º Passo: Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e observar presença ou não do botão de aglutinação.
INTERPRETAÇÃO
Teste com presença de aglutinação = Rh POSITIVO.
Se o teste for negativo ou duvidoso: 
7º Passo: Incubar os tubos em banho-maria 37º de 15 a 30 minutos;
8º Passo: Centrifugar por 1 minuto a 1.000 RPMs;
9º Passo: Repetir leitura;
Caso o teste permaneça NEGATIVO realizar a pesquisa de formas fracas do antígeno D.
3.1.3 Determinação de formas fracas do antígeno D (Du)
1º Passo: Lavar imediatamente as hemácias com resultado negativo ou duvidoso por três vezes em solução salina a 0.9%. Na última lavagem retirar completamente a solução salina, secar borda do tubo em papel absorvente;
2º Passo: Adicionar a cada tubo 01gota de reagente de Coombs (anti IgG), misturar bem;
3º Passo: Centrifugar os tubos 15 segundos a 3.400 RPMs;
4º Passo: Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e observar presença ou não de aglutinação.
INTERPRETAÇÃO
Teste com presença de aglutinação = Rh POSITIVO.
Teste com ausência de aglutinação = Rh NEGATIVO.
3.2 Inibição da aglutinação 
3.2.1 Beta-hcg látex
PRINCÍPIO 
Beta-HCG Látex é um teste qualitativo para detecção de gonadotrofina coriônica (hCG) na urina. O hCG presente na amostra de urina não diluída reage imunologicamente com anticorpos monoclonais anti-hCG presos às partículas de látex. A reação positiva é indicada através de aglutinação visível das partículas de látex na placa de reação utilizada. 
TÉCNICA
Pipetar 25 µL da urina do paciente em uma das áreas da placa de reação;
Em outras duas áreas da placa de reação, colocar uma gota do Controle Positivo e uma gota do Controle Negativo; 
Adicionar 25 µL do Látex HCG (bem homogeneizado) às áreas de reação, contendo a urina Teste, o Controle Positivo e o Controle Negativo;
Usando palitos distintos, misturar bem a urina com o látex; 
Inclinar a placa de reação, lenta e cuidadosamente, para frente e para trás, com movimentos oscilatórios em planos diferentes, por 2 minutos. Pode-se utilizar um mixer com uma rotação de 100 rpm por 2 minuto; 
Após os 2 minutos realizar a leitura dos resultados sobre uma luz artificial para verificar presença ou não de aglutinação macroscópica.
INTERPRETAÇÃO
Positivo: Aglutinação visível (nítida), indicando presença de hCG na amostra analisada em concentrações superiores a 200 mUI/mL (200 UI/L). 
Negativo: Ausência total de aglutinação, indicando presença de hCG na amostra analisada em concentrações inferiores a 200 mUI/mL (200 UI/L). 
Duvidoso: Aglutinação tênue do látex. Nos resultados duvidosos deve-se repetir o teste com nova amostra de urina, colhida 3 a 5 dias após a coleta anterior.
3.3 Aglutinação indireta:
 (Ag + Partícula Inerte) + Ac = Aglutinação Partículas inertes e hemácias podem ser sensibilizadas por adsorção passiva (contato direto com o antígeno solúvel), por adsorção via agente químico (ácido tânico e cloreto de cromo), por conjugação do Ag (ligações químicas covalentes).
3.3.1 Látex
PRINCÍPIO
É uma suspensão de partículas de látex adsorvidas com gamaglobulina humana em tampão 100mmol/L de Glicina, pH8,2. Com a adição de Reumatest ao soro com “Fator Reumatoide” presente, desenvolve-se uma reação antígeno anticorpo. Esta se exterioriza pela aglutinação das partículas de látex formando agregados facilmente visíveis.
TÉCNICA
Teste qualitativo: 
1. Utilizar soro não diluído. 
2.Os reagentes e amostras devem ser ambientados antes da realização do teste. A sensibilidade do reagente diminui em temperaturas baixas.
3.Adicionar ao primeiro círculo da lâmina 25µL de soro, ao segundo 25µL do controle positivo e ao terceiro 25µL do controle negativo. 
4.Homogeneizar o FR-Látex e adicionar 25µL do mesmo em cada círculo. 
5.Homogeneizar as duas gotas, com uma haste plástica. Utilizar uma haste para cada teste.
6.Imprimir movimentos rotatórios 80-100 r.p.m. à lâmina durante 2 minutos.
7.Fazer a leitura com a seguinte interpretação:
Teste positivo : nítida aglutinação 
Teste negativo: suspensão homogênea
INTERPRETAÇÃO
Soro com teores de Fatores Reumatoides superior a 8U.I./mL levam à aglutinação do látex, o que é evidenciado pela formação de grumos finos ou grosseiros.
Teste semiquantitativo: 
Rotular 6 tubos (12x75mm) de 1 a 6. Colocar, a partir do tubo 1, 200µL de solução fisiológica (salina). Transferir 200µL de soro para o tubo 1, homogeneizar, transferir para o tubo 2, e assim, sucessivamente, até o tubo 6. Teremos então as diluições que se seguem, com as respectivas equivalências:
Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	Diluição
	Soro não diluído 
	1:2
	1:4
	1:8
	1:16
	1:32
	1:64
	FR UI/mL
	8
	
	16
	32
	64
	128
	256
	512
Proceder ao teste como descrito para teste qualitativo. Será considerada positiva a maior diluição da amostra que apresentar aglutinação. Resultado: Expressar o resultado em U.I./mL.
RESULTADOS
Teste qualitativo: soro com teores de FR superior a 8U.I./mL provocam à aglutinação do látex, o que é evidenciado pela formação de grumos finos ou grosseiros.
Teste semiquantitativo: será considerada positiva a maior diluição da amostra que apresentar aglutinação.
3.3.2 Proteína C Reativa (PCR)
PRINCÍPIO
É uma suspensão de partículas de látex de poliestireno recobertas com anticorpos anti-Proteína C Reativa (PCR). Esta suspensão, em contato com amostras contendo Proteína C Reativa produz uma aglutinação das partículas de látex, visíveis macroscopicamente.
TÉCNICA
Teste qualitativo:
1.Os reagentes e amostras devem ser ambientados antes da realização do teste. A sensibilidade do reagente diminui em temperaturas baixas.
2.Adicionar ao primeiro círculo da lâmina 25µL de soro, ao segundo 25µL do controle positivo e ao terceiro 25µL do controle negativo.
3.Homogeneizar o PCR-Látex e adicionar 25µL do mesmo em cada círculo.
4.Homogeneizar as duas gotas, com uma haste plástica. Utilizar uma haste para cada teste.
5.Imprimir movimentos rotatórios 80-100r.p.m. à lâmina durante 2 minutos.
6.Fazer a leitura com a seguinte interpretação:
Teste positivo: nítida aglutinação
Teste negativo: suspensão homogênea
INTERPRETAÇÃO
Soro com teores de PCR superior a 6mg/L levam à aglutinação do látex, o que é evidenciado pela formação de grumos finos ou grosseiros.
Teste semiquantitativo: 
Rotular 5 tubos (12x75mm) de 1 a 5. Colocar, a partir do tubo 1, 200µL de solução fisiológica (salina). Transferir 200µL de soro para o tubo 1, homogeneizar, transferir para o tubo 2, e assim, sucessivamente, até o tubo 5. Teremos então as diluições que se seguem, com as respectivas equivalências em PCR mg/L:
Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	
	Diluição
	Soro não diluído 
	1:2
	1:4
	1:8
	1:16
	1:32
	
	PCR UI/mL
	 6
	
	12
	24
	48
	96
	192
	
Proceder ao teste como descrito para teste qualitativo. Será considerada positiva a maior diluição da amostra que apresentar aglutinação. Resultado: Expressar o resultado em mg/L.
RESULTADOS
Teste qualitativo: soro com teores de PCR superior a 6mg/L provocam a aglutinação do látex, o que é evidenciado pela formação de grumos finos ou grosseiros. 
Teste semiquantitativo: será considerada positiva a maior diluição da amostra que apresentar aglutinação.
3.3.3 Antiestreptolisina O (ASLO)
PRINCÍPIO
É constituído por uma suspensão de partículas de poliestireno sensibilizadas com Estreptolisina O. Ao se colocar essas partículas em contato com soro que tenha altos níveis de anticorpos antiestreptolisina
O, processa-se a reação antígeno anticorpo, o que é evidenciado pela aglutinação das partículas de látex que formam agregados facilmente visíveis.
TÉCNICA 
Teste qualitativo:
1. Os reagentes e amostras devem ser ambientados antes da realização do teste. A sensibilidade do reagente diminui em temperaturas baixas. 
2. Adicionar ao primeiro círculo da lâmina 25µL de soro, ao segundo 25µL do controle positivo e ao terceiro 25µL do controle negativo. 
3. Homogeneizar o látex e adicionar 25µL do mesmo em cada círculo. 
4. Homogeneizar as duas gotas, com uma haste plástica. Utilizar uma haste para cada teste.
5. Imprimir movimentos rotatórios à placa durante 3 minutos. 
6.Fazer a leitura com a seguinte interpretação: 
Teste positivo: nítida aglutinação 
Teste negativo: suspensão homogênea
INTERPRETAÇÃO
Soros com teores superiores a 200U.I/mL de ASLO provocam aglutinação do látex.
Teste semiquantitativo: Proceder às diluições com solução fisiológica de acordo com a tabela abaixo:
	Diluição do soro
	Soro não diluído 
	1:1,7
	1:2
	1:3
	1:4
	1:5
	1:6
	Concentração (UI/mL)
	200
	340
	400
	600
	800
	1000
	1200
Proceder de maneira idêntica ao teste qualitativo. A última diluição em que se der a aglutinação corresponderá, aproximadamente, ao título de ASLO.
Exemplos de diluição:
1:1,7- Soro : 1,0 volume Ex.: 100µL 
 Solução fisiológica: 0,7 volume Ex.: 70µL 
1:6 - Soro : 1,0 volume Ex.: 100µL 
 Solução fisiológica: 5,0 volumes Ex.: 500µL
INTERPRETAÇÃO 
Soros com teores superiores a 200U.I./mL de ASLO provocam aglutinação do látex.
3.3.4 Coombs direto
PRINCÍPIO
Formação de complexo Antígeno/Anticorpo. O teste de Coombs indireto permite identificar anticorpos para antígenos sanguíneos no soro do paciente, que depois são lavados e se adiciona um anti-soro policlonal contra imunoglobulinas e componentes do complemento. 
TÉCNICA
1º Passo: Preparar uma suspensão salina (5%) das hemácias a serem testadas;
2º Passo: Colocar 2 gotas desta suspensão em 1 tubo de 12X75 mm, adicionar solução fisiológica e centrifugar a 1.000 RPM por 1 minuto;
3º Passo: Desprezar (com cuidado) o sobrenadante deixado o “botão” de hemácias no fundo do tubo;
4º Passo: Repetir a operação mais duas vezes. Na última operação, com auxilio de papel de filtro, procurar desprezar toda a solução salina. Quando se tratar de sangue umbilical, lavar as hemácias no mínimo oito vezes;
5º Passo: Adicionar duas gotas de soro de Coombs;
6º Passo: Centrifugar à baixa rotação (1.000 RPM) por 15 segundos;
7º Passo: Leitura: agitar levemente o tubo e observar se há aglutinação dos eritrócitos.
INTERPRETAÇÃO
Teste de Coombs Direto NEGATIVO: Ausência de aglutinação
Teste de Coombs Direto POSITIVO: Presença de aglutinação (de a+ a++++)
3.3.5 Coombs indireto
PRINCÍPIO
Formação de complexo Antígeno/Anticorpo. O teste de Coombs Indireto permite identificar anticorpos para antígenos sanguíneos no soro do paciente, que depois são lavados e se adiciona um anti-soro policlonal contra imunoglobulinas e componentes do complemento.
TÉCNICA
1º Passo: Preparar solução de hemácias a 5% com sangue (1.9 mL de salina para 100 µL da amostra) O+: Lavar 3 vezes as hemácias com 2,0 mL de solução salina (centrifugar a 3.000 RPM por um minuto), preparar a suspensão com 100µL da papa de hemácias mais 2 mL de solução salina;
2º Passo: Adicionar 100 µL de suspensão de hemácias a 5% mais 100 µL do soro do paciente mais 2 gotas de albumina bovina a 22%;
3º Passo: Incubar em banho-maria a 37ºC por 15 minutos;
INTERPRETAÇÃO
Se aglutinação (+) = teste POSITIVO
Se não aglutinar, continuar o teste:
►Lavar 3 vezes com salina;
►Descartar o sobrenadante;
►Colocar 3 gotas de soro de Coombs:
►Centrifugar por 2 minutos a 1.500 RPM;
►Aglitinação (+) – Teste Positivo.
3.4 Hemaglutinação passiva: 
Proteínas podem ser adsorvidas a hemácias tratadas com ácido tânico e podem ser aglutinadas por Ac específicos. Geralmente é utilizado hemácias de carneiro ou humanas do grupo O. O teste considerado positivo: verifica formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V” (título será a máxima diluição em que se observa a formação de tapete). Enquanto que o teste será considerado negativo quando hemácias sedimentam formando “botão” compacto. 
Ex.: Pesquisa de Ac para Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum (sífilis), Toxoplasma gondii.
3.4.1 Teste de Chagas
PRINCÍPIO
A hemaglutinação indireta baseia-se na propriedade que têm os anticorpos (que neste caso são anti-T. cruzi) de produzir aglutinação específica na presença de glóbulos vermelhos sensibilizados com antígenos citoplasmáticos e de membrana do Trypanosoma cruzi. Chagatest HAI screening A-V utiliza glóbulos vermelhos de ave, que aceleram a visualização da reação por ser de maior tamanho que os de carneiro. Os anticorpos interferentes, que podem causar aglutinação inespecífica, eliminam-se com a adição da solução proteica que possui inibidores destes anticorpos
PROCEDIMENTO
PROVA QUALITATIVA 
1- Em um tubo de hemólise colocar 400 µl de Diluente de Soros HAI A-V e adicionar 10 µl de soro ou controles (diluição 1/40).
 2- Colocar 50 µl da diluição 1/40 do soro ou controles em uma cavidade da microplaca e adicionar 25 µl de Antígeno HAI A-V.
3- Misturar aplicando batidas suaves nas laterais da microplaca durante 30 segundos como mínimo. 
4- Deixar em repouso, ao abrigo de vibrações durante 60 minutos a temperatura ambiente. 
5- Ler a partir de 60 minutos. Pode-se aumentar a nitidez da apreciação, lendo sobre um espelho, iluminando a placa desde acima e interpondo um papel branco translúcido entre a microplaca e a fonte de luz.
PROVA QUANTITATIVA 
1- Em uma mesma série de 6 cavidades colocar 50 µl de Diluente de Soros HAI A-V nas cavidades 2, 3, 4, 5 e 6. 
2- Pipetar 50 µl da diluição 1/40 de soro ou controles nas cavidades 1 e 2. 
3- Transferir 50 µl desde a cavidade 2 a 3 e assim sucessivamente, descartando 50 µl da última cavidade, evitando a formação de bolhas. 
4- Homogeneizar o Antígeno HAI A-V por inversão.
5- Adicionar a cada diluição 25 µl de Antígeno HAI A-V. 
6-Agitar a microplaca aplicando batidas suaves nas laterais durante 30 segundos como mínimo. 
7- Deixar em repouso, ao abrigo de vibrações durante 60 minutos. 
8-Ler a partir de 60 minutos. O título do soro será aquele correspondente à maior diluição de soro reativo.
Diluições correspondentes
	Cavidade 
	1
	
	2
	
	3
	
	4
	
	5
	
	6
	Títulos 
	1/40
	
	1/80
	
	1/160
	
	1/320
	
	1/640
	
	1/1280
INTERPRETAÇÃO 
Não Reativo: presença de um sedimento em forma de botão, nítido e de contorno uniforme no fundo da cavidade. 
Reativo Fraco: manto pequeno no fundo da cavidade com botão bastante definido no centro. Fortemente Reativo: formação de um filme ou manto as vezes de contornos irregulares no fundo da cavidade.
3.5 Testes de floculação 
Os testes de floculação baseiam-se em uma suspensão antigênica que contém cardiolipina, colesterol e lecitina. No preparo da suspensão antigênica, a ligação desses componentes ocorre ao acaso e resulta na formação de estruturas arredondadas denominadas micelas.
Os anticorpos não treponêmicos presentes na amostra ligam-se às cardiolipinas1 das micelas. A ligação de anticorpos em várias micelas resulta na floculação, que pode ser observada ao microscópio. Essa ligação é encontrada na forma de flocos ou grumos, grandes ou pequenos, que podem ser visualizados a olho nu em alguns testes e em outros com auxílio de microscópio. 
3.5.1 VDRL
PRINCÍPIO 
Metodologia: Reação de Floculação A combinação de lecitina, colesterol e cardiolipina possui semelhança imunológica com antígenos do Treponema pallidum, consistindo em um antígeno não treponêmico. A interação das reaginas da amostra com este antígeno produz floculação que pode ser detectada ao microscópio óptico.
TÉCNICA 
Teste com soro:
Em uma placa escavada
pipetar:
Amostra : 50 mL 
Reagente: 20 mL
Agitar manualmente com movimentos circulares ou em um agitador por 4 minutos a 180 rpm. Em seguida, examinar no microscópio no aumento 100 X. Além da amostra sem diluição é recomendado um teste com uma diluição de 1:8 com NaCl 0,85% (para todas as amostras), a fim de evitar o efeito prozona. 
Prova semiquantitativa 
	Cavidade n°
	1
	
	2
	3
	4
	5
	6
	Diluição
	1:2
	
	1:4
	1:8
	1:16
	1:32
	1:64
Pipetar em cada cavidade da lâmina escavada 50 mL de NaCl 0,85%. Na cavidade Nº 1, pipetar 50 mL da amostra a ser titulada, homogeneizar. Transferir 50 mL da cavidade Nº 1 para a Nº 2 e assim sucessivamente até a diluição desejada. Desprezar os 50 mL em excesso da última cavidade. 
Em seguida adicionar à cada cavidade, 20 mL do Reagente Nº 1. Agitar manualmente com movimentos circulares ou em um agitador rotativo por 5 minutos a 180 rpm. Examinar ao microscópio no aumento 100 X, logo após a agitação. O título corresponde à maior diluição da amostra em que ocorreu a floculação.
INTERPRETAÇÃO
Positivo - Reativo: Ocorre floculação com formação de grumos de tamanhos variáveis. Suspensão de aspecto heterogêneo. Neste caso, proceder a diluição da amostra e realizar a prova semiquantitativa.
Negativo - Não Reativo: Ausência de floculação, suspensão de aspecto homogêneo.
4 IMUNOENSAIOS ENZIMÁTICOS
4.1 Elisa
São vários os tipos de testes de ELISA. O modelo mais simples é conhecido como ELISA indireto, onde um antígeno que se encontra aderido a um suporte sólido (placa de ELISA) é preparado e, em seguida, colocado sobre os soros que estão sendo testados, em busca de anticorpos contra o antígeno. Caso estejam presentes anticorpos no soro, específicos para o antígeno em questão, haverá a formação da ligação antígeno-anticorpo que, por conseguinte, é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie que está sendo pesquisada, a qual é ligada a peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima recebe o nome de conjugado. Quando adiciona-se o substrato apropriado para a enzima (ou seja, H2O2 dissolvida em uma substância química eu dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada), os locais onde ocorre a reação antígeno-anticorpo, que apresentam uma coloração característica, sendo que esta coloração varia de acordo com o substrato.
Existe também um método denominado ELISA de bloqueio ou competição, onde a presença de anticorpos em determinado soro é observada devido à competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) voltado ao antígeno.
O teste de ELISA é responsável pela detecção de diferentes doenças infecciosas, uma vez que a maioria dos agentes patológicos leva à produção de imunoglobulinas. Também pode ser utilizado no diagnóstico de doenças auto-imunes ou alergias.
Este método de diagnóstico é o de eleição para a detecção do vírus HIV. Estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato. Todavia, os testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos quanto um dos antígenos do HIV, a proteína p24, fato esse que reduziu sensivelmente o período de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.
4.2 Imunofluorescência 
Definida como uma técnica que possibilita a visualização de antígenos nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV).
Após os fluoróforos serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem fótons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior.
Existem dois tipos distintos de imunofluorescência. São elas:
1.Imunofluorescência direta;
2.Imunofluorescência Indireta.
4.2.1 Imunofluorescência Direta
Utiliza-se esta técnica, também conhecida como técnica de camada simples, para detecção de antígenos em amostras clínicas utilizando-se anticorpos marcados com fluorocromos.
As etapas deste procedimento compreendem:
1.Fixação do esfregaço da lâmina;
2.Tratamento com anticorpo marcado;
3.Incubação;
4.Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados;
5.Visualização no microscópio fluorescente.
As indicações desta técnica são: detecção de vírus, parasitas, antígenos de tumor de amostras ou monocamadas de células do paciente. É utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior de um tecido ou compartimento de uma célula.
4.2.2 Imunofluorescência Indireta
Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também conhecida como técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno.
Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes se associam somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe qual o anticorpo pertence.
Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de auto-anticorpos, e na detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.
4.2.3 FTA-ABS
PRINCÍPIO
Teste de imunofluorescência indireta para a determinação de anticorpos contra o Treponema pallidum em soro humano e líquidos biológicos.
A reação Inmunofluor FTA / ABS é um método confirmatório para o diagnóstico de sífilis. Sua alta sensibilidade e especificidade já foram demonstradas e é recomendada como técnica confirmatória, em investigações prévias a técnicas inespecíficas.
TÉCNICA
1.Reconstituir o tampão salina fosfato (PBS) por diluição em 1 litro de água destilada. Conservar o tampão reconstituído entre 2-8° C.
 2. Retirar as lâminas necessárias para trabalhar e deixar durante 15 minutos a temperatura ambiente. 
3. Preparar uma diluição 1/5 dos soros controles e das amostras com o absorvente. Por exemplo: 10 µl de amostra + 40 µl do absorvente. 
4. Cobrir generosamente as áreas reagentes com as respectivas diluições dos controles positivo, negativo e das amostras. 
5.Incubar na câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente. 
6.Lavar com PBS, em duas etapas de lavagem com duração de cinco minutos cada uma. Colocar as lâminas na jarra de Coplin contendo PBS, agitando suavemente durante as etapas de lavagem. 
7. Diluir a anti-gamaglobulina total humana marcada com isotiocianato de fluoresceína no PBS, de acordo o título indicado no frasco (Por exemplo, Título: 1/100 - Colocar 0,01 ml de anti-gamaglobulina em 1 ml de PBS). 
Título: 
1. Secar cuidadosamente as bordas laterais externas da lâmina com papel absorvente, mantendo úmidas as áreas reagentes. 
2.Cobrir cada área reagente com a diluição de anti-gamaglobulina e incubar na câmara úmida 30 minutos à temperatura ambiente. 
3.Repetir os passos 7 e 9. 
4. Colocar o meio de montagem sobre a lâmina e cuidadosamente cobrir a área reagente com a lamínula sem pressionar fortemente
NOTA: Para obter bons resultados, recomenda-se ler imediatamente no microscópio de fluorescência. Se as lâminas forem conservadas, selar suas para prevenir a secagem do meio de montagem e estocar entre 2-8° C ao abrigo da luz.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
Critério de positividade: 
Em caso de soros positivos os treponemas se observam corados com uma típica fluorescência verde maçã.
Critério de negatividade: 
a) Ausência total de fluorescência As espiroquetas podem ser observados em campo escuro com a adição de laranja de acridina sob microscópio de fluorescência. 
b) Coloração muito fraca 
Reação Indeterminada: Existem reações
FTA Abs com resultados indeterminados. Uma reação indeterminada em amostra de um paciente significa que o resultado não pode ser interpretado como positivo nem como negativo. Se for a primeira amostra, deve ser feito um novo teste FTA Abs em uma segunda amostra do paciente. Se a segunda amostra apresentar o mesmo resultado indeterminado, não é possível estabelecer de modo definitivo se o paciente apresenta ou não, prova sorológica de infecção sifilítica. Neste caso sugere-se utilizar uma técnica alternativa (ELISA, MHATP) e realizar um estudo cuidadoso do histórico do paciente e dos sinais físicos, baseando-se no diagnóstico em evidências clínicas.
4.2.4 FAN – Fator Antinuclear
PRINCÍPIO
No exame de anticorpos fluorescente utiliza o método indireto de impregnação de anticorpo fluorescente. O exame é realizado em dois passos de reações básicas. No primeiro passo, o soro humano a ser testado entra em contato com o substrato antigênico. O anticorpo, se presente no soro teste, irá ligar ao antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo. Se o soro a ser testado não contém anticorpo a este antígeno particular, não é formado nenhum complexo e todos os componentes do soro são removidos no passo de lavagem. O segundo passo envolve a adição de um anticorpo anti-humano marcado com fluoresceína aos poços de teste. Se o complexo antígeno-anticorpo específico é formado no passo um, o anticorpo marcado com fluoresceína irá ligar à metade do anticorpo do complexo no passo dois. 
TÉCNICA
A - PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
1.Lâminas e Glicerol: Prontos para o uso.
2.PBS: Dissolver o conteúdo de um pacote em 1 litro de água destilada ou deionizada. Fechar o recipiente para prevenir contaminação ou evaporação.
3.Controles: Prontos para o uso em frascos conta-gotas com 1,0 ml de controle líquido em solução de trabalho.
4.Conjugado: Prontos para o uso em frascos conta-gotas com 12,0 ml do conjugado líquido em solução de trabalho.
B - PROCEDIMENTO
1.Remover as lâminas e os reagentes requeridos do refrigerador e deixe-os atingir a temperatura ambiente (15 a 30 minutos).
2.Remova as lâminas da embalagem apenas antes do uso e rotule.
3.Dilua as amostras com PBS a uma diluição de 1:40 ou prepare uma diluição seriada dupla para a determinação quantitativa, começando com a diluição de 1:40. 
4. É necessário testar 1 Controle Positivo, 1 Controle Negativo e 1 Controle de tampão PBS para cada bateria de lâminas testadas.
5.Cobrir cada poço com amostras diluídas ou controles (~ 10 - 20 µl por poço).
6.Incubar em uma câmara úmida a 23 oC +/- 2 oC por 30 minutos.
7.Enxaguar as lâminas rapidamente com tampão PBS. Não jogar tampão direto nos poços.
8.Enxaguar as lâminas completamente por 7 minutos em um suporte de coloração com PBS. Trocar o tampão e lavar adicionalmente por 8 minutos. Manusear as lâminas levemente. É necessária uma leve agitação do tampão para uma eficiente lavagem da lâmina.
9.Enxugar a cobertura pintada da lâmina com os mata-borrões fornecidos. Não permita que os poços sequem antes da adição do conjugado.
10.Cubra cada poço com uma gota (10 µl) do Conjugado FITC.
11.Incube em câmara úmida a 23 oC +/- 2 oC por 30 minutos. Proteja da luz intensa.
12.Repetir os passos 7 e 8. Enxugar a cobertura pintada da lâmina com os mata-borrões fornecidos. Não permita que os poços sequem antes da adição de glicerol.
13.Colocar uma pequena gota do Glicerol Tamponado em cada poço e cobrir com uma lamínula.
14.Para melhores resultados, as lâminas deverão ser lidas imediatamente em um aumento de 200-500X. Alternativamente, as lâminas podem ser lidas dentro de 24 horas. Porém, deverão ser armazenadas de 2 - 8 oC no escuro, e seladas para prevenir a secagem do fluido de montagem.
C - CRITÉRIO PARA A GRADUAÇÃO DA INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA
	4 +
	 Fluorescência verde maçã bem brilhante.
	3 +
	 Fluorescência verde maçã brilhante.
	2 +
	 Fluorescência verde maçã clara distinguível
	1 +
	 Fluorescência verde maçã opaca, com formato fraco, mas legível.
	0
	 Nenhuma fluorescência ou fluorescência apenas visível.
D - GUIA PARA CARACTERIZAR A FLUORESCÊNCIA.
Homogêneos
Tingimento homogêneo dos núcleos com nenhum tingimento fluorescente aparente do nucléolo.
O anticorpo é direcionado contra a nucleoproteína ou histonas. A região cromossômica também é normalmente fluorescente.
Anti-Centrômero (ACA) 
Núcleos discretamente manchados nas células não mitóticas e manchas associadas aos cromossomos nas células mitóticas. Nas células em metáfase, o ACA irá aparecer como uma série de estrias perpendiculares ao longo do eixo da região cromossômica. Visualizar as células em metáfase de 100-200X, mudar então para a alta energia para confirmar. 
Periférico
Tingimento homogêneo principalmente ao redor da região externa dos núcleos com fraco tingimento no centro dos núcleos. 
Pontilhado 
Tingimento fino ou com aparência granular dos núcleos geralmente sem tingimento fluorescente do nucléolo. A região cromossômica das células mitóticas é normalmente negativa com coloração pontilhada.
Nucleolar 
Tingimento largo, sólido, pintado dentro dos nucléolos com ou sem pintas ocasionais finas. A região cromossômica é normalmente negativa com coloração nucleolar.
Nenhuma fluorescência 
Ausência ou menos que 1 + de fluorescência nos núcleos das células. Os núcleos podem variar na cor de preto esverdeada a preto.
NOTAS:
1.Amostras que apresentam uma reação positiva à 1:40 deverão ser tituladas para determinar o ponto final de reatividade.
2.Em determinações quantitativas, o título de ponto final é a mais alta diluição apresentando uma fluorescência de 1 + nas inclusões.
3.Um número de variações nos padrões de tingimento do substrato nucléico pode ser detectado pelo teste de imunofluorescência ANA. Estas variações são atribuídas aos anticorpos que reagem com diferentes constituintes nucleares. Algumas destas formas observadas são homogêneas, periféricas, pontilhadas e nucleolares. A forma homogênea é característica da nucleoproteína insolúvel do DNA-histona. A forma pontilhada foi atribuída aos antígenos nucleares solúveis. Esta forma pode ser frequentemente eliminada após lavagens extensiva das células antes do uso. O tingimento nucleolar pode ser devido ao tingimento do ácido ribonucléico (RNA) localizado no nucléolo. Pode existir mais de um padrão em soros de um paciente individual e as formas podem mudar com a diluição dos soros dos pacientes. A significância de vários padrões de tingimento não está claramente definida. Um diagnóstico provisório deverá ser baseado em todas as variáveis clínicas e dados laboratoriais ao invés da forma de reatividade.
4.Podem ser encontrados baixos títulos de anticorpos antinucleares em indivíduos normais. O fato de o teste ANA ser um procedimento de pesquisa, uma pequena porcentagem da população normal pode exibir atividade ANA a uma diluição de 1:40. Geralmente, títulos de ANA não significativos estão relacionados à idade e sexo ou associados com doenças não relacionadas ou processos infecciosos.
5.Um ANA negativo geralmente exclui LES ativo.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
	RESULTADOS
	SIGNIFICÂNCIA
	Screening:
	
	Nenhuma fluorescência ou intensidade de fluorescência < 1 + à diluição de 1:40.
	Nenhum anticorpo de ANA detectado.
	> 1+ de fluorescência a 1:40 ou maior em uma única amostra de soro.
	Positivo por IF para ANA. Título para ponto final de reatividade
4.3 Cintometria de Fluxo
É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula.
PRINCÍPIO
Um feixe de luz de um único comprimento de onda é direcionado a um meio líquido em fluxo. Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC)
e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC). Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou juntos a partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada individual partícula. FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula (por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos citoplasmáticos e rugosidade da membrana).
Parâmetros medidos
Os parâmetros possíveis de medir são: volume e complexidade morfológica das células, pigmentos celulares como clorofila, DNA (análise de tipo de células, cinética celular, proliferação, etc.), RNA, análise e classificação de cromossomos, proteínas, antígenos à superfície celular (marcadores CD), antígenos intracelulares (várias citocinas, mediadores secundários, etc.), antígenos nucleares, atividade enzimática, pH, cálcio ionizado intracelular, magnésio, potencial membranar, fluidez membranar, apoptose (quantificação, medidas da degradação do DNA, potencial da membrana mitocondrial, alterações na permeabilidade, atividade da caspase), viabilidade celular, monitorização da eletropermeabilização das células, caracterização da multi resistência a fármacos em células tumorais, glutationa, várias combinações (DNA/antígenos de superfície, etc.). Esta lista é muito longa e está em constante expansão.
4.4 Radioimunoensaio (RIA – Radio Imuno Assay)
Baseia-se na competição de um antígeno presente na amostra em análise com um antígeno marcado com isótopo radioativo pelo mesmo anticorpo. A concentração do antígeno em análise será inversamente proporcional à radiação emitida. Trata-se de uma técnica com alta especificidade e sensibilidade, porém com elevado custo e grande risco operacional por manipular material radioativo.
4.5 Western Blotting
O Western blot é uma técnica utilizada na biologia molecular e na bioquímica para detectar proteínas em um homogenato ou em um extrato de tecido biológico.
Primeiramente, a técnica consiste em uma eletroforese unidimensional que separa as proteínas da amostra, de acordo com a massa molecular. Ao final, ocorre a transferência para uma membrana, sob aplicação de um campo elétrico em tampão básico, onde as proteínas se ligam à membrana por meio de interações hidrofóbicas.
As membranas mais utilizadas são as de nitrocelulose (menor custo) e PVDF (mais sensível e com maior capacidade de ligação com as proteínas e tempo de retenção destas), que sofrem bloqueio para inibição de ligação inespecífica entre os anticorpos a serem utilizados. Em seguida, adiciona-se o anticorpo primário seguido do anticorpo secundário complexado com uma enzima reveladora.
Quando há transferência de um extrato proteico para uma membrana de nitrocelulose, denomina-se Western blot. Entretanto, quando após a transferência das proteínas ocorre a sua identificação por meio de anticorpos, denomina-se Immunoblot. 
O immunoblotting limita-se a uma análise semi-quantitativa (eventualmente quantitativa) da proteína, pois não permite estimar a funcionalidade desta última.
Os principais tipos de detecção do sinal do western blotting após a adição do anticorpo primário são: colorimétrica, quimioluminescente, radioativa e fluorescente.
4.5.1 HIV Westrn Blotting
PRINCÍPIO
Usado como teste complementar mais específico para amostras de soro ou plasma humanos que apresentaram resultados repetidamente reativos pelo teste de ELISA. Antígenos virais específicos do HIV-1 separados e incorporados em fitas por procedimentos eletroforéticos seguidos de eletrotransferência, combinados na mesma fita com um peptídeo sintético específico do HIV-2, permitem observar melhor as respostas mediadas por anticorpos para proteínas virais específicas. Cada fita inclui também um controle interno de adição de amostra para minimizar o risco de falso-negativos provocados por erros operacionais e para assegurar a adição de amostras.
TÉCNICAS
1. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEM DILUÍDA a cada poço. 
2. Usando pinça, retire cuidadosamente o número necessário de FITAS do tubo e coloque-as em cada poço com a face numerada voltada para cima. Inclua fitas para controles Reativo Forte, Reativo Fraco e Não Reativo. 
3. Incube as fitas durante 1 e 2 minutos à temperatura ambiente (25±3°C) sobre uma plataforma oscilante (velocidade de 12 a 16 ciclos por minuto). Remova a solução-tampão por aspiração. (Nota: Não permita que as tiras sequem a falha pode resultar em marcas aquosas em tiras desenvolvidas para alguns espécimes.) 
4. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃO PARA BLOTTING a cada poço. 
5. Adicione 20 µl de cada soro de paciente ou de controle nos poços apropriados. Deve-se ter cuidado para ter a certeza que as amostras não são adicionadas diretamente sobre as fitas. 
6. Cubra a bandeja com a tampa fornecida e incube durante 1 hora à temperatura ambiente (25±3°C) na plataforma oscilante. 
7. Retire cuidadosamente a tampa, evitando respingos ou misturar as amostras. Incline a bandeja para aspirar a mistura dos poços. Troque as ponteiras de aspiração entre as aplicações de amostras para evitar contaminação cruzada.
8. Lave cada fita 3 vezes com 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEM DILUÍDA e deixe-as imersas durante 5 minutos sobre a plataforma oscilante entre cada lavagem. 
9. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO DE CONJUGADO DE TRABALHO a cada poço. 
10. Cubra a bandeja e incube durante 1 hora à temperatura ambiente (25±3°C) na plataforma oscilante. 
11. Aspire o CONJUGADO dos poços. Lave como na etapa 8. 
12. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO DE SUBSTRATO em cada poço. 
13. Cubra a bandeja e incube-a durante 15 minutos na plataforma oscilante. (Nota: A reação pode ser parada antes de 15 minutos se todas as faixas forem visíveis.) 
14. Aspire o SUBSTRATO e enxágue as fitas pelo menos três vezes com água de grau reagente para interromper a reação (a lavagem insuficiente nesta etapa poderá provocar o desenvolvimento de um fundo escuro). 
15. Usando pinça, retire cuidadosamente as fitas e coloque-as sobre toalhas de papel. Cubra com toalhas de papel e seque. Alternativamente, deixe as fitas secarem nos poços da bandeja. 
16. Monte as fitas sobre folha de papel branco não absorvente. Não aplique fita adesiva sobre as bandas reveladas. Observe as bandas (ver Interpretação de Resultados) e interprete os resultados. Para armazenamento, conserve as fitas em local escuro.
INTERPRETAÇÃO
NOTA: As fitas reveladas devem estar completamente secas para evitar erros de interpretação. 
A presença ou ausência de anticorpos contra o HIV-1 na amostra é determinada pela comparação de cada fita de nitrocelulose sob teste com as fitas de controle analisadas com os controles NÃO REATIVO, REATIVO FORTE e REATIVO FRACO. 
A Figura 1 é apresentada como uma ajuda para a identificação das várias bandas reveladas na fita que reagiu com o Controle REATIVO FORTE.
5 SOROLOGIAS
São exames laboratoriais para comprovar a presença de anticorpos no sangue, ou seja, determinar concretamente sua presença. É justamente através da extração de sangue no paciente que, em seguida, sua mostra é analisada para determinar de maneira eficiente a presença ou não de bactérias no organismo. 
O procedimento pode ser feito totalmente pelo sangue ou então pelo soro sanguíneo. Enquanto isso, neste último caso, o sangue é obtido após sua coagulação e centrifugação para eliminar as células de reação.
Este exame é fundamental para saber o modo como o organismo de um paciente pode reagir diante de uma infecção ou se há algum agente patogênico. Caso seja comprovada uma infecção, os agentes patogênicos estimulam a geração de anticorpos
e após o exame de sangue poderá ser identificado esses agentes.
5.1 Hepatites
Marcadores sorológicos – na hepatite aguda deve-se avaliar a faixa etária do paciente, a história pregressa de hepatites virais ou icterícia e a presença de fatores de risco, como o uso de drogas injetáveis, prática sexual não segura, contato com pacientes portadores de hepatite. Estas informações auxiliarão na investigação. Contudo, deve-se lembrar que não é possível determinar a etiologia de uma hepatite aguda apenas com base em dados clínicos e epidemiológicos (exceto em surtos de hepatite aguda pelo vírus A, que tenham vínculo epidemiológico com um caso confirmado laboratorialmente). Respeitando-se as ressalvas já feitas, recomenda-se em caso de suspeita de hepatite aguda a pesquisa inicial dos marcadores sorológicos: anti-HAV IgM, HBsAg, anti-HBc (total) e anti-HCV* (caso haja justificativa com base na história clínica). A necessidade da pesquisa de marcadores adicionais poderia ser orientada pelos resultados iniciais. Faz parte das boas práticas do laboratório manter acondicionados os espécimes já examinados por, pelo menos, duas semanas após a emissão do laudo, tempo necessário para elucidar eventuais dúvidas ou complementar algum exame referente à amostra.
5.1.1 Hepatite A 
5.1.2 Anti-HAV IgM – a presença deste marcador é compatível com infecção recente pelo HAV, confirmando o diagnóstico de hepatite aguda A. Este marcador surge precocemente na fase aguda da doença, começa a declinar após a segunda semana e desaparece após 3 meses. 
5.1.3 Anti-HAV IgG – os anticorpos desta classe não permitem identificar se a infecção é aguda ou trata-se de infecção pregressa. Este marcador está presente na fase de convalescença e persiste indefinidamente. É um importante marcador epidemiológico por demonstrar a circulação do vírus em determinada população.
5.1.4 Hepatite B 
São marcadores de triagem para a hepatite B: HBsAg e anti-HBc. 
5.1.5 HBsAg (antígeno de superfície do HBV) – denominado como antígeno Austrália. É o primeiro marcador a surgir após a infecção pelo HBV, em torno de 30 a 45 dias, podendo permanecer detectável por até 120 dias. Está presente nas infecções agudas e crônicas. 
PRINCÍPIO
HBsAg é um ensaio imunoenzimático em fase sólida com base no princípio “sanduíche” para a detecção do HBsAg no soro ou plasma humano. A microplaca é revestida com anticorpos monoclonais específicos para vários subtipos do HBsAg. Durante o teste, amostra e conjugado são adicionadas à microplaca revestida com anticorpo e então incubadas. Se a amostra contiver HBsAg, este se ligará aos anticorpos que revestem a microplaca e, simultaneamente, se ligarão ao conjugado para formar complexos Anticorpo-HBsAg-Conjugado. Após a incubação a microplaca é lavada para remoção dos materiais não ligados. Após esta etapa, os Substratos A e B são adicionados e incubados, produzindo uma cor azul que indica a quantidade de antígeno de Hepatite B presentes nas amostras. A Solução de Parada é adicionada para interromper a reação, havendo uma mudança de cor para amarelo, medida em um leitor de microplacas.
TÉCNICA 
Deve-se colocar todos os Reagentes, Amostras e Controles para estabilizarem em temperatura ambiente (15 - 30ºC) por no mínimo 40 minutos. Retornar as tiras da microplaca que não serão utilizadas para a embalagem original selada. 
1º Separar as microcavidades a serem utilizadas considerando: Controles e Amostras (Podendo ser testados em duplicata). 
2º Separar a primeira cavidade para o Branco (OPCIONAL). 
3º Pipetar 50 µL de Controle Negativo, Controle Positivo e Amostras nas cavidades previamente determinadas. 
4º Pipetar 50 µL de Conjugado em todas as cavidades exceto na cavidade do Branco (Se tiver feito a opção de usar). 
5º Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir as cavidades com o selador de placa. 
6º Incubar por 80 minutos ± 2 minutos a 37°C ± 2°C. 
7º Retirar o selador de placa das cavidades. 
8º Descartar o conteúdo das cavidades por aspiração (Lavadora) ou por decantação (manual); Usar 350 L aproximadamente de Solução de Lavagem, previamente preparada*, para um total de oito (8) ciclos de lavagem. Ou Usar 500 L aproximadamente de Solução de Lavagem, previamente preparada*, para um total de seis (6) ciclos de lavagem. Para a garantia da secagem da placa, ao final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente. Nota: Lavagem/ secagem deficiente pode causar resultados inadequados. 
9º ATENÇÃO Siga um dos seguintes procedimentos: A) Pipetar 100 µL de Substrato previamente preparado* - Solução de Trabalho (A + B) em todas as cavidades. Ou B) Pipetar 50 µL de Substrato A em todas as cavidades. Pipetar 50 µL de Substrato B em todas as cavidades. 
10º Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir as cavidades com selador de placa. 11- Incubar por 30 minutos ± 1 minuto em temperatura ambiente (15 - 30ºC) ao abrigo da luz. 
12º Retirar o selador de placa das cavidades. 
13º Pipetar 100 µL de Solução de Parada em todas as cavidades. 
14º Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. 
15º Ler a 450 nm (filtro primário) / 630nm (filtro secundário) até 30 minutos (no máximo).
RESULTADOS:
Negativo < 0,9 
Positivo > 1,1 
Indeterminado 0,9 - 1,1 
5.1.6 Anti-HBc (anticorpos IgG contra o antígeno do núcleo do HBV) – é um marcador que indica contato prévio com o vírus. Permanece detectável por toda a vida nos indivíduos que tiveram a infecção (mesmo naqueles que eliminaram o vírus). Representa importante marcador para estudos epidemiológicos.
5.1.7 Anti-HBc IgM (anticorpos da classe IgM contra o antígeno do núcleo do HBV) – é um marcador de infecção recente, portanto confirma o diagnóstico de hepatite B aguda. Pode persistir por até 6 meses após o início da infecção. 
5.1.8 Anti-HBs (anticorpos contra o antígeno de superfície do HBV) – indica imunidade contra o HBV. É detectado geralmente entre 1 a 10 semanas após o desaparecimento do HBsAg e indica bom prognóstico. É encontrado isoladamente em pacientes vacinados.
5.1.9 Teste Anti HBs
PRINCÍPIO
É um ensaio imunoenzimático quantitativo em fase sólida baseado no princípio “sanduíche” para a detecção de anticorpos AntiHBs incluindo anticorpos IgG, IgM e IgA em soro ou plasma humano. A microplaca é revestida com HBsAg recombinante. Durante o teste, amostra e conjugado são adicionados à microplaca revestida com antígeno e então incubados. Se a amostra contiver anticorpos Anti-HBs, este se ligará ao antígeno que reveste a microplaca, e simultaneamente se ligarão ao conjugado para formar complexos Antígeno-Anti HBS-Conjugado. Após a incubação, a microplaca é lavada para remover os materiais não ligados. Após esta etapa, os Substratos A e B são adicionados e, em seguida, incubados produzindo uma cor azul, que indica a quantidade de anticorpos Anti-HBs presente na amostra. Uma Solução de Parada é adicionada para interromper a reação havendo uma mudança de cor para amarelo, medida com um leitor de microplacas.
TÉCNICA 
Antes de iniciar o ensaio, colocar todos os Reagentes, Amostras e Padrões Referência para estabilizarem em temperatura ambiente (15 - 30ºC) por no mínimo 40 minutos. Retornar as tiras da microplaca que não serão utilizadas para a embalagem original selada. 
1º Separar as cavidades a serem utilizadas considerando: Padrões Referência e Amostras (podendo ser testados em duplicata). 
2º Separar a primeira cavidade para o Branco. 
3º Pipetar 50 µL dos Padrões Referência (A - E) e Amostras nas cavidades determinadas. 
4º Pipetar 50 L de Conjugado em todas as cavidades exceto na cavidade Branco (caso tenha feito a opção de usar o Branco). 
5º Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir as cavidades com o selador de placa. 
6º Incubar por 60 minutos ± 2 minutos em uma incubadora a 37ºC ± 2ºC. 
7º Retirar o selador de placa das cavidades. 
8º Descartar o conteúdo das cavidades por aspiração (Lavadora) ou por decantação (manual). Usar 350 L aproximadamente de Solução de Lavagem, previamente
preparada*, para um total de oito (8) ciclos de lavagem. Ou Usar 500 L aproximadamente de Solução de Lavagem, previamente preparada*, para um total de seis (6) ciclos de lavagem. Para garantia da secagem da placa, ao final da lavagem, bater a placa por alguns segundos em papel absorvente. Nota: Lavagem/secagem deficiente pode causar resultados inadequados. 
9º ATENÇÃO Siga um dos seguintes procedimentos: A) Pipetar 100 µL de Substrato previamente preparado* - Solução de Trabalho (A + B) em todas as cavidades. *Vide PREPARO DOS REAGENTES DE TRABALHO Ou B) Pipetar 50 µL de Substrato A em todas cavidades. Pipetar 50 µL de Substrato B em todas cavidades. 
10º Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. Cobrir com selador de placa. 
11º Incubar por 30 minutos ± 1 minuto em temperatura ambiente (15 - 30ºC) ao abrigo da luz. 12º Pipetar 100 µL de Solução de Parada em todas as cavidades. 
13º Homogeneizar gentilmente durante ± 30 segundos. 
14º Ler: 450 nm (filtro primário) / 630 nm (filtro secundário) em até 30 minutos (no máximo).
INTERPRETAÇÃO
Não Reativo: Amostras com concentração menor que 10 mUI/mL, são consideradas negativas para Anti-HBs. 
Reativo: As amostras com concentração superior a 10 mUI/mL são consideradas positivas para Anti-HBs.
5.1.10 HBeAg (antígeno “e” do HBV) – é indicativo de replicação viral e, portanto, de alta infectividade. Está presente na fase aguda, surge após o aparecimento do HBsAg e pode permanecer por até 10 semanas. Na hepatite crônica pelo HBV, a presença do HBeAg indica replicação viral e atividade da doença (maior probabilidade de evolução para cirrose). 
5.1.11 Anti-HBe (anticorpo contra o antígeno “e” do HBV) – marcador de bom prognóstico na hepatite aguda pelo HBV. A soroconversão HBeAg para anti-HBe indica alta probabilidade de resolução da infecção nos casos agudos (ou seja, provavelmente o indivíduo não vai se tornar um portador crônico do vírus). Na hepatite crônica pelo HBV a presença do anti-HBe, de modo geral, indica ausência de replicação do vírus, ou seja, menor atividade da doença e, com isso, menor chance de desenvolvimento de cirrose.
5.1.12 Hepatite C 
5.1.13 Anti-HCV (anticorpos contra o vírus HCV) – Marcador de triagem para a hepatite C. Indica contato prévio com o vírus, mas não define se a infecção é aguda, crônica ou se já foi curada. O diagnóstico de infecção aguda só pode ser feito com a viragem sorológica documentada, isto é, paciente inicialmente anti-HCV negativo que converte, tornando-se anti-HCV positivo e HCV-RNA positivo, detectado por técnica de biologia molecular. A infecção crônica deve ser confirmada pela pesquisa de HCV-RNA. 
5.1.14 HCV-RNA (RNA do HCV) – é o primeiro marcador a aparecer entre uma a duas semanas após a infecção. É utilizado para confirmar a infecção em casos crônicos, monitorar a resposta ao tratamento e confirmar resultados sorológicos indeterminados, em especial em pacientes imunossuprimidos.
5.2 Alergias
5.2.1 Teste prick ou de puntura
O antebraço do paciente é limpo com álcool e são pingadas uma ou duas gotas dos alérgenos a serem testados.
Depois, é feita uma picada leve (puntura) no local de cada gota.
Se houver reação positiva (vermelhidão, inchaço) na área de alguma daquelas gotas, diz-se que a pessoa é alérgica àquela substância.
Esse teste é aplicado na suspeita de alergia alimentar ou inalatória.
É um teste seguro, rápido e não causa dor.
5.2.2 Teste de contato
Os alérgenos testados são colocados em pequenas câmaras já coladas em uma fita micropore. 
Essas fitas têm espaço para até 10 alérgenos — e elas são coladas nas costas do paciente por 48 horas.
Após esse tempo, as fitas são retiradas. O médico pode pedir que a pessoa passe mais 24 horas sem se expor ao sol.
Esse teste é utilizado para verificar a alergia a qualquer substância e pode causar reações intensas — que precisam de tratamento médico adequado.
5.2.3 Teste Intradérmico
Com o auxílio de uma seringa de agulha fina, uma amostra do alérgeno é injetada sob a pele. A reação pode ser verificada em poucos minutos ou em até 24 horas.
O teste intradérmico pode detectar reações alérgicas alimentares, inalatórias ou medicamentosas.
É um teste bem sensível e que também pode ser utilizado para saber se o paciente já recebeu determinadas vacinas.
Por ter o alérgeno injetado na pele, esse teste pode causar reações intensas.
5.2.4 Exame de sangue
Coleta-se uma amostra de sangue para procurar anticorpos para o alérgeno. Se não houver certeza de qual substância é o alérgeno, então, é necessário realizar o exame para várias delas.
Esse teste é usado nos casos em que a pessoa já apresentou uma reação severa anteriormente ou quando todos os outros exames não apresentaram resultados conclusivos.
Tem um custo maior que os demais, mas não apresenta riscos para o paciente.
As crises alérgicas tendem a ser mais fortes a cada vez que a pessoa entra em contato com o que provoca essa reação. Elas podem ser leves, muito graves e até colocar a vida do paciente em risco.
A automedicação pode agravar ou mascarar casos de alergia. Por isso, procure sempre o médico. Somente um especialista pode indicar o teste de alergia e o tratamento necessários.
6 IMUNOCROMATOGRAFIA
São testes de triagem, portanto de elevada sensibilidade, e consequentemente elevado custo.
O método é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte.
6.1 HCV
PRINCÍPIO 
Teste imunocromatográfico que contém conjugado ouro coloidal que se liga aos anticorpos anti HCV presente na amostra e forma um complexo que irá migrar através da membrana por ação da capilaridade em direção aos antígenos do HCV (Core, NS3, NS4 e NS5) imobilizados na região teste (T), ao se ligar ocorre o aparecimento de banda que determina reação positiva. Na ausência de anti HCV não haverá o aparecimento da banda. O complexo continua a migrar até atingir a região de controle (C). O conjugado não ligado ao antígeno se liga na região C produzindo uma banda colorida indicando que o teste está funcionando como planejado e que o resultado é válido.
TÉCNICA
1- A amostra deve estar em temperatura ambiente antes de iniciar o teste. 
2- Retirar o cassete da embalagem protetora, colocá-la sobre uma superfície limpa e nivelada e identificá-la de forma adequada. 
3- Transferir 10 µL de amostra dentro do poço de amostra. 
4- Segurar o frasco verticalmente e aplicar 2 gotas (100 µL) de Diluente no poço da amostra.
5- Aguardar a formação das linhas após o repouso de 15 minutos. Interpretar os resultados entre 15 e 20 minutos. 
6- Não interpretar o resultado após 20 minutos.
INTERPRETAÇÃO
Teste positivo: Formação de duas linhas nas regiões controle (C) e teste (T) após 15 minutos. Não interpretar após 20 minutos.
Teste negativo: Formação de uma linha na região controle (C) e ausência completa de linha na região teste (T) após 15 minutos. Não interpretar após 20 minutos.
Resultado inválido: Ausência completa de linha na região controle (C) com ou sem linha na região teste (T). Testar a amostra novamente.
6.2 Sífilis 
PRINCÍPIO 
É um ensaio imunocromatográfico (teste rápido) para a detecção qualitativa de anticorpos totais (IgG, IgM e IgA) anti-T. pallidum em amostras de soro, plasma ou sangue total. Neste kit, antígenos recombinantes de T. pallidum estão imobilizados na região da linha teste. Quando uma amostra é adicionada, esta reage com partículas coradas conjugadas a antígenos de T. pallidum. Este complexo migra ao longo da tira teste e interage com os antígenos imobilizados. Se a amostra apresentar anticorpos anti-T. pallidum, uma banda colorida irá aparecer na região teste indicando um resultado positivo. Se a amostra
não apresentar anticorpos anti-T. pallidum, essa banda não irá aparecer indicando um resultado negativo.
TÉCNICA
1- A amostra deve estar em temperatura ambiente antes de iniciar o teste. 
2- Retirar o cassete da embalagem protetora, colocá-la sobre uma superfície limpa e nivelada e identificá-la de forma adequada. 
3- Para Soro, Plasma ou Sangue Total: Transferir 10 µL de soro, plasma ou sangue total para dentro do poço de amostra. Segurar o frasco verticalmente e aplicar 2 gotas (70 µL) de Diluente no poço da amostra. 
4- Aguardar a formação das linhas. Interpretar os resultados entre 15 e 30 minutos. Não interpretar após 30 minutos.
INTERPRETAÇÃO
Teste positivo: Formação de duas linhas nas regiões controle (C) e teste (T) após 15 minutos. Não interpretar após 30 minutos.
Teste negativo: Formação de uma linha na região controle (C) e ausência completa de linha na região teste (T) após 15 minutos. Não interpretar após 30 minutos.
Resultado inválido: Ausência completa de linha na região controle (C) com ou sem linha na região teste (T). Testar a amostra novamente.
6.3 HIV 3ª Geração
PRINCÍPIO 
É capaz de detectar anticorpos totais (IgM, IgG, IgA e IgE) para HIV 1, incluindo subtipo O, e HIV 2. Os antígenos recombinantes HIV 1 e HIV 2 reagem com anticorpos presentes em amostras de soro, plasma e sangue total. As amostras se movem através de uma membrana cromatográfica por ação capilar. Amostras reagentes para HIV 1 irão formar uma linha de cor vermelha na região onde antígeno recombinante HIV 1 está imobilizado. Amostras reagentes para HIV 2 formarão uma segunda linha vermelha na região correspondente ao antígeno HIV 2 imobilizado. As amostras continuam sendo absorvidas pela membrana até a região controle, com a formação de outra linha vermelha, confirmando o processamento correto do teste.
TÉCNICA 
1- A amostra deve estar em temperatura ambiente antes de iniciar o teste. 
2- Retirar o cassete da embalagem protetora, colocá-la sobre uma superfície limpa e nivelada e identificá-la de forma adequada. 
3- Para Soro, Plasma ou Sangue Total: Transferir 10 μL de soro, plasma ou sangue total no poço A. 
4- Segurar o frasco de Diluente (Reagente Nº 2) verticalmente e aplicar 2 gotas (70 µL) de Diluente no poço B. 
5- Aguardar a formação das linhas. Interpretar os resultados entre 15 e 30 minutos. Não interpretar após 30 minutos.
INTERPRETAÇÃO
Teste Reagente: Formação de linha controle e mais uma ou duas linhas vermelhas após 15 minutos na região de teste. Não interpretar após 30 minutos. 
HIV 1 Reagente: Além da linha vermelha na região do Controle (C), forma-se outra linha na região de Teste 1 (T1). 
HIV 2 Reagente: Além da linha vermelha na região do Controle (C), forma-se outra linha na região de Teste 2 (T2). 
HIV 1 e 2 Reagentes: Além da linha vermelha na região do Controle (C), formam-se duas outras linhas nas regiões de Teste 1 e 2 (T1 e T2). Se a intensidade da cor da linha T1 for maior que a linha T2 pode-se considerar o resultado como HIV-1 reagente. Se a intensidade da cor da linha T2 for maior que a linha T1 pode-se considerar o resultado como HIV-2 reagente. 
Teste Não Reagente: Formação de apenas uma linha vermelha, após 15 minutos, na região do Controle. Não interpretar após 30 minutos. 
Teste Inválido: A ausência de formação de linha na região do Controle (C), indica erro no procedimento ou deterioração do cassete. Neste caso, repetir o teste utilizando novo cassete.
6.4 HCG 
PRINCÍPIO 
O método utiliza anticorpo monoclonal anti ßhCG, que reage com amostras de soro e urina. A mistura se move através de uma membrana cromatográfica por ação capilar. As amostras com concentrações superiores a 25 mUI/mL de ßhCG irão formar uma linha de cor vermelha na região onde o anti ßhCG está imobilizado, indicando que a amostra está positiva. A mistura reagente continuará sendo absorvida pela membrana até a região do anticorpo controle, com a formação de outra linha vermelha, confirmando o processamento correto do teste.
TÉCNICA 
1- A amostra deve estar em temperatura entre 15 e 30°C antes de iniciar o teste. 
2- Retirar a tira reativa da embalagem protetora e identificá-la de forma adequada. 
3- Colocar a ponta absorvente da tira reativa em contato com a amostra (soro ou urina) por 10 segundos. Não mergulhar a fita na amostra além das setas indicadoras do nível de amostra. Como alternativa à imersão da tira reativa na amostra pode-se pipetar 100 µL da amostra (soro ou urina) e dispensar sobre a ponta absorvente da tira reativa. 
4- Aguardar a formação das linhas. Os resultados devem ser observados após 5 minutos de reação. Não interpretar após 10 minutos.
RESULTADOS 
Teste Positivo: formação de duas linhas vermelhas nos primeiros 5 minutos, indicando concentração de ßhCG igual ou superior a 25 mUI/mL.
Teste Negativo: formação de uma linha vermelha, indicando teste negativo ou concentração de ßhCG menor que 25 mUI/mL.
Teste Inadequado: ausência de formação de linha indica erro no procedimento ou deterioração da tira reativa. Neste caso, repetir o teste utilizando nova tira reativa.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
FERREIRA, A.W. e MORAES, S.L.; Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes, 3ª edição
CANÇADO, J. Romeu; GALIZZI, João; GRECO, J. B.; LIMA, A. Oliveira e SOARES, J. Benjamin, Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica Técnica e Interpretação. 8ª Ed. Guanabara Koogan,2017 
AVELLEIRA J.C.R.; BOTTINO, G. Diagnóstico, tratamento e controle da sífilis. An. Bras. Dermatol. 2006; 81(2):111-26. 
 
JOKLIK W., Willett H. e Amos D., ZINSSER MICROBIOLOGÍA 17º edição, Editorial Médica Panamericana, 1983. 
PODESTÁ, D.; SVETAZ, M.J.; RICOMI, R.; CAPRIOTTI, G.; ROJKÍN, L.; LORENZO, L.; "Evaluación de tres reactivos para detección de sífilis" - VIII Congreso Argentino de Bioquímica, 54º Triduo Bioquímico Científico Anual 1990 - Revista A.B.A. 54/3, 1990.
https://www.google.com.br/search?ei=RoAIW7aeNoyOwgTP87L4BQ&q=reagentes+imunologia+doles+bula&oq=reagentes+imunologia+doles+bula&gs_l=psy-
Acesso em: 19/05/2018
 
DEACON WE, FREENAN EH, HARRIS A. Fluorescent Treponemal antibody test. Modification based on quantitation (FTA-200) Proc. Soc. Expl. Biol. E Med. 103:827-829, 1960.
 
TAN, EM. 1984. In Advances in Immunology: Autoantibodies to Nuclear Antigens (ANA): Their immunology and Medicine, HG kunkel and FJ Dixon (eds.), academic Press Inc., NY, pp. 167-240.
RITCHIE, RF. 1967. The clinical significance of titered antinuclear antibodies. Arth. Rheum., 10:544-552.
WELLER, TH, AND AH COONS. 1954. Fluorescent Antibody Studies with Agents of Varicella and Herpes Zoster Propagated In Vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 86:789-794.
CDC/NIH Manual. 1988. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 2nd Ed. pp 12-16.
NCCLS Doc H3-A2. 1984. Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture, 2nd Edition: Approved Standard. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Villanova, PA.
LEE, SL, et al. 1966. Activation of systemic lupus erythematosus by drugs. Arth. Int. Med., 117:620-626.
 
CONDEMI, JJ, et al. 1967. Antinuclear antibodies following hydralazine toxicity. New Engl. J. Med., 276;486-491.
CONDOMI, JJ et al. 1967. Antinuclear antibodies following hydralazine toxicity. New Engl. J. Med.,276:486-491.
MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R.; SOARES, C. O. Imunodiagnóstico em Medicina Veterinária, Embrapa Gado de Corte:Campo Grande, 360 p., 2001.
BRUN-VEZINET, F.; CLAVEL,F.e GUETARD, D., , et al. 1986 Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science; 233:343-346, 
R.S. TEDDER, A. HUGHES, T. CORRAH et al 1988. Envelope cross-reactivity in Western Blot for HIV-1 and HIV-2 may not indicate dual infection. Lancet 11:927-930, 
https://www.bioclin.com.br/sitebioclin/wordpress/wp-ontent/uploads/arquivos/instrucoes
Acesso em: 27/05/2018